張云亮，朵慧，張陽陽，栗金富，徐麗萍*，竇博鑫*

1.哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院（哈爾濱 150076）；2.蘭州蘭生血液制品有限公司（蘭州 730030）

由于人口增加與采用富含蛋白質的飲食，眾多國家蛋白質消耗量增加，且隨著人類生活水平的不斷提高，這種影響可能會加劇，因此篩選對環(huán)境友好的新型蛋白質來源非常重要。微藻是一種廣泛存在于陸地與海洋中的植物，其胞體內具有眾多不飽和脂肪酸、功能性蛋白質、多糖等對人體有益的物質[1-4]，且具有環(huán)境適應力強、培養(yǎng)周期短、培養(yǎng)占地面積小等眾多優(yōu)點[5-6]，但由于微藻加工成本及耗能高等一系列瓶頸問題的存在，微藻蛋白質至今難以實現(xiàn)工業(yè)大規(guī)模生產。

微藻細胞壁對生物活性物質的提取具有極大的影響[7-8]，大部分微藻細胞的細胞壁結構復雜，諸如小球藻和柵藻有兩層細胞壁，紅球藻有三層細胞壁，萊茵衣藻有五層細胞壁[7,9]。因此，為提高微藻細胞蛋白質的提取率，必須利用機械或非機械破碎的方法對微藻的細胞壁進行破碎處理，且選擇合適的破碎技術與破碎力度對于提取微藻蛋白質具有決定性的作用。綜述主要探討了傳統(tǒng)細胞破碎方法中的珠磨法、超聲處理法、生物酶解法與新興細胞破碎方法動態(tài)高壓微射流處理法、超臨界流體空化法、多針-板電暈放電法及純化雙水相萃取法7種微藻細胞破碎技術及蛋白質提取技術的研究進展與研究方向，為日后微藻細胞破碎提取內容物提供技術參考。

1 傳統(tǒng)細胞破碎處理方法

1.1 珠磨法

傳統(tǒng)細胞破碎方法中的珠磨法被認為是最有利于放大為工業(yè)生產的細胞破碎方法之一。珠磨法是通過器械腔體內的磨珠高速轉動，機軸的不斷轉動帶動腔體內微藻細胞與珠磨之間相互碰撞、剪切，從而造成微藻細胞的破碎，使內容物溶出[10]。珠磨法可連續(xù)應用于細胞破碎且細胞破碎率高，通過球磨機自身所帶的冷卻水冷卻系統(tǒng)，能很好地控制細胞破碎過程中溫度的升高，利用于工業(yè)化生產具有極高的可能性。

目前珠磨法已被廣泛應用于微藻細胞蛋白質與油脂的提取過程中，Safi等[11]通過研究不同細胞破碎方法表明高壓勻漿法與珠磨法在細胞破碎釋放蛋白質中最為有效，細胞崩解率＞95%，總蛋白釋放量達50%，且能量輸入較脈沖電場處理法低數(shù)十倍，該研究表明珠磨法是一種耗能低、蛋白質釋放率高的細胞破碎技術。Alavijeh等[12]采用珠磨法-酶水解相結合的方法，將細胞經球磨處理后，用不同的水解酶水解，單純珠磨法脂類、碳水化合物和蛋白質的回收率分別為75%，31%和40%，而采用酶處理可顯著提高此結果，各組分的回收率均達到最大值，固相可得88%油脂，液相可分離出74%的碳水化合物和68%的蛋白質，故在研究應用過程中生物酶解技術與物理珠磨法的結合更有利于微藻細胞蛋白質溶出。劉習軍[13]通過利用超聲波輔助渦輪式珠磨機破碎球藻細胞，表明輔用超聲波法后，珠磨法破碎細胞時間由35 min降至20 min，且細胞破壁率達到95%以上，可促進珠磨法在工業(yè)中的應用。由此可見，細胞破碎技術的結合使用比單獨使用一種破碎方法蛋白質溶出率更高、溶出時間更短，除此之外的其他結合方法與實現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)應用有待日后科研人員的研究探討。

1.2 超聲處理法

超聲波處理法是通過超聲波高強度聲能輸入下達到細胞破碎的一種方法[14-15]。此方法與超聲波空化現(xiàn)象相關[16]，超聲處理法通過高強度聲能的輸入，使含有微藻細胞的溶液局部出現(xiàn)負壓區(qū)，進而在負壓區(qū)形成大量的空泡與微小的氣泡，負壓區(qū)的氣泡穩(wěn)定性極差，產生后不久便會破碎，當大量的氣泡破損的瞬間將產生較大的爆破壓力，從而產生劇烈的沖擊波，在沖擊波的作用下細胞壁結構受到沖擊而破碎內容物溶出[13]。

Schwede等[17]、Lee等[18]、Lee等[19]研究表明利用超聲波處理法進行細胞破碎，破壁率與超聲波振幅、頻率、超聲處理時間、細胞種類等因素均有密切關系，處理過程各因素的試驗參數(shù)需要按照不同細胞種類進行試驗確定，不同因素間的互交作用有待進一步研究。Al-Zuhair等[20]研究表明超聲處理參數(shù)為1 000 W、3 min時，柵藻和萊茵衣藻的蛋白質提取率＞70%。Zhang等21]研究建立了乙醇浸泡、酶消化、超聲和均質技術相結合的細胞破碎方法。利用該方法從微藻中提取了72.4%的蛋白質，此結果微藻細胞蛋白質溶出率遠遠大于Safi等[11]利用高壓勻漿法與珠磨法結合，總蛋白釋放量達50%，此研究也進一步證實各破碎方法的結合是一種潛在的微藻蛋白提取方法，有助于微藻細胞蛋白資源在功能性食品和醫(yī)藥中的充分開發(fā)利用，自此更多細胞破碎技術的互交作用的機理與應用參數(shù)有待進一步的探討。

1.3 生物酶解法

生物酶解法因其溫和的作用條件、高度的專一性早已被廣泛應用于細胞破碎處理中，但高度專一性的酶篩選不易，且將生物酶解法應用于大規(guī)模的工業(yè)化生產中成本較高，因此該法在細胞破碎工業(yè)化生產中的利用具有一定的困難。

張睿林[22]通過生物酶解、乙醇浸泡、超聲處理與均質處理結合提取球藻蛋白研究表明，利用纖維素酶pH 5.0條件下水解3 h，超聲處理功率1 000 W處理36 min，萃取10 min，蛋白提取率高達72.3%。相比Alavijeh等[12]采用珠磨法-酶水解相結合方法68%的蛋白質溶出率更高。兩者研究的對比更進一步證實了多種細胞破碎方法優(yōu)點的結合更有利于細胞內蛋白質的提取，但各個技術相互作用的影響、是否可進行互交及參數(shù)的確定需進一步研究。

生物酶解法應用于細胞破碎雖條件溫和，有利于保留蛋白質及功能性多肽的活性，但處理成本過高，現(xiàn)階段可考慮通過使用固定化酶技術將酶進行固定化，實現(xiàn)生物酶的連續(xù)化使用，降低生產成本。在使用生物酶法處理過程當中還需嚴格控制酶的處理溫度及pH等酶活性的關鍵影響因素，以防止在酶解過程中由于不當操作而造成的酶變性失活。在今后研究過程中，也可致力于高度專一性、抗高壓、抗高溫酶的篩選，以適應不同細胞破碎環(huán)境，進而大幅度提高細胞破碎率及蛋白質溶出率。

2 新興細胞破碎處理方法

2.1 動態(tài)高壓微射流處理法

動態(tài)高壓微射流處理法是一種耗能的新興高壓細胞破碎技術，該方法與傳統(tǒng)的高壓勻漿法不同，操作過程中碰撞所產生的能量更大、壓力更高。微射流法是通過將兩股含有細胞顆粒的懸濁液高速撞擊，利用細胞激烈撞擊時所產生的巨大瞬間能量，促使細胞破碎[23-24]，因此利用該法進行細胞破碎的細胞破損率與細胞濃度、碰撞次數(shù)、處理壓力等因素具有直接聯(lián)系。由于該法是利用細胞劇烈碰撞產生能量而促使細胞破碎，故細胞破碎瞬間會產生大量的熱能，使操作室溫度急劇升高，因此如何高效控制操作室溫度、避免對細胞溶出物活性的影響還需進一步探究。

Cha等[25]采用體外消化和人腸道Caco-2細胞模型，研究表明微射流處理可提高微藻細胞葉黃素膠束化效率，在68.96 MPa以上壓力下處理后，掃描電鏡觀察細胞平均粒徑由3.56 μm降至0.35 μm。與未經處理的細胞相比，137.93 MPa條件下的微藻細胞水溶液微射流處理后生成葉黃素膠束的效率提高了3倍。Xia等[26]采用微射流和密度分離相結合的方法，從碎米中提取蛋白質，輔以后續(xù)酶處理（淀粉酶和糖化酶）后，蛋白質回收率高達81.87%，純度達87.89%，結果表明，酶輔助微射流技術是一種無破壞、選擇性提取蛋白的有效方法，但利用于微藻細胞蛋白質的提取工藝需進一步研究。除生物酶解技術與微射流處理法結合作用于微藻細胞蛋白質提取外，其他技術與高壓微射流處理相結合的作用與效果有待進一步探討，進一步發(fā)掘出使蛋白質提取率更高的方法，而且如何使該方法能耗與產出相對合理分配，也需結合作用機理進一步研究。

2.2 超臨界流體空化法

超臨界流體空化法是通過使用CO2、N2等利用高壓將其滲透進入細胞內，再將高壓環(huán)境瞬時降為低壓環(huán)境，通過外壓環(huán)境的瞬間變化使細胞膨脹破裂的方法[27]。相比于傳統(tǒng)的珠磨法、高壓勻漿法與高壓微射流處理法，超臨界流體空化法避免了劇烈能量的變化而造成的溫度過高現(xiàn)象，亦避免了生物酶解處理過程中污染嚴重、雜質增加、控制參數(shù)繁多等不利影響，是一種微藻細胞破碎處理的綠色、高效、穩(wěn)定的處理方法。

劉明磊[28]通過流體空化法對綠球藻細胞進行破壁處理，當破壁時間為30 min時，破壁率可達90%，改變處理壓力從0.1 MPa升至0.25 MPa時，綠球藻細胞破壁率提高了30%。胡愛軍等[29]采用超臨界CO2流體輔以超聲處理，在超臨界CO2流體處理海藻細胞破碎的同時輔以超聲處理法，兩種方法的結合不會破壞海藻細胞內的生物活性物質，且能夠有效地增加海藻細胞內二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的提取率。將超臨界CO2流體結合超聲處理的方法應用于微藻細胞蛋白質提取過程參數(shù)與對蛋白質提取率的影響還待研究。Dierkes等[30]通過超臨界CO2流體處理淋球菌，使菌體細胞破碎內容物脂質與蝦青素溶出，兩種物質提取率分別達80%與90%左右，相對于傳統(tǒng)細胞破碎方法，超臨界流體空化法清潔、高效的破碎效果使其在細胞破碎提取內容物研究當中具有很高的潛力。

2.3 多針-板電暈放電技術

多針-板電暈放電法是一種新型的細胞破壁提取內容物的方法，該方法是通過將多余正負電荷中和而產生能量的過程，中和過程產生的能量將細胞壁與細胞膜電穿孔，使膜崩解，從而造成細胞內容物溶出得以提取利用[31]。趙麗[32]通過研究利用多針-板電暈放電技術在電壓8 000 kV、處理時間1 min的條件下即可破碎藻體細胞，使藻體細胞內溶物溶出，相較于其他細胞破碎方法，該方法處理時間短且高效，但該技術在微藻細胞破碎的相關研究較少，且如何控制高壓與放電方式等對于微藻細胞破碎的影響及參數(shù)的確定暫無相關詳細報道。

多針-板電暈放電技術操作簡單且細胞破碎效率高、耗時短、破碎過程所需成本低，具有工業(yè)化大規(guī)模生產利用的良好優(yōu)勢，但如何進行規(guī)范進行大規(guī)模使用、如何控制參數(shù)的變化、如何使用正確放電技術需相關研究進一步探討。

3 雙水相萃取純化微藻蛋白

微藻細胞破碎后內容物蛋白質溶出還需進行下一步分離純化以得到純度高的蛋白質。傳統(tǒng)的微藻蛋白分離純化的方法有羥基磷灰石層析法[33]、凝膠層析法[34]、離子交換法[35]等，這些傳統(tǒng)的方法在蛋白質分離純化過程中步驟繁多、耗能大、分離周期長，且在工業(yè)化生產利用過程中價格昂貴，故大批量生產困難。

雙水相萃取技術是使用多種物質以一定比例的質量分數(shù)溶解于水中，以形成互不相容的水溶液體系，有聚合物-有機鹽-水、聚合物-聚合物-水、聚合物-無機鹽-水、表面活性劑-表面活性劑-水、有機溶劑-無機鹽-水等類型[36]，與傳統(tǒng)分離純化的層析法相比，雙水相萃取法環(huán)保、純化效率高，通過與超濾、等電點沉淀、結晶等粗提取方法結合，更有利于細胞流出蛋白質的純化。王巍杰等[37]利用一定比例濃度的PEG與酒石酸鉀鈉雙水相萃取，pH 6.0條件下在此雙水相體系中藻藍蛋白被萃取至上相，最高純度為3.69，回收率高達到94.56%。付麗麗等[38]利用PEG與酒石酸鉀鈉形成的雙水相體系進行純化鈍頂螺旋藻藻藍蛋白，在pH 6.5條件下藻藍蛋白回收率達到93.07%。田盼盼等[39]通過建立逐級鹽析結合雙水相萃取技術，在不同濃度的(NH4)2SO4數(shù)次鹽析后得藻藍蛋白，再用質量分數(shù)10%的聚乙二醇6000、18%的(NH4)2SO4進行雙水相萃取。所得產物純度可達到8.6，回收率為71.40%。由此對比可得逐級鹽析與雙水相萃取結合的方法能顯著提高產物的純度。盛晶夢等[40]采用粉末活性炭吸附與雙水相萃取法相結合，對藻藍蛋白進行純化提取，利用PEG與硫酸鹽組成的雙相中進行萃取，在pH 7.0條件下藻藍蛋白純化后純度達3.46，回收率達63%。雙水相萃取法與其他預處理或預提純等方法的結合與互作還需進一步考察。

相比于傳統(tǒng)的萃取方法，雙水相萃取法在純化蛋白質等生物活性物質的過程中，提供了溫和的大環(huán)境，在提取過程中避免了傳統(tǒng)萃取方法所造成的蛋白質變性與活性破壞等不利影響，但雙水相萃取技術起步較晚，且雙相系統(tǒng)中所使用的聚合物多集中于市面上常見的聚合物質，雙水相萃取技術能否大量應用于微藻蛋白質提取，還需進一步探究與其他技術相結合的互作影響，提取過程中的動力學、熱力學變化影響及提取工藝的進一步優(yōu)化。

4 結語與展望

微藻細胞由于蛋白質含量高、蛋白質量優(yōu)質等眾多優(yōu)點而被廣泛開采利用，但微藻細胞復雜的胞壁結構，必須進行適當?shù)募毎扑楹蟛拍苁沟鞍踪|溶出、提取、利用?，F(xiàn)有的細胞破碎方法多數(shù)耗能高、溫度變化大，對蛋白質提取具有眾多不利影響。為充分破碎微藻細胞、提高微藻蛋白質純度及回收率，可注重研究各細胞破碎方法之間的結合利用與互作影響。各預處理技術與深度純化技術相結合，提高蛋白質的回收率。篩選抗高溫、高壓條件的酶類與細胞破碎技術結合利用，深度研究雙水相萃取技術與其它萃取技術的結合使用，更需進一步深層次地研究其各細胞破碎、預處理、純化技術的作用機理，以實現(xiàn)微藻蛋白質的大規(guī)模生產。