楊金波，于忠娜，李莉，王釗，于雷*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院，山東 萊陽 265200；2.河北工程大學(xué) 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲 056021)

雛沙門氏菌又稱雞白痢沙門氏菌，主要侵害20日齡以內(nèi)幼雛，引起急性敗血癥，破殼一周內(nèi)的患病雛雞基本上都會(huì)死亡；三周以上的患病雞會(huì)出現(xiàn)呼吸道癥狀，其死亡率下降；日齡較大的雛雞可表現(xiàn)為白痢[1-2]，發(fā)病率、致死率較高;成年雞則主要侵害生殖器官[3]。近年來，由于大量和不合理地使用抗生素，使得雛沙門氏菌耐藥性逐年增加，導(dǎo)致致病菌和體內(nèi)共生菌產(chǎn)生耐藥性[4-5]，況且人類居于食物鏈頂端，動(dòng)植物體內(nèi)殘留的抗生素會(huì)對(duì)人類身體健康有害。所以，尋找高效且無污染的耐藥抑制劑受到了廣泛關(guān)注。中草藥是我國的瑰寶，在抑制細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性方面表現(xiàn)出特殊的效果[6]。中草藥有著許多抗生素所不具備的優(yōu)點(diǎn)，如不易出現(xiàn)殘留、抗藥性及毒副作用等。所以，尋找具有良好耐藥消除作用、無毒副作用或低毒副作用的中草藥抑制劑替代抗生素意義重大。本文選取10種中草藥，采用3種不同方法測定比較中草藥對(duì)雛沙門氏菌的抑制效果，篩選出抑菌效果強(qiáng)的中草藥，為臨床用藥提供參考，同時(shí)為后續(xù)研制中草藥制劑和中草藥飼料添加劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌種

雛沙門氏菌菌種由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海都學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試驗(yàn)藥物

雞矢藤、地骨皮、白頭翁、大青葉、蒲公英、五味子、烏梅、艾葉、黃連、丹參均購自山東省萊陽市棗行藥店。

1.1.3 主要試劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基購自青島市高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司(批號(hào):20180813)。

1.1.4 主要儀器

離心機(jī)(H1650-M)購自長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋(YXQ-LS-50A)購自上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9052)購自浙江托普儀器有限公司；鼓風(fēng)干燥箱(BPG-9040A)購自濟(jì)南炫彩醫(yī)療器械有限公司；超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD)購自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1中藥藥敏片制備

參照文獻(xiàn)[7]，在藥敏片吸收藥物量上略有改動(dòng)。每個(gè)有50片紙片的青霉素瓶內(nèi)加入中藥藥液1 mL(中藥藥液濃度為1 g/mL，以每片吸收0.02 mL計(jì)算藥敏片含藥量)，其余步驟與文獻(xiàn)處理相同。

1.2.2 中藥水提取液的制備

參照文獻(xiàn)[8]，分別稱取15 g單味中草藥，用紗布包裹好放在燒杯中，添加150 mL蒸餾水室溫下浸泡2 h，煮沸后用文火煎煮30 min，然后用8層紗布過濾收取藥液，在藥渣中加入150 mL蒸餾水，重復(fù)2次。集中3次煮出的藥液用蒸發(fā)濃縮至15 mL，使其終濃度為1 g/mL，使用離心機(jī)1000 r/min離心10 min，收集上清液。然后121 ℃滅菌20 min，4 ℃保存，備用。

1.2.3 試驗(yàn)菌的制備

參照文獻(xiàn)[9]把所獲取的菌種接種在SS培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)16～18 h；挑取典型菌落，革蘭染色后顯微鏡1000倍觀察確定菌落，接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，用滅菌生理鹽水稀釋，制成菌液，置4 ℃冰箱中保存，備用。

1.3 體外抑菌試驗(yàn)

1.3.1 瓊脂平板打孔法

參照文獻(xiàn)[9]，重復(fù)3次該試驗(yàn)，為每種藥液的抑菌圈測量直徑，求出3個(gè)平皿抑菌圈直徑的平均值。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑小于10 mm為不敏感，10～15 mm為中度敏感，15 mm以上為高度敏感[10]。

1.3.2 牛津杯法

參照文獻(xiàn)[9-10],加入藥液量時(shí)，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上放5個(gè)牛津杯，注入中草藥藥液0.2 mL，其余步驟與文獻(xiàn)保持一致。重復(fù)3次,觀察結(jié)果求出平均值。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)同1.3.1。

1.3.3 藥敏片法

在超凈工作臺(tái)中，按照操作規(guī)范取制作好的中藥藥敏片10片(保證與前二者試驗(yàn)所加入藥量等同)貼到已涂布好菌液的平皿培養(yǎng)基表面，將平皿培養(yǎng)基置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥物敏感性測定結(jié)果

2.1.1 瓊脂平板打孔法結(jié)果

由圖1可見，6號(hào)五味子、7號(hào)烏梅、9號(hào)黃連出現(xiàn)明顯抑菌圈，其他藥物抑菌圈均不明顯。表1可見，各種中藥對(duì)雛沙門氏菌的敏感性不同，雞矢藤、地骨皮、白頭翁、大青葉、蒲公英、艾葉、丹參對(duì)雛沙門氏菌基本無抑菌效果；烏梅抑菌圈直徑是13.56 mm，黃連的抑菌圈直徑是12.47 mm，二者對(duì)雛沙門氏菌的抑菌效果為中度敏感；五味子對(duì)雛沙門氏菌的抑菌效果最強(qiáng)，抑菌圈直徑達(dá)到16.24 mm，呈高度敏感。

1—雞矢藤；2—地骨皮；3—白頭翁；4—大青葉；5—蒲公英；6—五味子；7—烏梅；8—艾葉；9—黃連；10—丹參。圖1 瓊脂平板打孔法試驗(yàn)結(jié)果Fig. 1 Experimental results of the agar plate-drilling method

表1 10種中草藥瓊脂平板打孔法測定結(jié)果

2.1.2 牛津杯法結(jié)果

由圖2可見，瓊脂平板打孔法與牛津杯法結(jié)果略有不同，6號(hào)五味子、7號(hào)烏梅出現(xiàn)明顯抑菌圈，其他藥物并無抑菌圈。表2可見，雞矢藤、地骨皮、白頭翁、大青葉、蒲公英、艾葉、黃連、丹參對(duì)雛沙門氏菌均無抑菌效果；五味子、烏梅對(duì)雛沙門氏菌的抑菌效果為高度敏感，其中五味子的抑菌圈直徑達(dá)到25.63 mm，對(duì)雛沙門氏菌的抑菌效果最好，烏梅抑菌圈直徑為18.77 mm,效果不如五味子。

1—雞矢藤；2—地骨皮；3—白頭翁；4—大青葉；5—蒲公英；6—五味子；7—烏梅；8—艾葉；9—黃連；10—丹參。圖2 牛津杯法試驗(yàn)結(jié)果Fig. 2 Results of oxford cup

表2 10種中草藥牛津杯法測定的結(jié)果

2.1.3 藥敏片法結(jié)果

由圖3可見，6號(hào)五味子、7號(hào)烏梅出現(xiàn)明顯抑菌圈，其他藥物并無抑菌圈。表3可見，雞矢藤、地骨皮、白頭翁、大青葉、蒲公英、艾葉、黃連對(duì)雛沙門氏菌均無抑菌效果；烏梅對(duì)雛沙門氏菌的抑菌效果為中度敏感，抑菌圈直徑為14.53 mm；五味子對(duì)雛沙門氏菌的抑菌效果為高度敏感，抑菌圈達(dá)到21.42 mm；丹參在3次藥敏片試驗(yàn)中差距較大，平均值為3.25 mm,分析結(jié)果顯示丹參對(duì)雛沙氏門菌抑菌效果一般。

1—雞矢藤；2—地骨皮；3—白頭翁；4—大青葉；5—蒲公英；6—五味子；7—烏梅；8—艾葉；9—黃連；10—丹參。圖3 藥敏片試驗(yàn)結(jié)果Fig. 3 Results of drug-sensitive tablets

表3 10種中草藥藥敏片法測定的結(jié)果

3 討論

3.1 藥物的選取

由于雛沙門氏菌會(huì)造成家禽機(jī)體敗血癥、下痢，所以本試驗(yàn)中選取的10味中草藥針對(duì)這兩種癥狀選取。其中地骨皮、白頭翁屬于清熱涼血藥，對(duì)治療出血癥和血痢有療效；黃連屬于清熱燥濕藥，主治濕熱瀉痢[11]；艾葉屬于溫里藥，但也有止血功能；烏梅與五味子均屬于收澀藥，對(duì)久泄久痢療效顯著，具有澀腸澀精的療效[11]；雞矢藤、蒲公英和大青葉屬于清熱解毒藥，現(xiàn)有研究表明三者中某些成分對(duì)沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有抑制作用[8，11-13]，其中雞矢藤對(duì)胃腸道疾病也有一定效果[14]；丹參也有著很好的抑菌作用[15]。

3.2 中藥體外抑菌試驗(yàn)方法的選擇

關(guān)于體外抑菌試驗(yàn)方法測定有很多種，本試驗(yàn)采取瓊脂平板打孔法、牛津杯法、藥敏片法，這3種方法在試驗(yàn)中表現(xiàn)結(jié)果各有不同。瓊脂平板打孔法優(yōu)點(diǎn)在于每種藥液相互之間不會(huì)接觸污染，但由于細(xì)菌生長在瓊脂表面，所以同等量的藥液相對(duì)于牛津杯法，抑菌效果較差。牛津杯法優(yōu)點(diǎn)在于藥液在細(xì)菌上，對(duì)細(xì)菌的作用更直接，可以更直觀地反映中草藥對(duì)雛沙門氏菌的抑制效果，但牛津杯需要輕放在瓊脂上，按壓過度會(huì)使瓊脂破損，每種藥液相互擴(kuò)散導(dǎo)致試驗(yàn)失??；放置過輕會(huì)導(dǎo)致牛津杯不穩(wěn)容易灑出藥液，致試驗(yàn)失敗。中藥藥敏片法藥片吸收的藥量與前二者相同，但試驗(yàn)結(jié)果表明其藥效較差，分析原因可能藥敏片過薄，吸收藥量有限。通過3種方法的測定比較，我們直觀地發(fā)現(xiàn)烏梅與五味子對(duì)雛沙門氏菌抑制效果良好。

4 結(jié)論

目前防治沙門氏菌病主要依靠抗生素，但臨床上沙門氏菌已經(jīng)產(chǎn)生了比較嚴(yán)重的耐藥性，在治療過程中常常會(huì)選擇多種高敏抗生素對(duì)癥治療[16]。但是抗生素的過度使用會(huì)破壞腸道免疫屏障，引起菌群失調(diào)，形成耐藥菌株，導(dǎo)致疾病的非典型性和混合性感染，從而增加了防治的難度?？股卦谑秤脛?dòng)物體內(nèi)殘留會(huì)增加其耐藥性，直接或間接危害人體健康。同時(shí)向環(huán)境排放過量的抗生素會(huì)刺激環(huán)境中耐藥菌的產(chǎn)生，同時(shí)也嚴(yán)重破壞了環(huán)境的生態(tài)平衡，成為一種新型的環(huán)境污染。我國中草藥不但種類豐富易獲取，而且成本低。與抗生素相比較，中草藥自身就含有多種有效成分，不容易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。在預(yù)防和抗菌的同時(shí)，還能促進(jìn)動(dòng)物體生長，提高免疫力，增強(qiáng)動(dòng)物體對(duì)抗疾病的能力。因此，在解決細(xì)菌抗藥性和動(dòng)物體內(nèi)藥物殘留等方面，中草藥的應(yīng)用將會(huì)取代抗生素，因而成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。本試驗(yàn)通過對(duì)10種中草藥對(duì)雛沙門氏菌的體外抑菌作用的研究，可以看出五味子和烏梅對(duì)雛沙門氏菌的抑菌效果為高度敏感，黃連對(duì)雛沙門氏菌的抑菌效果為中度敏感，丹參對(duì)雛沙門氏菌的抑菌效果為低度敏感，另外6種中草藥都不敏感，表明五味子和烏梅等可以對(duì)雛沙門氏菌起到抗菌效果。后續(xù)將繼續(xù)選取不同中草藥進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，并且會(huì)對(duì)抑菌效果好的中草藥進(jìn)行體外最小抑菌濃度的測定，以期能篩選出具有最佳抑菌效果的藥物。