楊鋒 李文雄 康武林 董博 袁普衛(wèi)

陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西高校青年創(chuàng)新團隊，陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712046

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的重要的表觀遺傳學(xué)調(diào)控手段，可多層次調(diào)控基因表達，影響干細胞的多能性和發(fā)育，從而調(diào)控干細胞的分化命運。作者前期研究[1]表明一些補腎中藥能通過DNA甲基化、組蛋白去乙?；缺碛^遺傳學(xué)機制顯著促進成骨相關(guān)基因及蛋白表達。其中，補腎中藥補骨脂的有效組分補骨脂素具有較強的成骨作用，可以誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化。已有研究[2]證實多種lncRNA參與了BMSCs 的成骨分化，lncRNA在調(diào)節(jié)BMSCs增殖與分化方面具有重要作用，與各種骨骼疾病有著密切的關(guān)系。但有關(guān)中藥介導(dǎo)lncRNA調(diào)控BMSCs成骨分化的作用機制報道較少。本研究通過lncRNA芯片、生物信息學(xué)、Real time RT-PCR等技術(shù)篩選出補骨脂素調(diào)控BMSCs成骨分化相關(guān)的lncRNA，為揭示lncRNA在補骨脂素調(diào)控BMSCs成骨分化中的表觀遺傳學(xué)機制奠定基礎(chǔ)，從而進一步促進中醫(yī)“腎主骨”理論的轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取4～6周齡SD大鼠10只，清潔級，雌雄各半，體重(90±10)g，由西安交通大學(xué)實驗動物中心提供(合格證號：61001700000815)。飼養(yǎng)溫度20～25 ℃，相對濕度50 %，全價營養(yǎng)飼料喂養(yǎng)。

1.2 主要試劑及儀器

L-DMEM(Gibco，Invitrogen，USA)、胎牛血清(FBS，Gibco，Invitrogen，USA)、DMSO、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、1-3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、吲哚美辛、胰島素、MTT(Sigma USA)、補骨脂素標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma)、Total RNA提取試劑盒(Promega)、RT-PCRKit(Invitrogen，USA)、mRNA引物(華大基因)、胰蛋白酶(Gibco USA)、CO2孵箱(Thermo，USA)、倒置相差顯微鏡(Olympus)、Bechman Epicx流式細胞儀、水平式電泳儀(Bio-Rad，Hercules，CA)、凝膠成像分析系統(tǒng)(Dolphin DOC，Wealtec，USA)、PCR 儀(Rotor-Gene 3000 Corbett Research，Australia)、酶聯(lián)免疫標(biāo)記儀(Bio-Rad 550)。

1.3 BMSC體外培養(yǎng)與鑒定

經(jīng)戊巴比妥麻醉后，無痛下頸椎脫臼法處死；將大鼠在75 %的乙醇中浸泡5 min，無菌條件下取出股骨和脛骨，切除干骺端軟骨顯露髓腔，用5 mL注射器吸取L-DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗髓腔。10 cm培養(yǎng)皿收集骨髓沖洗液，37 ℃、5 % CO2孵箱培養(yǎng)。每3 d換液1次。第4代培養(yǎng)細胞進行流式細胞儀檢測，結(jié)果顯示細胞均一性較好，其中CD34表達呈陰性，而CD90、CD29表達呈陽性，表達率分別為1.4 %、96.4 %和97.5 %，提示培養(yǎng)所得細胞主要是BMSCs，非造血性細胞。同時，經(jīng)成骨、成脂誘導(dǎo)證實該細胞可以分化為成骨細胞和脂肪細胞。細胞計數(shù)并調(diào)整細胞濃度至5*104/mL，備用。

圖1 BMSCs流式圖Fig.1 Flow cytometry chart of BMSCs

1.4 分組與給藥

細胞分3組，每組6孔，實驗重復(fù)3次。

對照組：L-DMEM，10 %FBS，1 %青霉素、鏈霉素。

成骨誘導(dǎo)組：L-DMEM，20 %胎牛血清，1 %青霉素、鏈霉素，成骨誘導(dǎo)劑(10-8mol/L 地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，0.05 mmol/L L-抗壞血酸)。

補骨脂素組：MTT實驗結(jié)果(見圖2)表明0.01、0.1、1、10 μmol/L均對體外培養(yǎng)的BMSCs具有促進增殖作用，尤以10 μmol/L的作用最為明顯，但當(dāng)濃度達到100 μmol/L時出現(xiàn)毒性反應(yīng)。故后續(xù)實驗選擇10 μmol/L濃度。

圖2 MTT法藥物濃度篩選Fig.2 Drug concentration screen with MTT method

1.5 堿性磷酸酶染色

誘導(dǎo)第4天取一6孔板，PBS清洗2遍，加入固定液，10 min后加入底物，37 ℃水浴15 min，水洗；再加入蘇木精復(fù)染10 min，水洗，晾干后鏡下觀察。

1.6 BMSCs及其誘導(dǎo)成骨分化中的lncRNA表達譜芯片

收集P2代BMSCs，Trizol一步法提取總RNA，用分光光度計定量。取50～100 μg 總RNA用PEG方法分離lncRNA，用T4 RNA連接酶進行熒光標(biāo)記。然后再用無水乙醇沉淀。將熒光標(biāo)記后小分子 RNA 溶于 16 μL雜交液中(15 %甲酰胺、0.2 % SDS、3*SSC、50*Denhardt)，于 42 ℃與Agilent大鼠長鏈非編碼RNA芯片雜交過夜。雜交結(jié)束后，先在 42 ℃左右在含 0.2 % SDS、2*SSC 的液體中漂洗 4 min，然后在 0.2*SSC 液體中室溫漂洗 4 min，甩干。用Agilent DNA Microarray Scanner(G2505C)進行掃描。用Agilent Feature Extraction軟件(v11.0.1.1) 生成芯片圖，并得到原始數(shù)據(jù)。

1.7 芯片分析

使用GeneSpring GX v12.1軟件(Agilent Technologies)對數(shù)據(jù)進行Quantile標(biāo)準(zhǔn)化和數(shù)據(jù)處理。原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后經(jīng)過篩選高質(zhì)量探針(某探針在12個樣品中至少有3個被標(biāo)記為Present或Marginal)進行進一步分析。兩組樣品間具有統(tǒng)計學(xué)意義的差異表達LncRNA或差異表達mRNA通過P-value/FDR篩選。篩選條件為：FDR控制在5 %以內(nèi)，F(xiàn)old change不低于2倍。

1.8 差異性lncRNAs的驗證

選取高表達的差異lncRNAs做PCR驗證。以GAPDH作為看家基因，差異性lncRNA 作為目標(biāo)基因，與芯片結(jié)果進行印證。

1.9 GO分析和Pathway 分析

運用topGo進行差異lncRNA的GO分析，運用KEGG等生物軟件綜合分析長鏈非編碼RNA所參與的分子功能和相關(guān)信號通路。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 補骨脂素對BMSCs堿性磷酸酶的影響

堿性磷酸酶染色顯示補骨脂素組堿性磷酸酶活性較成骨誘導(dǎo)組和對照組明顯增強，見圖3。堿性磷酸酶陽性細胞胞漿呈現(xiàn)淺灰色、灰黑色顆粒沉著，補骨脂素組較成骨誘導(dǎo)組明顯。

圖3 三組細胞堿性磷酸酶染色Fig.3 ALP staining in cells of the three groups

2.2 lncRNA芯片

2.2.1三組細胞LncRNA聚類分析(見圖4)：用lncRNA芯片獲得大鼠BMSCs、成骨誘導(dǎo)及補骨脂素干預(yù)21 d后的lncRNAs表達譜。通過各組兩兩比較，發(fā)現(xiàn)差異倍數(shù)2倍及以上的共446個lncRNAs。在BMSCs成骨分化過程中，共篩選5個lncRNA顯著上調(diào)，4個lncRNA顯著下調(diào)(見表1)。其中XR009483上調(diào)最顯著，而XR007366下調(diào)最顯著。

表1 BMSCs成骨分化差異表達的部分lncRNATable 1 Differential expression of lncRNA in the osteogenic differentiation by BMSCs

圖4 三組細胞LncRNA聚類分析圖Fig.4 Cluster analysis diagram of LncRNA in three groups

2.2.2PCR驗證：選取2個差異表達lncRNA，引物序列見表2，其中1個上調(diào) (XR009483)、1個下調(diào) (XR007366)。Real-time PCR結(jié)果顯示，與對照組比較XR009483顯著上調(diào)(P<0.05)；XR007366顯著下調(diào)(P<0.05)，見表3。Real-time PCR驗證結(jié)果與芯片結(jié)果相符。

表2 lncRNA引物序列Table 2 Primer sequences of lncRNA

表3 Real-time PCR檢測 BMSCs 成骨分化lncRNA 的表達水平Table 3 The expression level of lncRNA in the osteogenic differentiation by BMSCs detected with RT-PCR

2.2.3GO分析和Pathway 分析：經(jīng)差異分析(fold change >2,P<0.001，Q<0.05)得到446個差異基因。將差異基因分別進行GO(P<0.01，F(xiàn)DR<0.01)和pathway分析(P<0.05)，富集得到351個GO term和110條pathway。表4為部分GO富集結(jié)果，表5為差異最顯著的15條pathway。多數(shù)為干細胞成骨分化、骨代謝相關(guān)的功能類群，如：間充質(zhì)干細胞分化、骨骼發(fā)育、膠原合成、骨礦化等。pathway分析多數(shù)為經(jīng)典信號通路。

表4 部分富集度高的GO termTable 4 Highly enriched lncRNAs in GO

表5 部分富集度高的pathwayTable 5 Highly enriched lncRNAs in the pathway analysis

GO分析結(jié)果顯示，在生物學(xué)進程化(biological process，BP)方面，BMSCs成骨分化過程中持續(xù)差異表達mRNA基因中有680個基因富集于生物學(xué)進程，其中富集評分較高的是mesenchymal development、skeletal system development及cartilage development等生物學(xué)進程,含有差異表達基因208個。在細胞組件(cellular component，CC)方面，富集較高的是extracellular space、extracellular matrix、collagen trimer等組件，含有差異表達基因114個。在分子功能(molecular function，MF)方面，BMSCs成骨分化過程中持續(xù)差異表達mRNA基因中有631個基因富集于分子功能，其中富集評分較高的collagen biosynthetic process、bone morphogenesis、ossification及bone remodeling 等分子功能，含有差異表達基因158個。

KEGG分析結(jié)果顯示，BMSCs成骨分化過程中持續(xù)差異表達mRNA基因中有427個基因富集于生物學(xué)通路，并主要富集于15個生物學(xué)通路，其中富集評分較高的是TGF-beta、Wnt、NF-kappa B及Calcium等生物學(xué)通路，含有差異表達基因143個。

續(xù)表5 部分富集度高的pathwayContinued table 5 Highly enriched lncRNAs in the pathway analysis

3 討論

骨創(chuàng)傷、骨壞死、骨質(zhì)疏松、骨腫瘤等引起的骨缺損修復(fù)一直是骨科領(lǐng)域的難題，隨著骨組織工程技術(shù)的發(fā)展，以生物材料與種子細胞的活體移植為代表的組織工程骨修復(fù)骨缺損成為一種全新的治療模式并日益得到廣泛關(guān)注。骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)具有強大的自我增殖能力以及多向分化潛能，能分泌多種生物活性物質(zhì)，包括細胞因子、生長因子等，具有改善微環(huán)境、抑制局部炎癥反應(yīng)等作用，是骨組織工程理想的種子細胞。但BMSCs的成骨活性受微環(huán)境和支架孔隙結(jié)構(gòu)等多因素影響，臨床應(yīng)用受到一定限制。所以，如何維持干細胞的成骨活性成為骨組織工程領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題之一。中醫(yī)藥在“腎主骨”理論指導(dǎo)下應(yīng)用補腎藥物調(diào)節(jié)干細胞微環(huán)境誘導(dǎo)BMSCs的成骨分化，可以增強BMSCs作為種子細胞的成骨活性。補骨脂是常用的補腎壯骨類中藥，我們前期研究[3]發(fā)現(xiàn)補骨脂素明顯上調(diào)β-catenin、Runx2基因的表達水平，多項研究[4-5]表明補腎中藥補骨脂的有效組分補骨脂素具有較強的成骨作用，可以介導(dǎo)Wnt/β-catenin及BMP/Smad信號通路誘導(dǎo)BMSCs成骨分化，是理想的骨組織工程種子細胞成骨分化誘導(dǎo)劑。

長鏈非編碼RNA在BMSCs成骨分化中的研究日漸增多。已有的研究表明lncRNA對干細胞的自我更新和多向分化起到重要的調(diào)控作用。如Takeda等[6]研究發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)在誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中，lncRNA-BORG表達顯著上調(diào)，說明lncRNA-BORG參與間充質(zhì)干細胞的成骨分化。Zhu等[7]發(fā)現(xiàn)lncRNA-ANCR與EZH2相互作用后下調(diào)Runx2的表達，從而抑制間充質(zhì)干細胞的成骨分化。Zuo等[8]研究鼠間充質(zhì)干細胞在早期成骨分化過程中l(wèi)ncRNA的表達譜特征，發(fā)現(xiàn)BMP2處理組與對照組相比，有116個lncRNA差異表達。孫翔等[9]利用Agilent lncRNA 芯片篩選出成骨分化前后差異表達的lncRNA，對lncRNA 鄰近蛋白編碼基因分析表明部分lncRNA(如lncRNA ENST0000058553 7.1 和lncRNA eHIT00001595) 可能在hMSCs 成骨分化過程中發(fā)揮重要作用。羅嘉全等[10]研究發(fā)現(xiàn) lncRNA -AK096529 和uc003ups 可能通過正向調(diào)控Smurf1，減少Runx2 的降解，從而促進hMSCs 的成骨分化。Liao等[11]研究發(fā)現(xiàn)LncRNAH19 可以促進間充質(zhì)干細胞成骨分化。證明了lncRNA在BMSCs成骨分化過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。但有關(guān)lnRNA在中藥調(diào)控BMSCs成骨分化中的機制研究仍然較少。已有的研究僅表明羅漢果苷V可通過促進LncRNA TUG1表達刺激成骨細胞的增殖與分化[12]。鐘梅[13]通過分析lnc RNA在淫羊藿苷(Icariin，ICA)誘導(dǎo)人牙周膜干細胞(human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)成骨分化前后的差異性表達，篩選出與成骨分化密切相關(guān)的lncRNA-p16340和lnc RNA-p21662，它們隨著成骨誘導(dǎo)時間的增加，其表達逐漸成上升趨勢，提示可能與成骨分化的調(diào)控密切相關(guān)。并無文獻報道lnRNA在中藥調(diào)控BMSCs成骨分化中的機制研究。

本研究在前期針對補骨脂素誘導(dǎo)成骨過程中基因甲基化、組蛋白乙?；缺碛^遺傳機制研究的基礎(chǔ)上，通過芯片及生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)在補骨脂誘導(dǎo)BMSCs成骨過程中446個差異表達的lncRNA，通過聚類分析及GO分析和Pathway分析共發(fā)現(xiàn)10個成骨相關(guān)的模塊及其mRNA和15條信號通路?？梢宰鳛檠a骨脂素誘導(dǎo)BMSCs成骨的潛在靶點。其中，與成骨相關(guān)的差異表達lncRNA是后續(xù)研究的重點。結(jié)合上述GO分析和Pathway分析結(jié)果，與BMSCs成骨分化相關(guān)的TGF-beta、Wnt、NF-kappa B、Toll樣受體信號通路及鈣代謝、礦物質(zhì)吸收、凋亡、骨重塑等相關(guān)的信號分子。從中選擇相關(guān)的mRNA和信號通路作為lncRNA表觀調(diào)控機制的切入點，進一步闡明補骨脂素誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的作用機制。

芯片及生物學(xué)信息分析結(jié)果為尋找促進BMSCs成骨分化的表觀遺傳調(diào)控途徑提供了基礎(chǔ)，后續(xù)還需要設(shè)計過表達及沉默LncRNA持續(xù)觀察轉(zhuǎn)染后的間充質(zhì)干細胞增殖分化的情況,以此來鑒定該LncRNA是否能夠影響成骨細胞的分化。并在此基礎(chǔ)上明確中藥及其有效成分的作用靶點，提高 BMSCs 成骨分化能力，為促成骨中藥的研發(fā)提供新的思路。