滕力慶，周濤，王曉，江維克*

(1. 貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550312；2.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 山東省分析測試中心，山東 濟(jì)南 250014)

心肌缺血(myocardial ischemia)是指心臟中血液灌注不足導(dǎo)致其供氧減少及心肌能量代謝異常的一種病理狀態(tài)[1]。多種因素可致心肌缺血，其中較常見的發(fā)病原因為冠狀動脈對心肌的供血、供氧不足[2]。由于心肌缺血發(fā)病病因及機(jī)制的復(fù)雜性，臨床上常采用綜合手段進(jìn)行治療。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)及多通路的協(xié)同調(diào)控作用，在心肌缺血治療中的應(yīng)用逐漸增多。

太子參為石竹科植物孩兒參Pseudostellariaheterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.的干燥塊根，其性甘、微苦，平。歸脾、肺經(jīng)，具有補(bǔ)氣健脾、生津潤肺的功效[3]。2015版《中國藥典》記載太子參具有益氣健脾、生津潤肺的作用[4]?，F(xiàn)代藥理研究表明：太子參多糖具有心肌保護(hù)作用，能夠促進(jìn)氧自由基清除，減輕心肌損傷及預(yù)防心率失常[5]；太子參皂苷可通過抗氧化應(yīng)激及抑制細(xì)胞凋亡保護(hù)心肌細(xì)胞，減輕氧化損傷[6]。

中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，從整體調(diào)控角度分析單味中藥或中藥復(fù)方藥效作用機(jī)制的一種方法[7]。現(xiàn)有研究對太子參抗心肌缺血的機(jī)制僅涉及抗氧化應(yīng)激、抑制心肌細(xì)胞凋亡及促進(jìn)血管新生[8]層面，因此，其具體作用機(jī)制有待深入挖掘。為此，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法探討太子參抗心肌缺血的分子作用機(jī)制，并將其關(guān)鍵靶點(diǎn)與活性成分進(jìn)行分子對接驗證，為太子參抗心肌缺血作用機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 太子參活性成分的篩選及對應(yīng)靶點(diǎn)預(yù)測

以“太子參”為關(guān)鍵詞，通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform， TCMSP)數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)獲取太子參的活性化合物基本信息，利用口服生物利用度(oral bioavailablility，OB)≥30%和藥物類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18進(jìn)行篩選，同時查閱文獻(xiàn)補(bǔ)充未納入的成分。應(yīng)用TCMSP、Pubmed(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)及SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)預(yù)測所得活性成分對應(yīng)的靶蛋白，借助uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將靶點(diǎn)蛋白規(guī)范成相應(yīng)的基因名。

1.2 心肌缺血相關(guān)靶點(diǎn)的檢索及太子參抗心肌缺血關(guān)鍵靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

以“myocardial ischemia”為關(guān)鍵詞，通過檢索Pubmed、ctd(http://ctdbase.org/)、DrugBank(https://www.drugbank.ca/)及Genecards(https://www.genecards.org/)等數(shù)據(jù)庫篩選心肌缺血作用靶點(diǎn)，將所得靶點(diǎn)去除重復(fù)項后獲得心肌缺血相關(guān)靶點(diǎn)。

將1.1節(jié)所得太子參活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)與心肌缺血相關(guān)靶點(diǎn)借助OmicShare(http://www.omicshare.com/tools/)網(wǎng)站取交集，獲取太子參抗心肌缺血的作用靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)通過STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction，PPI)，設(shè)置最小相互作用得分(interaction score >0.7)，獲取太子參抗心肌缺血核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.3 GO功能及Pathway富集分析

將1.2節(jié)所得交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)借助WebGestalt數(shù)據(jù)庫(http://www.webgestalt.org/)進(jìn)行基因本體( gene ontology，GO)功能富集分析，其中GO功能包括細(xì)胞組分(cell component，CC)、生物過程(biological processes，BP)及分子功能(molecular function，MF)。使用Cytoscape軟件中的ClueGo插件對交集靶點(diǎn)進(jìn)行Pathway富集分析，選取基因數(shù)排名前10的通路，通過OmicShare網(wǎng)站繪制氣泡圖。

1.4 分子對接

采用AutoDock Tools 1.5.6軟件對太子參抗心肌缺血關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)中度值(degree)前3的靶點(diǎn)蛋白與入血活性成分進(jìn)行分子對接驗證。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取化合物的三維結(jié)構(gòu)，借助RCSB PDB網(wǎng)站獲取靶點(diǎn)蛋白的三維結(jié)構(gòu)。通過AutoDock Tools對上述蛋白受體和配體進(jìn)行常規(guī)處理，借助其插件Autogrid獲得對接活性位點(diǎn)，進(jìn)行分子對接，獲取化合物與靶點(diǎn)蛋白對接結(jié)合能，使用PyMOL 2.4.0軟件將對接結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 太子參活性成分的篩選及對應(yīng)靶點(diǎn)預(yù)測

共篩選獲得太子參活性成分8個，分別為角鯊烯(Supraene)、刺槐素(Acacetin)、蒙花甙(Linarin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、木犀草素(Luteolin)、蒲公英萜醇(Taraxerol)、仙人掌甾醇(Schottenol)及亞油酸甘油酯(1-Monolinolein)，預(yù)測獲得靶點(diǎn)251個，其活性成分的基本信息見表1。

表1 太子參活性成分基本信息

2.2 心肌缺血相關(guān)靶點(diǎn)的檢索及太子參抗心肌缺血關(guān)鍵靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過檢索Pubmed、CTD、DrugBank及Genecards等數(shù)據(jù)庫獲得心肌缺血相關(guān)靶點(diǎn)548個。

通過Venn軟件將太子參活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)與心肌缺血相關(guān)靶點(diǎn)取交集，獲取太子參抗心肌缺血的作用靶點(diǎn)(圖1)。將交集靶點(diǎn)通過STRING網(wǎng)站構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(圖2)，靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間的關(guān)系達(dá)278條，節(jié)點(diǎn)越大表示其在網(wǎng)絡(luò)中的作用越大。設(shè)置最小相互作用得分，獲得太子參抗心肌缺血核心靶點(diǎn)28個(表2)。將28個核心靶點(diǎn)及與之對應(yīng)的活性成分信息導(dǎo)入Cytoscape軟件中，選擇工具欄下的“NetworkAnalyzer”進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，獲取目標(biāo)基因的度值。其中目標(biāo)基因為節(jié)點(diǎn)，一個節(jié)點(diǎn)的度值表示網(wǎng)絡(luò)中與該節(jié)點(diǎn)相連的全部路線條數(shù)。

表2 太子參抗心肌缺血核心靶點(diǎn)信息表

圖1 太子參活性成分作用靶點(diǎn)與心肌缺血相關(guān)靶點(diǎn)Venn圖Fig.1 Venn diagram of targets of active components of Pseudostellariae Radix and targets related to myocardial ischemia

圖2 太子參抗心肌缺血關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.2 PPI network of key targets of Pseudostellariae Radix against myocardial ischemia

2.3 GO功能及Pathway富集分析

將太子參抗心肌缺血關(guān)鍵靶點(diǎn)借助WEB-based Gene SeT AnaLysis Toolkit進(jìn)行GO富集分析(圖3)，表明太子參抗心肌缺血主要參與細(xì)胞凋亡、血管新生及炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過程，其中BP富集基因數(shù)量較大的有生物調(diào)控、代謝過程、刺激反應(yīng)及多細(xì)胞生物過程；CC富集基因數(shù)量較大的有細(xì)胞核、細(xì)胞膜、腔上包膜及蛋白質(zhì)復(fù)合體；MF富集基因數(shù)量較大的有蛋白質(zhì)結(jié)合、離子結(jié)合、核酸結(jié)合及分子傳遞活性。利用Cytoscape軟件中的ClueGo插件對交集靶點(diǎn)進(jìn)行Pathway富集分析，基因數(shù)排名前10位的信號通路見圖4。太子參抗心肌缺血的通路主要涉及MyD88-independent TLR4 cascade(非依賴MyD88的TLR4信號傳導(dǎo)通路)、MyD88:Mal cascade initiated on plasma membrane(MyD88：質(zhì)膜上啟動的MAL級聯(lián))、Activated TLR4 signalling(激活的TLR4信號通路)、Toll Like Receptor 4 (TLR4) Cascade(Toll樣受體4(TLR4)級聯(lián))及Intrinsic Pathway for Apoptosis(細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑)，相關(guān)基因包括JUN、MAPK1、IKBKG、PTPN11及RELA等。Pathway分析會對每個有差異基因存在的pathway返回一個P值，小的P值表示差異基因在該P(yáng)athway 中出現(xiàn)了富集(表3)。

表3 太子參抗心肌缺血關(guān)鍵靶點(diǎn)Pathway富集分析相關(guān)基因

圖3 太子參抗心肌缺血關(guān)鍵靶點(diǎn)GO富集分析Fig.3 GO enrichment analysis of key targets of Pseudostellariae Radix against myocardial ischemia

圖4 太子參抗心肌缺血關(guān)鍵靶點(diǎn)Pathway富集分析Fig.4 Pathway enrichment analysis of key targets of Pseudostellariae Radix against myocardial ischemia

2.4 分子對接

選取太子參抗心肌缺血關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名前3位的靶點(diǎn)(AKT1、IL6、MAPK1、TP53)與太子參活性化合物進(jìn)行分子對接驗證，結(jié)果見表4。若結(jié)合能小于0，表明配體分子均能和受體蛋白自發(fā)地結(jié)合，結(jié)合能越小對接越好。其中，蒲公英萜醇(Taraxerol)與靶點(diǎn)AKT1、IL6、MAPK1、TP53的結(jié)合性最好，Taraxerol與靶點(diǎn)AKT1、IL6、MAPK1、TP53的最佳復(fù)合結(jié)構(gòu)見圖5。

表4 太子參活性化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)的對接結(jié)合能

圖5 Taraxerol與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對接圖Fig.5 Molecular docking diagram of Taraxerol and key targets

3 討論

中醫(yī)學(xué)中沒有“心肌缺血”這一病名，根據(jù)病位及胸悶、胸痛的臨床表現(xiàn)將其歸為“胸痹”“心悸”等范疇[9]?！稄埵厢t(yī)通·悸》[10]所謂：“夫氣虛者，由陽氣內(nèi)微，心下空虛，內(nèi)動為悸”。心肌缺血發(fā)生時心臟受損，心陽虛衰致臟腑功能、氣機(jī)升降等失調(diào)，導(dǎo)致痰、濕、瘀等病理產(chǎn)物的發(fā)生[11]。因此，心陽虛衰，痰瘀阻絡(luò)為心肌缺血發(fā)生的病因病機(jī)。近年來，心肌缺血的治療多采用中西醫(yī)結(jié)合的治療方法，中藥在改善心肌缺血患者臨床癥狀中起到一定的作用[12]。太子參為補(bǔ)虛藥的代表藥之一，其益氣生津、強(qiáng)心等功效[13]與心肌缺血的病因病機(jī)相符合，使氣充陰旺，血液順暢則無瘀滯之虞[14]?，F(xiàn)代藥理研究表明[15]，太子參可通過抗氧化應(yīng)激、抑制心肌細(xì)胞凋亡及促進(jìn)血管新生等途徑干預(yù)心肌缺血。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法初步揭示太子參活性化合物抗心肌缺血的生物學(xué)過程，預(yù)測獲得太子參抗心肌缺血的作用靶點(diǎn)及信號通路。

本研究結(jié)果顯示，太子參的活性成分8個，對應(yīng)的作用靶點(diǎn)有251個，其中與心肌缺血相同的作用靶點(diǎn)50個。PPI結(jié)果顯示太子參抗心肌缺血的關(guān)鍵靶點(diǎn)為TGFB1、AVPR1A、MMP2、HIF1A、HMOX1、AKT1等。這些關(guān)鍵靶點(diǎn)參與血管系統(tǒng)重塑、血管生成、組織修復(fù)、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程，涉及MyD88-independent TLR4 cascade、MyD88:Mal cascade initiated on plasma membrane、Activated TLR4 signalling、Toll Like Receptor 4 (TLR4) Cascade及Intrinsic Pathway for Apoptosis等通路，這些通路中的相關(guān)基因包括JUN、MAPK1、IKBKG、PTPN11及RELA等。借助分子對接技術(shù)將太子參活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名前3位的靶點(diǎn)(AKT1、IL6、MAPK1、TP53)與太子參活性化合物進(jìn)行分子對接驗證，結(jié)果表明，蒲公英萜醇(Taraxerol)與靶點(diǎn)AKT1、IL6、MAPK1、TP53的結(jié)合性最好。

太子參活性成分中的蒲公英萜醇[16]、木犀草素[17]、β-谷甾醇[18]、刺槐素[19]及蒙花甙[20]均具有保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。其中，蒲公英萜醇通過抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)起到心肌保護(hù)的作用[16]；木犀草素通過下調(diào)TLR4(Toll樣受體4)、MyD88(髓樣分化因子88)、NF-κB(核因子-kappa B)的表達(dá)，起到減輕炎癥反應(yīng)及心臟保護(hù)的作用[17]；β-谷甾醇通過參與ERK1/2 信號通路，上調(diào)Bcl-2基因的表達(dá)，緩解心肌缺血再灌注大鼠的炎癥損傷及抑制其心肌細(xì)胞凋亡[18]；刺槐素通過介導(dǎo)MAPK和PI3K/Akt信號通路，激活PI3K下游靶點(diǎn)24,25Akt，促進(jìn)心肌梗死后血管新生、改善心臟功能及抑制心肌重塑[19]；蒙花甙通過激活Nrf-2起到抗氧化應(yīng)激的作用，從而保護(hù)心肌組織免受局部缺血及其他損傷導(dǎo)致的損害[20]。

在缺血性心臟病中，冠狀動脈再灌注可有效限制心肌梗塞面積，但在這一過程中由于TNF-α(腫瘤壞死因子α)和IL-6(白介素6)被釋放引發(fā)炎癥反應(yīng)損傷心肌組織，會產(chǎn)生局部缺血再灌注損傷[21]。TLR4與心肌損傷密切相關(guān)，在心肌缺血發(fā)生時，激活后的TLR4通過介導(dǎo)MyD88依賴性途徑增強(qiáng)NF-κB的活性，導(dǎo)致IL-1、IL-6、TNF-α等炎性因子的表達(dá)增加從而加重心肌細(xì)胞的損傷，因此，抑制HMGB1-TLR4-MyD88-NF-κB信號通路能夠減輕炎癥反應(yīng)從而保護(hù)心臟組織[22]。關(guān)鍵靶點(diǎn)中HIF1A通過調(diào)控缺氧的適應(yīng)性反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子及誘導(dǎo)AREG(雙調(diào)蛋白)的表達(dá)，起到心臟保護(hù)的作用[23]；MMP2參與血管系統(tǒng)重塑，血管生成及組織修復(fù)等過程[24]。

本文通過相關(guān)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，顯示出太子參抗心肌缺血多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，符合中醫(yī)理論的治病特點(diǎn)，為太子參的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。目前研究報道太子參中其他成分如太子參多糖通過下調(diào)促凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase-3和上調(diào)抑凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)來抑制心肌細(xì)胞的凋亡[5]；太子參環(huán)肽B通過上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF165的表達(dá)，激活MAPK下游的ERK信號傳導(dǎo)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移[8]。本文通過預(yù)測，發(fā)現(xiàn)蒲公英萜醇與抗心肌缺血的關(guān)鍵靶點(diǎn)AKT1、IL6、MAPK1、TP53的結(jié)合性最好，激活MyD88-independent TLR4 cascade、MyD88:Mal cascade initiated on plasma membrane、Activated TLR4 signalling、Toll Like Receptor 4 (TLR4) Cascade及Intrinsic Pathway for Apoptosis等通路抑制心肌細(xì)胞凋亡、減輕炎癥反應(yīng)及促進(jìn)血管新生，其抗心肌缺血作用值得深入研究。然而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)不涉及活性成分之間的協(xié)調(diào)作用及在體內(nèi)的代謝變化過程，因此本研究僅是理論基礎(chǔ)上的預(yù)測，后續(xù)還需通過進(jìn)一步實(shí)驗驗證藥物的藥效作用機(jī)制。