呂忠蕾

吉林元和元生物工程股份有限公司，吉林長春 130000

禽腺病毒是一類中等大小無囊膜的線狀單分子雙股DNA病毒，一種全世界范圍內(nèi)流行的家禽和野禽常見的傳染病病原。心包積水-肝炎綜合征（HHS）是由I群禽腺病毒4型(FADV-4)引起的一種高傳染性和高死亡率的禽疫病。該病一年四季均可發(fā)生，其特征性癥狀為3～5周齡雞突然死亡，個別雞在死亡前出現(xiàn)精神沉郁、羽毛蓬亂、翅膀下垂、食欲廢絕、雙腳麻痹、排黃綠色稀便等生理癥狀，臨死前有的雞發(fā)出尖銳鳴叫聲，并出現(xiàn)角弓反張等精神癥狀。剖檢后病變主要見于心臟、肝臟、腎臟和肺臟。剖檢的雞多數(shù)都有比較明顯的心包積液，積液顏色呈淡黃色、澄清的液體，有的呈膠凍狀，心臟外層呈水囊狀，心臟多松弛畸形、心臟內(nèi)膜有出血點；肝臟可見腫大、表面有出血點、觸碰易碎、顏色呈淡黃色或土黃色；肺臟出現(xiàn)充血或水腫；腎臟呈現(xiàn)出花斑狀，充血腫大。禽腺病毒既可水平傳播也可垂直傳播，廣泛分布于世界各地的禽養(yǎng)殖業(yè)。禽腺病毒發(fā)病特征一般呈急性發(fā)作，死亡率頗高，給禽養(yǎng)殖業(yè)帶來較大的經(jīng)濟損失。

2021年4～5月期間，東北地區(qū)遼寧、吉林、黑龍江三省多次送檢禽病樣品，解剖后可見病死雞有明顯的心包積液癥狀、肝臟和腎臟充血腫大等病變。根據(jù)其發(fā)病癥狀、解剖情況并結(jié)合實驗室檢測分析，最終診斷結(jié)果為禽腺病毒4型感染。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料來源

由東北地區(qū)遼寧、吉林、黑龍江三省送檢的病雞，主要表現(xiàn)為食欲減退、精神萎靡、羽毛松亂、排黃綠色稀便。剖檢可見淡黃色或膠凍狀的心包積液,心肌松軟充血；肝臟充血腫大，顏色變淺或呈土黃色，常見黃白色壞死灶或針尖狀出血點；腎臟充血腫大，有時因尿酸鹽的沉積呈花斑腎樣變化。取以上三個地區(qū)病雞的病變肝臟、腎臟和心包積液提取病毒核酸DNA。

1.1.2 試劑

病毒核酸提取試劑盒，膠回收純化試劑盒購自北京愛思進生物科技有限公司，瓊脂糖，2×Taq PCR Mix、DNA Marker DL2000均購自TAKARA公司。pEASY-T5 Zero Cloning Kit試劑盒購自TRANS。

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank登錄的FADV-4的Hexon基因核苷酸序列，設(shè)計用于擴增FADV-4的PCR引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列片段大小為527 bp，上游引物：TGYTCGTTGTGGATSGTGAA，下游引物：CTTYGTKKTGGG NTGGTCG。

1.3 病毒核酸DNA的提取

取患病雞的肝臟、脾臟、腎臟、心包積液等病料組織剪碎、研磨混合后，加入5倍體積的PBS緩沖液制成組織懸液（液體病料如心包積液無需研磨，直接取200 μL進行提?。?，震蕩混合均勻，然后根據(jù)病毒核酸提取試劑盒說明書操作，簡述如下：收集200 μL的樣品，轉(zhuǎn)入1.5 mL的離心管內(nèi)（如果樣品有細胞細菌污染，可先12000 rpm離心5 min，取上清200 μL作為樣品）；加入200 μL的Buffer V-L，渦旋振蕩混合均勻后，在室溫條件下靜置5 min；加75 μL Buffer V-N，渦旋振蕩混合均勻，12000 rpm離心5 min；取上清液體加入到新的2 mL離心管（試劑盒內(nèi)提供），加300 μL異丙醇（1%冰乙酸），上下倒置6～8次，混合均勻；將吸附柱置于無菌的2 mL離心管中，將上一步的混合液全部移入吸附柱中6000 rpm離心1 min；棄廢液，將吸附柱回到2 mL離心管中，加500 μL的洗液1后，在室溫條件下靜置1 min后，12000 rpm離心1 min；棄廢液，將吸附柱回到2 mL離心管中，加800 μL的洗液2后，12000 rpm離心1 min，棄廢液；將吸附柱回到2 mL離心管中，12000 rpm空柱離心1 min；將吸附柱置于無菌的1.5 mL離心管，在吸附膜中間位置加50 μL的Buffer TE，室溫靜置1 min，12000 rpm離心1 min洗脫DNA，DNA模板可放置于-20 ℃保存。

1.4 PCR擴增

將已提取的病毒DNA模板進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系共20 μL，2×Taq PCR Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。94 ℃預(yù)變性反應(yīng)5 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，同時設(shè)置陰性對照。同時進行禽流感病毒通用型、新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒的PCR/RTPCR檢測，其檢測方法參照其相對應(yīng)的國標。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物的鑒定

PCR反應(yīng)結(jié)束后取5 μL的擴增產(chǎn)物，加入到已配制好的1%瓊脂糖凝膠槽中，放入電泳槽后進行電泳實驗，實驗結(jié)束后于凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳結(jié)果。結(jié)果顯示，待檢測的DNA模板擴增出527 bp左右大小的條帶，而陰性對照未出現(xiàn)相對應(yīng)的條帶，而禽流感病毒通用型、新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒均未擴增出條帶。

2.2 測序分析

將PCR產(chǎn)物經(jīng)過回收純化后連接到 pEASY-T5 克隆載體中，將上一步的連接產(chǎn)物加入到Trans1-T1感受態(tài)細胞中，將最后獲取的全部菌液涂在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)12～16 h左右，觀察有無菌落生長，接下來挑取單個菌落接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基上，在200 rpm、37 ℃搖床培養(yǎng)6 h左右，取1 μL菌液于25 μL的PCR反應(yīng)體系中用于鑒定陽性克隆。將克隆結(jié)果陽性者送到上海生工生物工程有限公司委托其測序，將最后獲得的測序結(jié)果用DNAMAN軟件與NCBI進行比對，結(jié)果為禽腺病毒4型分離株GDMZ，GenBank登錄號為 MG856954.1。

3 討論

通過對東北地區(qū)患病雞的病原檢測發(fā)現(xiàn)禽腺病毒4型的檢出率要高于新城疫、禽流感和傳染性支氣管炎，可能是由于養(yǎng)殖場對禽腺病毒的診斷以及防治方面存在欠缺之處，因此導(dǎo)致近幾年養(yǎng)殖場感染禽腺病毒的死亡率上升，該病毒可通過候鳥遷徙、活禽運輸、糞便、垂直傳代等方式傳播。

4 防治措施

4.1 凈化源頭

以預(yù)防為主為原則，避免從疫情區(qū)、有過禽腺病毒病史的養(yǎng)殖場引進種禽或者購買雛禽。禁止未經(jīng)消毒的車輛和用具隨意進入養(yǎng)殖場，及時發(fā)現(xiàn)并淘汰雞群內(nèi)早期發(fā)病雞只并進行相應(yīng)無害化處理，加強并定期對雞舍養(yǎng)殖環(huán)境消毒。

4.2 接種疫苗

選擇市面上適宜的血清型疫苗進行接種，接種禽腺病毒疫苗要注意防止其它病原的交叉污染，否則可能導(dǎo)致本次免疫的失敗。

4.3 環(huán)境消殺

對雞舍進行消毒首選福爾馬林或戊二醛等對腺病毒比較敏感的消毒劑。環(huán)境及用具消毒可以用5%燒堿液或石灰澄清液，帶禽消毒首選安全性和高效性的0.3%過氧乙酸和氯制劑。

5 總結(jié)

東北地區(qū)禽腺病毒4型檢出率較高，但無法確定其傳染源，因此只能通過采取綜合防治措施，飼養(yǎng)、管理、消毒和免疫四個環(huán)節(jié)缺一不可。同時要加強對禽流行病學(xué)的調(diào)查工作,準確把握當?shù)亓餍醒逍?及早預(yù)測疫情的發(fā)展,對做好防控至關(guān)重要。

參考文獻：略