周潛 韓燕 劉經(jīng)緯 尹躍平

中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院皮膚病醫(yī)院 中國疾病預防控制中心性病控制中心，南京210042

志賀菌（Shigella）于1898年由Kiyoshi Shiga發(fā)現(xiàn)并命名，是細菌性痢疾的病原體[1]。根據(jù)菌體抗原的結構不同分為4個血清群：痢疾志賀菌（S.dysenteriae）、福氏志賀菌（S.flexneri）、鮑氏志賀菌（S.boydii）和宋內(nèi)志賀菌（S.sonnei）[2]。目前已發(fā)現(xiàn)志賀菌對包括磺胺類、四環(huán)素類、鏈霉素以及喹諾酮類等多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥[1]。志賀菌耐藥機制與藥物作用靶位的改變、染色體編碼的外排系統(tǒng)蛋白表達增強和質(zhì)粒介導耐藥基因的表達有關[3]。2019年，WHO建議將環(huán)丙沙星作為治療志賀菌感染的一線藥物，阿奇霉素、頭孢克肟和頭孢曲松作為二線治療藥物[4]。本文選取喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類與β-內(nèi)酰胺類三類抗菌藥物，綜述了志賀菌耐藥基因及其檢測方法的研究進展和應用。

一、志賀菌耐藥基因

1.喹諾酮類耐藥基因

志賀菌耐喹諾酮類藥物的機制主要包括染色體介導的藥物作用靶位基因的改變與質(zhì)粒介導的喹諾酮類耐藥基因。染色體介導的氟喹諾酮類抗菌藥物的耐藥主要是編碼DNA回旋酶和拓撲異構酶Ⅳ的基因發(fā)生突變導致，DNA回旋酶由gyrA和gyrB基因編碼，拓撲異構酶Ⅳ由parC和parE基因編碼[5]。突變最常發(fā)生在gyrA基因起始處附近Ala67和Gln107之間的區(qū)域，即喹諾酮類藥物耐藥決定區(qū)（QRDR），以gyrA基因上的Ser83、Asp87和His211突變最為常見[6]，并常與parC上的Ser80突變共同發(fā)生，在parC和gyrA區(qū)域發(fā)生多個突變能顯著降低志賀菌對喹諾酮類藥物的敏感性[7]。

質(zhì)粒介導的喹諾酮類抗性區(qū)基因（PMQR），即qnr基因分離物[qnrA、qnrB、qnrS、aac（6’）-Ⅰb-cr]可借助如整合子或插入序列共同區(qū)等可移動遺傳元件，通過接合或轉化的方式，在志賀菌與其他腸桿菌科細菌之間傳播[8]。aac（6’）-Ⅰb-cr和qnrS基因分別于1998年和2002年首次在福氏志賀菌2a型和1a型中發(fā)現(xiàn)[9]。Qnr蛋白能直接與DNA結合，減少回旋酶與DNA的結合，并保護拓撲異構酶Ⅳ免受喹諾酮的侵害，從而逆轉喹諾酮類抑制DNA回旋酶的能力，同時Qnr家族蛋白可以提高細菌對喹諾酮類藥物的耐藥突變預防濃度（MPC）值，從而提高耐藥突變的發(fā)生率。aac（6’）-Ⅰb-cr基因編碼與喹諾酮活性降低相關的氨基糖苷乙酰轉移酶，這種雙功能酶能乙酰化環(huán)丙沙星、諾氟沙星和其他喹諾酮類藥物，但左氧氟沙星不受這種乙酰轉移酶的影響[8]。除此以外，在志賀菌中也發(fā)現(xiàn)了mdfA、acrA和acrB等外排泵編碼基因調(diào)節(jié)的喹諾酮類藥物耐藥性[10]。

2.大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因

大環(huán)內(nèi)酯類藥物通過阻斷50s核糖體中肽酰轉移酶的活性，抑制細菌蛋白質(zhì)合成發(fā)揮抑菌作用。以往的研究認為志賀菌對大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥主要原因為藥物作用靶位的改變，如編碼L22核糖體蛋白的rplV與編碼L4核糖體蛋白的rplD和rrlH基因發(fā)生點狀突變；以及由ompA、ompW、mefA和msrA等外排泵介導的耐藥性。近年的研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒介導的阿奇霉素耐藥基因同樣發(fā)揮重要的作用，包括mph、erm和ere基因[11-12]。mph基因編碼的磷酸轉移酶可使脫氧二甲胺己糖C-2’位置發(fā)生磷酸化而失活，與阿奇霉素耐藥高度相關，對阿奇霉素高度耐藥（MIC>256 μg/mL）的志賀菌中均發(fā)現(xiàn)攜帶有mphA基因[13]。根據(jù)對mphA相關質(zhì)粒的研究，志賀菌中mphA耐藥基因的獲得主要來源于大腸桿菌質(zhì)粒的傳播[14]。法國的研究篩查到攜帶p2246-CTXM質(zhì)粒的阿奇霉素耐藥志賀菌上帶有IS26-mphA-mrx-mphR（A）-IS6100基因盒[12]。erm基因是紅霉素甲基化酶基因，使核糖體23S rRNA上特定位點的腺嘌呤甲基化以阻止紅霉素結合，在以色列發(fā)現(xiàn)攜帶ermB基因的2a型福氏志賀菌菌株表現(xiàn)出對阿奇霉素低敏[15]。

男男性行為者（MSM）人群中發(fā)現(xiàn)的志賀菌表現(xiàn)出對阿奇霉素的敏感性降低，并篩查出多種攜帶大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因的質(zhì)粒，Darton等[16]研究發(fā)現(xiàn)在MSM中暴發(fā)的宋內(nèi)志賀菌和3a型福氏志賀菌中存在具有顯著的DNA同源性的IncFⅠ和IncFⅡ質(zhì)粒，上有erm基因，該基因通過編碼rRNA甲基化酶進行靶位修飾使志賀菌產(chǎn)生耐藥性。英國的一項橫斷面研究對MSM人群中暴發(fā)的3a型福氏志賀菌進行全基因組測序，發(fā)現(xiàn)了攜帶mphA和ermB的質(zhì)粒pKSR100，表現(xiàn)為對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的高水平耐藥性[17]，該質(zhì)粒也被證實存在于2a型福氏志賀菌與宋氏志賀菌中[18]。

3.β-內(nèi)酰胺類耐藥基因

志賀菌耐β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的重要機制是質(zhì)粒中的含有超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）基因與AmpC酶基因。ESBLs屬于Ambler分類A類，Bush分類的2be亞群，對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物具有廣泛水解活性。2004年，首次在孟加拉國發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)ESBLs的志賀菌[19]。迄今為止，已有多個國家和地區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)志賀菌攜帶不同類型的ESBLs基因，包括blaTEM、blaSHV和blaCTX-M基因[20-21]，其中CTX-M型ESBLs與 耐 藥性的水平傳播最為相關，CTX-M-15對哌拉西林、芐青霉素、頭孢曲松和頭孢噻肟具有很高的催化效率[22-23]。在來自中國患者的福氏志賀菌分離株中發(fā)現(xiàn)兩個偶聯(lián)質(zhì)粒IncHI2和IncF，攜帶有blaCTX-M-123的ESBLs基因，該基因由CTX-M-9和CTX-M-1組成，可在福氏志賀菌中水平傳播[24]。SHV基因型ESBLs是廣譜酶SHV-1的編碼基因核苷酸突變形成的酶，如SHV-2相比SHV-1發(fā)生Gly238→Ser突變，具有超廣譜特性[25]。近年還發(fā)現(xiàn)有攜帶SHV-12等SHV型超廣譜酶的志賀菌流行[26]。TEM型內(nèi)酰胺酶根據(jù)其水解底物譜，可分為4類包括廣譜B內(nèi)酰胺酶、ESBLs、耐酶抑制劑β-內(nèi)酰胺酶和CMT。志賀菌中發(fā)現(xiàn)由質(zhì)粒介導的TEM-1基因發(fā)生水平轉移，引起宋氏志賀菌對氨芐西林的耐藥[27]。

AmpC酶是由染色體或質(zhì)粒介導產(chǎn)生的一類β-內(nèi)酰胺酶，屬于Ambler分類C類，Bush分類的1群，為作用于頭孢菌素且不被克拉維酸抑制的β-內(nèi)酰胺酶。Taneja等[28]研究發(fā)現(xiàn)，有20%對頭孢曲松或頭孢吡肟具有耐藥性的福氏志賀菌產(chǎn)AmpC酶。在中國臺灣的細菌性痢疾流行期間，也發(fā)現(xiàn)耐頭孢曲松的宋內(nèi)志賀菌分離株中存在CMY-2型AmpC β-內(nèi)酰胺酶質(zhì)粒[29]。

二、志賀菌耐藥基因的檢測方法

1.常規(guī)PCR法

PCR法是將志賀菌耐藥基因作為靶基因，針對基因兩端設計特異性引物進行擴增，進行瓊脂糖電泳或序列測定以檢測靶基因是否存在或發(fā)生突變的方法。PCR法在耐藥基因檢測方面具有操作簡便、成本低等特點。1994年，Rahman等[30]根據(jù)大腸埃希菌gyrA基因設計特異性引物，通過結合PCR法與一代DNA測序技術首次發(fā)現(xiàn)了喹諾酮耐藥志賀菌gyrA基因上的Ser83突變。之后，更多研究者使用PCR法鑒定出志賀菌耐藥基因，Ezernitchi等[15]使用PCR法對以色列2014—2016年收集的志賀菌進行耐藥基因檢測，其中對阿奇霉素低敏感的志賀菌均帶有mphA和ermB基因。毛聯(lián)鋼等[31]使用PCR法對寧波地區(qū)腸道感染志賀菌喹諾酮類藥物耐藥基因進行檢測，發(fā)現(xiàn)環(huán)丙沙星耐藥菌中97.59%的分離株帶有Ser83、Asp87和Ser80突變。

2.多重PCR法

多重PCR是在傳統(tǒng)PCR基礎上發(fā)展出的一種檢測方法，其在同一PCR反應體系里加入2對以上引物，從而可以同時擴增出多個核酸片段的PCR反應[32]。對于志賀菌耐藥基因，可同時設計針對多個基因的特異性引物，選擇合適的退火溫度，實現(xiàn)對多個基因的克隆和鑒定。王倩等[33]使用多重PCR方法，在退火溫度為57.5℃的條件下，可同時擴增出gyrA、parC和毒力致病性基因ipaH用于下一步測序與鑒定。Zhang等[34]使用多重PCR的方法對北京、成都和烏魯木齊等地收集的志賀菌菌株β-內(nèi)酰胺酶類抗菌藥物耐藥性進行檢測，發(fā)現(xiàn)可同時對多種ESBLs基因進行檢測。多重PCR較傳統(tǒng)PCR方法耗時較短，但由于引物之間的相互作用，對多重PCR的擴增條件要求較高，需要反復優(yōu)化調(diào)整復性條件和引物濃度以增加擴增效率。

3.實時熒光定量PCR法（qPCR）

qPCR是在PCR體系中加入熒光基團，擴增過程中通過熒光信號累積對PCR進程進行實時檢測的方法。根據(jù)RT-qPCR的化學發(fā)光原理可分為探針類方法（TaqMan探針和分子信標）和非探針類方法（SYBR GreenⅠ等熒光染料）。針對志賀菌的QRDR區(qū)gyrA和parC突變，可設計特異性TaqMan MGB探針對突變堿基進行檢測。Kim等[35]開發(fā)了針對gyrA基因Ser83和Asp87突變與parC基因Ser80和Agr87突變的TaqMan探針，使用qPCR法可檢測是否存在堿基突變，qPCR法的檢測結果與測序結果相同。對于質(zhì)粒介導的耐藥基因，qPCR法可定量檢測耐藥基因及轉錄水平。Zhang等[11]對來自中國的392株志賀菌分離株通過qPCR法進行耐藥基因分析，檢測到55%（44/80）的阿奇霉素低敏志賀菌具有mphA基因，未發(fā)現(xiàn)與阿奇霉素耐藥性相關的外膜蛋白基因ompA和ompW的過表達。相較常規(guī)PCR，qPCR法具有對待測基因進行快速及精確相對定量檢測的特點，并能通過定量mRNA來分析待測基因的表達水平。

4.基因芯片法

基因芯片法又稱DNA微陣列雜交法，主要基于固體基質(zhì)（載玻片或硅薄膜）上的二維陣列以高通量地定性或定量測定DNA分子，其探針由數(shù)kb或幾十個特定核苷酸構成，DNA微陣列技術現(xiàn)主要應用分析DNA突變及多態(tài)性、檢測基因表達差異、發(fā)現(xiàn)新的致病基因等多個研究領域[36]。Taitt等[37]開發(fā)了ARDM v.2 DNA芯片，該芯片可識別針對17種抗菌藥物的236個耐藥性基因，每個基因在芯片上包含4或5對重復探針，將芯片與生物素化的DNA片段雜交后，使用辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素來產(chǎn)生信號。Taitt等[38]通過該芯片對多種腹瀉致病菌的耐藥基因進行檢測，在2株志賀菌中發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒介導的qnrS基因，同時檢測到頭孢耐藥志賀菌株中的blaCTX-M-9和blaCTX-M-1基因。

5.全基因組測序法（WGS）

WGS可以快速全面地找出個體基因組上的所有突變，在定義耐藥基因型和預測耐藥表型具有很高的靈敏度和特異性。通過WGS進行生物信息學分析構建進化樹，可對細菌基因組學與傳播模式進行精確研究。通過WGS識別耐藥基因常采用二代測序方法，形成短讀序列片段以后，使用定制算法將片段映射到參考序列以確定是否存在耐藥基因，耐藥基因的參考序列可在CARD或NCBI等數(shù)據(jù)庫中獲得[39]。Baker等[17]通過全基因組測序的方法，對福氏志賀菌3a型進行譜系與耐藥基因研究，所有的分離株均攜帶一個共同的多藥耐藥元件（SRL-MDRE），而MSM相關譜系中發(fā)現(xiàn)了額外的耐藥相關可移動遺傳元件，編碼了對其他抗菌藥物的耐藥性。Mook等[40]對英國發(fā)現(xiàn)的志賀菌分離株183660進行WGS后，發(fā)現(xiàn)在p183660質(zhì)粒上存在超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBL）基因TEM-1和CTX-M，使該分離株獲得對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的高水平耐藥性。

三、展望

志賀菌對各種抗菌藥物的耐藥性不斷增加，對其耐藥基因與突變位點的研究與檢測尤為重要，根據(jù)目前已知的耐藥基因?qū)χ举R菌進行檢測，有助于對志賀菌感染的有效治療提供依據(jù)。在耐藥基因檢測方面，可根據(jù)實驗室條件選擇PCR法、DNA微陣列技術和全基因組測序法，在檢測志賀菌感染同時進行耐藥基因檢測。在未來，隨著檢測技術的不斷更新，有望研究出更多低成本、操作簡便的耐藥基因檢測技術，進一步實現(xiàn)對志賀菌的有效防控。

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