王 剛，連紫宛，李占強(qiáng)，張朝霞，樊 融，馬 蕊

(1.青海衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)教育研究中心，青海 西寧 810000；2.衢州市人民醫(yī)院 病理科，浙江 衢州 324000；3.青海大學(xué) 高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧810000)

雪靈芝(ArenariakansuensisMaxim)是廣泛分布于青藏高原的石竹科蚤綴屬野生植物，藏藥名謂“阿仲”。研究顯示，其成分主要含有多糖、黃酮、三萜皂苷及生物堿，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化及抗炎等生物學(xué)效應(yīng)[1-3]。本課題組前期研究顯示，雪靈芝粗多糖(Crude polysaccharide fromArenariakansuensisMaxim, AKCP)具有促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖、NK細(xì)胞殺傷及巨噬細(xì)胞吞噬活性[4-5]；對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠的免疫功能發(fā)揮保護(hù)作用[6]；對S180荷瘤小鼠的瘤體生長，顯現(xiàn)出抑制效應(yīng)[7]?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，本研究進(jìn)一步探討AKCP對S180荷瘤小鼠的免疫功能，是否具有激活作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及儀器

30日齡SPF級Balb/c小鼠，雌雄各半，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心，動物許可證號：SCXK(陜)2018-001；S180及Yac-1細(xì)胞購于中科院上海細(xì)胞庫；雪靈芝全草購自青海九康醫(yī)藥保健品有限公司，并參照文獻(xiàn)[4-5]按以下方法提取AKCP：雪靈芝全草粉碎后，加入40倍體積水并以95℃浸提，提取液經(jīng)乙醇沉淀后，采用Sevage法除蛋白，收集脫蛋白后的水相流水透析去除小分子雜質(zhì)，以3倍體積乙醇沉淀后冷凍干燥，得到雪靈芝粗多糖(AKCP)粉劑。香菇多糖注射劑(LNT)購自南京易亨制藥有限公司。ELISA試劑盒(IL-2、TNF-α、IFN-γ)以及熒光標(biāo)記單抗(CD3-FITC、CD4-PE、CD8-PerCP)均購自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。xMark-10483酶標(biāo)儀(Bio-red公司)，LightCycler 96PCR儀(Roche公司)，CytoFLEX流式細(xì)胞儀(BECKMAN公司)。

1.2 S180荷瘤小鼠模型建立

取0.2 mL體外培養(yǎng)的S180細(xì)胞(5×106cells/mL)注射于小鼠腹腔，1周后抽取腹水，離心沉淀細(xì)胞后，以生理鹽水洗滌并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106cells/mL，按每只0.2 mL接種于Balb/c小鼠右前肢腋窩皮下。

1.3 試驗分組與處理

小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、香菇多糖(LNT)組、AKCP高(-H)、中(-M)、低(-L)劑量組；除正常組外，其余5組按1.2方法建立S180荷瘤小鼠模型。于建模后第2日開始，正常組和模型組小鼠每日給予0.5 mL蒸餾水灌胃；香菇多糖組小鼠每日按0.25 mg/kg劑量腹腔注射LNT；AKCP高、中、低劑量組，每日各給與200、100、50 mg/kg劑量的AKCP水溶液灌胃；經(jīng)上述處理8天，將各組小鼠進(jìn)行稱重后斷頭處死，隨后無菌條件下切取瘤體、脾臟和胸腺并進(jìn)行稱重。按參考文獻(xiàn)[4, 6]，制備小鼠脾細(xì)胞懸液。

1.4 體重增率、抑瘤率和免疫臟器系數(shù)計算公式

體重增率=(處死前體重-初始體重-瘤重)/初始體重×100%；抑瘤率=(模型組平均瘤重-藥物處理組平均瘤重)/模型組平均瘤重×100%；脾臟系數(shù)=脾重(mg)/體重(g)；胸腺系數(shù)=胸腺重(mg)/體重(g)。

1.5 脾淋巴細(xì)胞增殖與NK細(xì)胞殺傷活性檢測

采用MTT法檢測脾淋巴細(xì)胞增殖和NK細(xì)胞殺傷活性。脾淋巴細(xì)胞增殖活性以刺激指數(shù)(SI)表示：SI=ConA刺激孔A值/對照空A值；NK細(xì)胞殺傷活性=[1-(效-靶細(xì)胞孔A值-效應(yīng)細(xì)胞孔A值)/靶細(xì)胞孔A值]×100%。

1.6 脾細(xì)胞中T細(xì)胞亞群檢測

取1×106cells/mL濃度的小鼠脾細(xì)胞懸液100μL加入流式檢測管，各管中加入CD3-FITC、CD4-PE、CD8-PerCP單抗后，避光孵育30 min，經(jīng)PBS洗滌細(xì)胞后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。采用CytExpert軟件分析CD3+/CD4+/CD8+T細(xì)胞亞群及CD4+/CD8+比值。

1.7 脾細(xì)胞中細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)

離心沉淀小鼠脾細(xì)胞，Trizol法抽提總RNA。以GAPDH為內(nèi)參基因，按試劑盒說明書操作，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA和熒光定量q-PCR檢測細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α的mRNA表達(dá)。

1.8 ELISA法檢測血清中細(xì)胞因子

按ELISA試劑盒說明書操作，檢測小鼠血清中細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α水平。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 AKCP對S-180荷瘤小鼠瘤體生長的抑制作用

結(jié)果顯示，LNT和AKCP-H組抑制瘤體生長的作用較為明顯(P<0.05)(見圖1，表1)。

圖1 各組荷瘤小鼠瘤體圖

表1 各組荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率

2.2 各組小鼠體重增率及免疫臟器系數(shù)的比較

結(jié)果顯示，AKCP-H組的體重增率較正常組和模型組降低(P<0.05)；各組間胸腺及脾臟的臟器系數(shù)無顯著性差異(見表2)。

表2 各組小鼠體重增率及免疫臟器系數(shù)

2.3 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖及NK細(xì)胞殺傷活性的比較

MTT檢測結(jié)果顯示，模型組脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)(SI)低于正常組，LNT組、AKCP-H、AKCP-L組SI較模型組升高(P<0.05)；且NK細(xì)胞殺傷活性在各組間的變化也與之基本相同(P<0.05)(見表3)。

表3 MTT法檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖及NK細(xì)胞殺傷活性

2.4 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞亞群的比較

與正常組比較，模型組CD3+T細(xì)胞、CD3+/CD4+和CD3+/CD8+亞群下降；模型組和LNT組CD4+/CD8+比值升高。各AKCP劑量組CD3+/CD8+T細(xì)胞亞群較模型組顯著升高，且CD4+/CD8+的比值明顯降低(P<0.05)(見表4)。

表4 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞亞群

2.5 各組小鼠脾細(xì)胞中IL-2、IFN-γ及TNF-α的mRNA表達(dá)

經(jīng)熒光定量PCR法檢測各組小鼠脾淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ及TNF-α的mRNA相對表達(dá)量，LNT組、AKCP-H組IFN-γ mRNA表達(dá)水平高于正常組(P<0.05)(見圖2)。

圖2 各組小鼠脾細(xì)胞中IL-2、IFN-γ及TNF-α mRNA表達(dá)

2.6 各組小鼠血清IL-2、IFN-γ及TNF-α水平

經(jīng)ELISA檢測結(jié)果顯示，建立荷瘤模型的各組小鼠血清中TNF-α水平均較正常組升高(P<0.05)；AKCP-M、AKCP-L組小鼠血清中IL-2水平高于模型組(P<0.05)；正常組、LNT組及AKCP-L組小鼠血清中IFN-γ水平高于模型組(P<0.05)(見圖3)。

圖3 各組小鼠血清中IL-2、IFN-γ及TNF-α水平

3 結(jié)論與討論

多糖是一類由多個單糖脫水縮合形成的天然高分子物質(zhì)。近年來的研究表明，來源于自然界植物、菌類的多糖類物質(zhì)具有多種生物學(xué)活性，如抗腫瘤、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)等，其中免疫調(diào)節(jié)作為其主要的生物活性，受到廣泛學(xué)者關(guān)注[8-11]。本課題組之前的體外和體內(nèi)研究表明，AKCP對正常小鼠來源的免疫細(xì)胞、免疫抑制模型小鼠，表現(xiàn)出免疫激活及免疫保護(hù)活性?；诖耍狙芯恳許180荷瘤小鼠為模型，進(jìn)一步觀察在腫瘤存在的情況下，AKCP對機(jī)體抗腫瘤免疫功能的影響。

首先，免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子活化狀態(tài)，對機(jī)體抗腫瘤具有重要意義[12-14]。在免疫細(xì)胞方面，本研究結(jié)果顯示，AKCP-H組與LNT組對于S180荷瘤小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖水平和NK細(xì)胞殺傷活性的下降具有明顯的恢復(fù)作用。T細(xì)胞亞群分析結(jié)果顯示，與正常對照組比較，S180荷瘤模型組小鼠脾細(xì)胞中CD3+T細(xì)胞明顯減少，相應(yīng)地CD3+/CD4+和CD3+/CD8+T細(xì)胞亞群均明顯減少，并且出現(xiàn)CD4+/CD8+比例明顯升高的現(xiàn)象。本研究采用的陽性對照LNT注射劑，是目前臨床常用的抗腫瘤輔助藥物[15-16]，具有較為確定的免疫激活作用。LNT組與AKCP組存在給藥方式、劑量不同，因而LNT的對照作用，在于免疫激活效應(yīng)的定性分析的參照意義，而不具有定量分析的參照意義。結(jié)果顯示，LNT組和各AKCP組顯示出對CD3+/CD4+亞群的升高趨勢。但是，LNT組對CD3+/CD8+亞群無升高作用，其CD4+/CD8+比例與模型組一樣高于正常對照組。而與LNT組不同的是，本研究中各AKCP處理組CD4+/CD8+比例較模型組明顯下降，并恢復(fù)到與正常對照組相近的水平。此結(jié)果提示，AKCP和LNT作為兩種不同來源的天然多糖，二者雖然均對機(jī)體發(fā)揮抗腫瘤免疫的主要細(xì)胞群體-淋巴細(xì)胞的增殖均有促進(jìn)效應(yīng)，但是二者對T細(xì)胞的亞群分化具有不同的調(diào)節(jié)作用，AKCP能夠使CD3+/CD8+T亞群明顯升高，可能更有利于機(jī)體產(chǎn)生更多的殺傷性T細(xì)胞(CTL)，從而在CD4+T協(xié)同下發(fā)揮更加顯著的腫瘤殺傷作用。在細(xì)胞因子方面，AKCP-M、AKCP-L組與LNT組可提高IL-2和IFN-γ的mRNA表達(dá)和血清中的水平；而對S180荷瘤模型引起的TNF-α的mRNA表達(dá)和血清水平升高沒有顯著影響；提示AKCP與LNT具有相同的激活Th1型細(xì)胞因子表達(dá)的作用。

其二，在抑瘤效應(yīng)方面，AKCP與LNT對S180實體瘤的生長均顯示出抑制作用，其中AKCP-H組抑瘤率達(dá)到36.64%。結(jié)合本研究組之前報道[7]，AKCP對S180荷瘤小鼠瘤組織中細(xì)胞增殖相關(guān)因子CyclinD1、PCNA和Ki67，以及對細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bax、Bcl-2的 mRNA和蛋白表達(dá)水平，均無明顯影響。本研究認(rèn)為AKCP雪靈芝多糖表現(xiàn)出的對荷瘤小鼠的瘤體抑制效應(yīng)，其主要機(jī)制并非是通過影響瘤細(xì)胞增殖和凋亡而發(fā)揮直接性抑瘤作用，而是通過激活機(jī)體抗腫瘤免疫，進(jìn)而發(fā)揮間接性抑瘤作用而實現(xiàn)的。

此外，S180荷瘤模型組小鼠體重增率與正常對照組接近，而AKCP各劑量組及LNT組體重增率出現(xiàn)下降，其中以抑瘤率最高的AKCP高劑量組尤為明顯，提示在荷瘤小鼠體內(nèi)抗免疫功能被激活和發(fā)揮抗腫瘤作用的過程中，機(jī)體的能量和營養(yǎng)物質(zhì)代謝可能也相應(yīng)發(fā)生了改變，有待進(jìn)一步研究。