侯林燕，朱鳳妹

（河北科技師范學院食品科技學院，河北秦皇島066600）

β-葡萄糖苷酶（β-D-glucosidase），因其能將結合于非還原性末端的β-D-葡萄糖苷鍵水解，所以也被稱為β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶。它屬于纖維素酶系的一種，能夠水解纖維二糖來減少纖維素水解過程中的可逆限制。該酶可以從微生物和動植物中獲得，比如細菌[1]、真菌[2]、霉菌[3]、水果、龍井茶葉[4-5]、昆蟲[6]等。來源不同的β-葡萄糖苷酶所呈現(xiàn)的蛋白質(zhì)結構存在差異，從而導致β-葡萄糖苷酶的酶學性質(zhì)不同。根據(jù)酶作用底物的糖苷鍵的不同可以將β-葡萄糖苷酶分成只水解烴基-β-葡萄糖苷鍵的酶、只水解芳香基-β-葡萄糖苷鍵的酶和既能水解烴基-β-葡萄糖苷又能水解芳香基-β-葡萄糖苷[7-8]的酶。底物種類的不同與β-葡萄糖苷酶發(fā)生反應時的連接方式也不同。通常采用分子對接了解小分子配體與大分子受體的連接方式[9-11]，分子對接的常用軟件有AutoDock、LeDOCK、MOE Dock 等[12-14]，可視化軟件有MOE[15]、Pymol[16]等。本次試驗采用分子對接了解3 種底物與β-葡萄糖苷酶的連接方式，從分子角度找到兩者結合穩(wěn)定的原因，為β-葡萄糖苷酶結構性質(zhì)的理論研究提供了一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

黑曲霉（Aspergillus niger 3.316）：中國菌種保藏中心；4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl beta-D-glucopyranoside，pNPG）：上海華藍化學科技有限公司；葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）試劑：上海羽朵生物科技有限公司；纖維二糖：MERCK 公司；水楊苷：RHAWN 公司；對硝基苯酚（p-nitrophenol，pNP）：武漢克米克生物醫(yī)藥技術有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 底物與酶的分子對接

在能力最小化基礎上將二維結構轉(zhuǎn)化為三維結構，利用LigX 優(yōu)化靶的質(zhì)子化狀態(tài)和氫的取向，殘基Asp280 附近是結合區(qū)域。AMBER10 ∶EHT 的力場和反應場（R 場）的隱式溶劑化模型用于對接前，采用半柔性對接方式，對位置進行約束，但允許受體口袋的側鏈根據(jù)配體構象移動。側鏈原子束縛到原始位置的重量為10，過渡態(tài)由London dG 評分，對前30 個復合物過渡態(tài)進行力場細化，然后對GBVI/WSA dG 重新評分，結果以MOE 軟件可視化。

1.3 酶活測定方法

DNS 法測定酶活性[17]：配制0.02 mmol/L，pH 4.5 的水楊苷溶液，取2 mL 底物溶液與1 mL 酶液于60 ℃水浴，加入DNS 試劑1.5 mL，沸水浴5 min 終止反應，測定OD540值。將滅活的酶液作為空白對照處理。

pNPG 酶活測定方法[18]：50 μL pNPG 的溶液加入1.5 mL 的pH 4.5 的緩沖液，在60 ℃下預熱10 min。加入500 μL 的酶液，反應10 min，取410 μL 混合液，加入490 μL 的1 mol/L Na2CO3終止反應，測定OD400值。

纖維二糖測定方法[19]：取pH 4.5，濃度為4 mmol/L的纖維二糖溶液70 μL 加入酶液70 μL，于60 ℃下發(fā)生反應，加入2.1 mL 的葡萄糖氧化酶生化分析顯色液，反應10 min，測定OD520值。

1.4 標準曲線的測定

1.4.1 DNS 法葡萄糖標準曲線的測定

測定還原糖采用DNS 比色法，將不同濃度的葡萄糖溶液（mg/mL）在540 nm 波長下測量OD 值。

1.4.2 pNP 標準曲線的測定

測定pNP 采用pNPG 法，將不同濃度的pNP（mmol/L）于400 nm 波長處測量OD 值。

1.4.3 葡萄糖氧化酶法葡萄糖標準曲線的測定

采用葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖標準曲線，將不同濃度的葡萄糖溶液（mg/mL）在500 nm 波長下測量OD 值。

1.5 動力學參數(shù)測定

分別配制不同濃度的底物溶液，其中水楊苷濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mol/L；pNPG 的濃度為1、2、5、7、10 mmol/L；纖維二糖的濃度為1、2、3、4、5 mmol/L；按1.3 酶活測定方法，酶與底物混合液在pH 4.5，溫度為60 ℃條件下反應，每隔2 min，加入各自對應的反應終止劑，分別測定OD540值、OD400值、OD520值。根據(jù)Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖法求3 種底物的動力學參數(shù)。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的測定結果

以葡萄糖濃度作為橫坐標，以吸光度值為縱坐標做標準曲線圖，得到的標準曲線方程為：y=0.431 5x-0.020 8（R2=0.994 4）；以pNP 濃度作為橫坐標，以吸光度值為縱坐標做標準曲線圖，得到的標準曲線方程為：y=6.594 4x-0.002 1（R2=0.998 8）。以葡萄糖濃度為橫坐標，以吸光度值為縱坐標，得到標準曲線方程為：y=0.012x+2.213 6（R2=0.998 7）。

2.2 3 種底物與β-葡萄糖苷酶對接結果

2.2.1 纖維二糖與β-葡萄糖苷酶對接結果

纖維二糖與β-葡萄糖苷酶對接結果見圖1。

圖1 β-葡萄糖苷酶與纖維二糖的對接復合物Fig.1 Complex of β-glucosidase with cellobiose

如圖1A 所示，黑色圈內(nèi)的環(huán)狀結構物為纖維二糖，其余部分為β-葡萄糖苷酶。結果顯示纖維二糖在預定的結構“活性凹槽處”[20]與酶連接。利用MOE 軟件得到兩分子連接的二維結構圖。如圖1B 所示，與纖維二糖對接時，存在3 個氫鍵和3 個H-π 共軛。兩個氫鍵是由纖維二糖作為氫供體與Asp280 側鏈形成的，另一個氫鍵是由纖維二糖作為氫供體與Asp92 形成的。2 個H-π 共軛是Tyr511 同時與纖維二糖形成，另一個由Trp281 與纖維二糖形成。

2.2.2 水楊苷與β-葡萄糖苷酶對接結果

水楊苷與β-葡萄糖苷酶對接結果見圖2。

圖2 β-葡萄糖苷酶與水楊苷的對接復合物Fig.2 Complex of β-glucosidase with salicin

如圖2A 所示，黑色圈內(nèi)的環(huán)狀結構物為水楊苷，其余部分為β-葡萄糖苷酶。結果顯示水楊苷在預定的結構活性凹槽處與酶連接。二維結構如圖2B 可知，在對接時，存在4 個氫鍵，Asp92 作為氫受體與水楊苷相連2 個氫鍵，Asp280 作為氫受體與水楊苷相連1 個氫鍵，Glu509 作為氫受體和Tyr248 作為氫供體與水楊苷上的同一個羥基形成氫鍵。

2.2.3 pNPG 與β-葡萄糖苷酶對接結果

pNPG 與β-葡萄糖苷酶對接結果見圖3。

如圖3A 所示，黑色圈內(nèi)的環(huán)狀結構物為pNPG，其余部分為β-葡萄糖苷酶。結果顯示pNPG 在預定的結構活性凹槽處與酶連接。二維結構如圖3B，在對接時存在4 個氫鍵，Asp92 和Ser451 側鏈與底物不同羥基位點處分別形成一個氫鍵、Glu509 作為氫受體和Tyr248 作為氫供體同時與pNPG 上的羥基形成一個氫鍵。

圖3 β-葡糖苷酶與pNPG 的對接結果Fig.3 Complex of β-glucosidase with pNPG

2.2.4 3 種底物與β-葡萄糖苷酶對接分數(shù)

3 種底物與β-葡萄糖苷酶對接分數(shù)見表1。

表1 3 種底物與β-葡萄糖苷酶的對接分數(shù)Table 1 The docking score of three substrate with β-glucosidase

由表1 可知，纖維二糖的能量分數(shù)最小，在3 種底物與酶復合物中屬于最穩(wěn)定的復合狀態(tài)，也就說明纖維二糖與酶的結合力在三者中最強。結合能量的大小與結合時形成的氫鍵和H-π 共軛有關，其中H-π 共軛即芳香氫鍵在對多肽和蛋白質(zhì)穩(wěn)定方面、提高底物的親和力和催化效率起著重要作用[21]。這可能是纖維二糖較水楊苷和pNPG 作為底物時與酶的復合物相對穩(wěn)定的原因。

2.3 動力學參數(shù)測定

2.3.1 纖維二糖與β-葡萄糖苷酶動力學方程

以纖維二糖為底物時，以底物濃度（S）的倒數(shù)1/[S]作為橫坐標，以反應速度（V）的倒數(shù)1/V 為縱坐標，得到纖維二糖為底物時的動力學方程結果如圖4 所示。

2.3.2 水楊苷與β-葡萄糖苷酶動力學方程

以水楊苷為底物時，根據(jù)Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖，計算所得到的動力學方程結果如圖5 所示。

2.3.3 pNPG 與β-葡萄糖苷酶動力學方程

以pNPG 為底物時，根據(jù)根據(jù)Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖，計算得到的動力學方程結果如圖6 所示。

圖4 纖維二糖的動力學方程Fig.4 Kinetic equation of cellobiose

圖5 水揚苷的動力學方程Fig.5 Kinetic equation of salicin

圖6 pNPG 的動力學方程Fig.6 Kinetic equation of pNPG

根據(jù)3 個方程計算可得，纖維二糖、水楊苷和pNPG 3 種底物所對應的Km分別為5.567、5.820、1.527 mmol/L，則Km最小的為pNPG，這表明酶對pNPG 的親和力明顯高于酶對纖維二糖和水楊苷的親和力；最大反應速率由高到低依次為66.138、8.886 和1.013 μmol/（min·mg），則酶與纖維二糖為底物時的最大反應速率是酶與水楊苷和酶與pNPG 最大反應速率的7.44 倍和65.28倍；纖維二糖、水楊苷和pNPG 3 種底物所對應的催化效率分別為14.728、2.068 和0.377，這表明當以纖維二糖為底物時有最大的催化效率，且分別是以水楊苷和pNPG 為底物時的7.12 倍和39.07倍。

3 結論與討論

本研究采用分子對接將3 種β-葡萄糖苷酶的底物與該酶進行對接，從三維結構上初步了解β-葡萄糖苷酶與底物分子接觸發(fā)生反應時的連接方式，并通過動力學參數(shù)進行了試驗驗證。結果發(fā)現(xiàn)3 種底物均在β-葡萄糖苷酶的凹槽處進行了對接，其中在與水楊苷和pNPG 對接時，活性位點相鄰的Ser451、Tyr248、Asp92 和Asp98 會與底物形成氫鍵網(wǎng)絡。有的一個氨基酸與底物的兩個位點結合生成氫鍵，有的兩個氨基酸側鏈與底物的一個位點同時生成氫鍵，產(chǎn)生這樣的結果可能與不同氨基酸所帶電荷數(shù)以及所形成氫鍵類型有關[22-25]；在與纖維二糖對接時，除氨基酸與底物形成的3 個氫鍵外，生成了3 個H-π 共軛，由于陽離子-π 能夠增強周圍形成氫鍵的氨基酸側鏈的成鍵能力[26]，進而影響了酶的催化效率和反應速率。

通過對β-葡萄糖苷酶進行動力學參數(shù)分析可知，pNPG 最接近β-葡萄糖苷酶天然底物，纖維二糖為底物時，復合物結構最為穩(wěn)定，催化效率以及反應速率也最高，這結果符合上述分子對接結果。本次試驗結果找到了β-葡萄糖苷酶的最適底物，并從分子方面解釋了底物與酶復合物連接的方式，同時通過試驗驗證了分子對接的可靠性，為以后β-葡萄糖苷酶的分子改造提供了設計方法與試驗基礎。