藺儒俠 郭鳳丹 王興軍 夏 晗 侯 蕾

（1山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，250014，山東濟(jì)南；2山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心/山東省作物遺傳改良與生態(tài)生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，250100，山東濟(jì)南）

花生是世界范圍內(nèi)重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物。近年來，花生全基因組測(cè)序的完成促進(jìn)了分子標(biāo)記的開發(fā)利用和關(guān)鍵農(nóng)藝性狀連鎖QTL的鑒定，加速了轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良花生品種的進(jìn)程，標(biāo)志著分子育種已經(jīng)成為花生新品種培育的重要技術(shù)手段之一。本文概述了近年來花生分子育種的研究進(jìn)展，并對(duì)現(xiàn)代分子生物學(xué)和生物技術(shù)在花生育種方面存在的主要問題和應(yīng)用前景進(jìn)行了討論。

1 花生分子標(biāo)記的開發(fā)

分子標(biāo)記是分子輔助選擇和設(shè)計(jì)育種的基礎(chǔ)，近年來花生中大量的分子標(biāo)記被開發(fā)出來，為花生分子育種提供了便利條件。Zhao等[1]以二倍體野生種花生基因組為參考序列，分別從A和B基因組中鑒定出135 529和199 957個(gè)SSR位點(diǎn)，并分別構(gòu)建了花生A和B基因組的物理圖譜。Zhong等[2]對(duì)花生果針不同發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，挖掘出5058個(gè)SSR標(biāo)記，利用其中的200個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)22個(gè)花生品種進(jìn)行多態(tài)性分析，篩選出17個(gè)具有多態(tài)性的SSR標(biāo)記。徐志軍等[3]根據(jù)花生栽培種RNA-Seq數(shù)據(jù)，鑒定出19 143個(gè)SSR位點(diǎn)，其中13 477個(gè)SSR位點(diǎn)可用于分子標(biāo)記開發(fā)。

在高通量和低成本測(cè)序技術(shù)的推動(dòng)下，包括測(cè)序基因分型（genotyping-by-sequencing，GBS）、限制性位點(diǎn)關(guān)聯(lián)的 DNA測(cè)序技術(shù)（restriction-site associated DNA，ddRAD-seq）和特異位點(diǎn)擴(kuò)增片段測(cè)序（specific-locus amplified fragment sequencing，SLAF-seq）等簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)也逐漸應(yīng)用到花生分子標(biāo)記的開發(fā)中。有研究[4]對(duì)169份花生核心種質(zhì)進(jìn)行GBS分析，從全基因組水平開發(fā)InDel標(biāo)記，獲得了10 401個(gè)InDel標(biāo)記，并對(duì)其進(jìn)行功能分類和注釋，為進(jìn)一步種質(zhì)遺傳資源研究和分子遺傳改良奠定基礎(chǔ)。Zhou等[5]以花生品種中花 5號(hào)和ICGV86699為親本構(gòu)建重組自交系（recombinant inbred line，RIL）群體，通過分析ddRAD-seq所得的序列，在親本中開發(fā)出53 257個(gè)SNP標(biāo)記，從群體中開發(fā)出14 663個(gè)SNP標(biāo)記。

2 花生遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

花生不同類型分子標(biāo)記的大量開發(fā)，促進(jìn)了高密度花生遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建。Halward等[6]利用野生種群體構(gòu)建了第1張花生屬遺傳圖譜，該圖譜含有117個(gè)RFLP標(biāo)記和11個(gè)連鎖群，總長(zhǎng)度1063cM。Creste等[7]通過二倍體野生種種間雜交和再回交法組建群體，構(gòu)建了含有167個(gè)RAPD標(biāo)記和39個(gè)RFLP標(biāo)記的遺傳圖譜。Milla等[8]也利用二倍體野生種雜交后代群體構(gòu)建了一張含有78個(gè)AFLP標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜。另外，近年栽培種花生的遺傳連鎖圖譜構(gòu)建也取得了很大進(jìn)展。Varshney等[9]利用RIL群體構(gòu)建了首張基于SSR標(biāo)記的栽培種花生遺傳圖譜，Ravi等[10]在該圖譜基礎(chǔ)上又增加了56個(gè)位點(diǎn)，構(gòu)建了包含191個(gè)SSR標(biāo)記的遺傳圖譜，涵蓋22個(gè)連鎖群，全長(zhǎng)1785.4cM，標(biāo)記間平均距離9.3cM。Hong等[11]對(duì)栽培花生的3個(gè)RIL群體進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建，檢測(cè)到175個(gè)多態(tài)性SSR位點(diǎn)，涵蓋22個(gè)連鎖群，全長(zhǎng)885.4cM。Zhou等[5]基于SNP測(cè)序構(gòu)建花生栽培種遺傳圖譜，包括1621個(gè)SNP標(biāo)記和64個(gè)SSR標(biāo)記，涵蓋20個(gè)連鎖群，全長(zhǎng)1446.7cM。Khan等[12]構(gòu)建了具有1975個(gè)SNP位點(diǎn)和5022個(gè)SNP位點(diǎn)的2個(gè)高密度遺傳連鎖圖譜。Agarwal等[13]也開發(fā)了基于SNP標(biāo)記的高密度遺傳圖譜，包括8869個(gè)SNP標(biāo)記，涵蓋20個(gè)連鎖群，全長(zhǎng)3120cM。

3 重要性狀的分子標(biāo)記與QTL定位

鑒定重要性狀連鎖的分子標(biāo)記是標(biāo)記開發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前開發(fā)的花生重要性狀的分子標(biāo)記大多與抗病相關(guān)。夏友霖等[14]以AFLP分析結(jié)合BSA方法篩選到與晚斑病抗性連鎖較緊密的3個(gè)AFLP標(biāo)記，與抗性間的遺傳距離分別為 7.40、7.40和8.67cM。Shoba等[15]和 Sukruth等[16]分別鑒定出 1個(gè)和3個(gè)與晚斑病抗性顯著相關(guān)的SSR標(biāo)記。雷永等[17]采用AFLP技術(shù)和BSA分析方法，獲得了與花生黃曲霉菌侵染抗性連鎖的2個(gè)分子標(biāo)記，與抗性間的遺傳距離分別為 8.8和 6.6cM。任小平等[18]采用AFLP技術(shù)和BSA分析方法，獲得2個(gè)與花生青枯病抗性基因連鎖的分子標(biāo)記，與抗性間的遺傳距離分別為8.12和11.46cM。Herselman等[19]和肖洋等[20]采用BSA法獲得與花生矮化病毒病抗性基因連鎖的AFLP和SSR分子標(biāo)記。黃莉等[21]通過篩選遠(yuǎn)雜9102和中花5號(hào)雜交后代衍生的RIL群體，獲得了2個(gè)與花生含油量相關(guān)的SSR標(biāo)記，其中標(biāo)記2A5-250與低油特性的相關(guān)性為95.0%，標(biāo)記2A5-240與高油特性的相關(guān)性為88.9%。有關(guān)花生關(guān)鍵性狀連鎖標(biāo)記的開發(fā)仍然較少，在一定程度上限制了育種工作中分子標(biāo)記輔助選擇的利用。

花生重要性狀關(guān)聯(lián)的 QTL和候選基因的定位為花生分子育種提供了有力的支撐。在抗病方面，Wang等[22]利用高抗青枯病品種遠(yuǎn)雜9102構(gòu)建RIL群體，在B02染色體定位了4個(gè)與抗青枯病相關(guān)的QTL，其中QTL主效區(qū)域包含21個(gè)NBS-LRR基因。同樣，Luo等[23]基于測(cè)序QTL定位方法（QTL-seq），在B02染色體上定位了1個(gè)與青枯病相關(guān)的QTL，區(qū)間大小為 2.07Mb。在抗葉斑病方面，Agarwal等[13]利用Tifrunner和GT-C20構(gòu)建的RIL群體，定位了7個(gè)與早斑病抗性關(guān)聯(lián)的QTL、3個(gè)與晚斑病關(guān)聯(lián)的QTL和9個(gè)與番茄斑萎病關(guān)聯(lián)的QTL。Shirasawa等[24]利用感病品系 Tag24和抗病品系GPBD4建立RIL群體，分別將晚斑病和銹病關(guān)聯(lián)的候選QTL定位于A02和A03染色體1.4和2.7Mb基因組區(qū)間內(nèi)。Agarwal等[25]利用SunOleic 97R和NC94022構(gòu)建RIL群體，定位了3個(gè)與番茄斑萎病抗性相關(guān)的QTL，其中對(duì)表型變異貢獻(xiàn)率最大的QTL位于89.5kb的物理距離范圍內(nèi)，利用該 QTL連鎖的競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性 PCR（kompetitive allele specific PCR，KASP）標(biāo)記能實(shí)現(xiàn)群體內(nèi)抗病和感病個(gè)體的快速分離。

在產(chǎn)量和品質(zhì)性狀方面，Wang等[26]利用 195份花生材料挖掘出13 435個(gè)高質(zhì)量的SNP位點(diǎn)，通過GWAS分析發(fā)現(xiàn)93個(gè)SNP與4個(gè)產(chǎn)量性狀連鎖。Zhang等[27]采用花育36號(hào)和種質(zhì)系6-3的RIL群體，鑒定出與百粒重、種子長(zhǎng)度和種子寬度等性狀相關(guān)的27個(gè)QTL。Pandey等[28]利用SunOleic 97R×NC94022和 Tifrunner×GT-C20的RIL 群體，分別鑒定出6個(gè)和9個(gè)與控制含油量關(guān)聯(lián)的QTL。Liu等[29]以徐花13和中花6號(hào)的RIL為材料，檢測(cè)到7個(gè)控制含油量的QTL，將位于A08染色體上的主效QTL qOCA08.1定位在0.8Mb的物理區(qū)間內(nèi)，并發(fā)現(xiàn)了2個(gè)調(diào)控油脂合成的基因。

株型和脫殼率等重要農(nóng)藝性狀與花生的產(chǎn)量、抗病性和機(jī)械化收獲息息相關(guān)。Li等[30]以直立型花生品種冀花5號(hào)和匍匐型品種M130的雜交群體為材料，通過SLAF-seq技術(shù)檢測(cè)到39個(gè)與生長(zhǎng)習(xí)性相關(guān)的QTL，其中有12個(gè)QTL在B05號(hào)染色體上0.17Mb的區(qū)間內(nèi)，該區(qū)間多數(shù)基因與光和激素信號(hào)相關(guān)。Luo等[31]利用QTL-seq方法在遠(yuǎn)雜9102和徐州68-4雜交的RIL群體中發(fā)現(xiàn)2個(gè)與調(diào)控脫殼率相關(guān)的QTL，分別位于A09（2.75Mb）和B02（1.1Mb）染色體上，在這2個(gè)區(qū)段上包含9個(gè)與脫殼率相關(guān)的候選基因。

4 利用分子標(biāo)記輔助選擇培育高油酸花生

分子標(biāo)記輔助育種與傳統(tǒng)遺傳育種相結(jié)合能夠加速育種的進(jìn)程。高油酸花生品質(zhì)穩(wěn)定，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，國(guó)內(nèi)多家單位開展花生高油酸分子標(biāo)記輔助育種，是迄今為止花生分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)應(yīng)用到育種中最成功的例子?；ㄉ哂退嵝誀钪饕?個(gè)主效基因FAD2A和FAD2B控制，針對(duì)這2個(gè)主效基因突變位點(diǎn)已經(jīng)開發(fā)的檢測(cè)方法包括CAPS標(biāo)記、KASP標(biāo)記、等位基因特異PCR和PCR產(chǎn)物測(cè)序等[32-34]。趙術(shù)珍等[35]以花育23號(hào)和花育31號(hào)為母本，以高油酸花生品種Sunoleic95R、DF12和開農(nóng)176為父本，利用優(yōu)化的CAPS標(biāo)記和PCR產(chǎn)物測(cè)序法以及FAD2基因KASP檢測(cè)方法，對(duì)自交和回交后代進(jìn)行檢測(cè)，獲得一批高油酸花生材料。Bera等[36]利用分子標(biāo)記輔助回交技術(shù)，將高油酸種質(zhì)SunOleic95R的2個(gè)FAD2突變等位基因?qū)敫哂退峄ㄉN系ICGV06100，輪回親本油酸含量提高 97%，亞油酸含量降低 92%，油酸/亞油酸（O/L）比值增加到 25。潘雷雷等[37]以魯花 11號(hào)為母本、開農(nóng)1715為父本，利用PCR產(chǎn)物測(cè)序法和系譜法篩選出油酸含量 80.40%、亞油酸含量2.50%、O/L比值 32.16的高油酸花生新品種宇花91。以大面積推廣的4個(gè)不同類型花生品種為輪回親本，利用FAD2標(biāo)記輔助回交選擇，定向獲得了24個(gè)穩(wěn)定的高油酸改良材料[38-39]。Chu等[40]利用CAPS標(biāo)記輔助選擇技術(shù)對(duì)線蟲抗性品種 Tifguard油酸含量進(jìn)行改良，育成油酸含量高的抗線蟲新材料。

5 花生轉(zhuǎn)基因研究

近年來，利用基因工程將外源基因?qū)牖ㄉ?，獲得了一些優(yōu)質(zhì)的花生轉(zhuǎn)基因品系，為花生育種和種質(zhì)創(chuàng)新提供了另一個(gè)選擇。目前，用于花生基因轉(zhuǎn)化的主要有油脂合成相關(guān)基因、過敏原基因和抗性基因等。

5.1 油脂合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)化

花生作為重要的油料作物，其脂肪酸含量和種類一直是受關(guān)注的問題。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）在脂肪酸合成過程中起著非常關(guān)鍵的作用。將AhPEPC基因反義表達(dá)載體轉(zhuǎn)入花生，通過抑制花生中AhPEPC基因的表達(dá)，可提高轉(zhuǎn)基因種子含油量 5.7%～10.3%[41]。AtLEC1參與調(diào)節(jié)種子或其他器官中貯藏脂類的生物合成與積累。Tang等[42]利用種胚特異啟動(dòng)子將AtLEC1基因轉(zhuǎn)入花生，轉(zhuǎn)基因花生種子含油量提高4.42%～15.89%，硬脂酸、油酸和亞油酸等脂肪酸含量在不同品系間也發(fā)生了顯著變化。利用種子特異啟動(dòng)子Lectin和組成型啟動(dòng)子CaMV35S構(gòu)建AhFAD2基因的RNAi干擾載體，分別轉(zhuǎn)化豐花1號(hào)和花育23號(hào)獲得轉(zhuǎn)基因花生純合體株系，各轉(zhuǎn)基因株系中AhFAD2基因的轉(zhuǎn)錄水平普遍下調(diào)，后代株系種子的油酸含量顯著提高，豐花1號(hào)和花育23號(hào)的轉(zhuǎn)基因后代分別提高15.09%和36.40%[43]。與組成型啟動(dòng)子CaMV35S相比，Lectin啟動(dòng)子對(duì)AhFAD2基因表達(dá)的抑制效果更明顯。

5.2 過敏原基因的轉(zhuǎn)化

花生是重要的食物過敏原之一，在人體內(nèi)會(huì)引起lgE介導(dǎo)的超敏反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致死亡。通過構(gòu)建花生過敏原基因Arah2的敲除載體，轉(zhuǎn)化花生，使轉(zhuǎn)基因花生種子中Arah2基因表達(dá)量顯著降低，且未檢測(cè)到Arah2蛋白積累[44]。利用基因槍法用Arah2的RNAi載體轉(zhuǎn)化花生，在3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中Arah2的表達(dá)均受到顯著抑制，其中2個(gè)株系中Arah6的表達(dá)也顯著降低[45]。

5.3 抗性基因的轉(zhuǎn)化

在花生抗逆性方面，以抗蟲、抗病、抗旱和抗除草劑基因方面研究較多。將煙草條紋病毒的外殼蛋白基因轉(zhuǎn)入花生，對(duì)轉(zhuǎn)基因純合株系進(jìn)行接種試驗(yàn)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株對(duì)病毒侵染抗性明顯增強(qiáng)[46]。將豇豆胰蛋白抑制劑基因CtPI轉(zhuǎn)入花生，在成熟胚中定向表達(dá)，明顯提高了轉(zhuǎn)基因花生對(duì)棉鈴蟲的抗性[47]。通過轉(zhuǎn)化水稻幾丁質(zhì)酶基因，明顯提高了轉(zhuǎn)基因花生葉片中幾丁質(zhì)酶活性，比對(duì)照花生葉片高2～14倍，使轉(zhuǎn)基因花生葉片獲得對(duì)晚斑病、銹病和黃曲霉的抗性[48]。在抗旱基因方面，脫水響應(yīng)元件轉(zhuǎn)錄因子 DREB是一類可以激活多個(gè)干旱響應(yīng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，可提高作物抗旱性。王旭達(dá)等[49]將耐鹽作物獐毛中的AlDREB2A基因?qū)牖ㄉ?，提高了花生葉片相對(duì)含水量和脯氨酸含量，增強(qiáng)了植株的耐旱性。異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（IPT）是細(xì)胞分裂素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶。Qin等[50]用脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)化花生，轉(zhuǎn)基因花生的耐旱性顯著提高。為了培育抗除草劑品種，Chu等[51]將Bcl-xL基因轉(zhuǎn)入花生后，檢測(cè)出1個(gè)T1代繼續(xù)表達(dá)中等水平BclxL的品系，經(jīng)5μmol/L百草枯處理后的葉綠素水平明顯高于對(duì)照，表現(xiàn)出對(duì)百草枯的耐受性。

6 問題與展望

花生全基因組測(cè)序、分子標(biāo)記開發(fā)、圖譜構(gòu)建、QTL定位及轉(zhuǎn)基因工程等領(lǐng)域的發(fā)展為花生分子育種奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。但與玉米、水稻等主要模式作物相比，花生分子育種研究明顯落后，許多問題亟待進(jìn)一步研究和解決。

6.1 加強(qiáng)與花生關(guān)鍵農(nóng)藝性狀連鎖標(biāo)記的開發(fā)

與花生抗性、產(chǎn)量和品質(zhì)等重要農(nóng)藝性狀連鎖的標(biāo)記數(shù)量少，大大限制了分子標(biāo)記輔助選擇在育種中的應(yīng)用。鑒定評(píng)價(jià)優(yōu)異種質(zhì)資源和突變體材料，解析更多關(guān)鍵農(nóng)藝性狀形成的分子機(jī)理，挖掘有用的基因和QTL，開發(fā)連鎖的分子標(biāo)記，是促進(jìn)花生分子育種的重要支撐。

6.2 提高花生轉(zhuǎn)基因效率

轉(zhuǎn)基因效率低會(huì)影響基因工程改良，限制花生育種工作的發(fā)展。提高花生轉(zhuǎn)基因效率是促進(jìn)基因工程種質(zhì)創(chuàng)新、研究基因功能的基礎(chǔ)。

6.3 加大開發(fā)功能性分子標(biāo)記

隨著全基因組測(cè)序的完成，花生基因組學(xué)和功能基因組學(xué)研究將不斷深入，利用高通量測(cè)序和 SNP芯片技術(shù)對(duì)不同種質(zhì)資源進(jìn)行全面評(píng)價(jià)和解析，發(fā)掘更多有利用價(jià)值的基因和QTL，以及功能性分子標(biāo)記，進(jìn)而促進(jìn)花生分子育種技術(shù)的發(fā)展和完善，分子育種將在花生精準(zhǔn)改良中發(fā)揮更大的作用。