鞏性濤 王 培 肖理文 宋永泉 徐 秀 趙 皖

(1 山東省糧油檢測中心 250101)(2 南京微測生物科技有限公司 210000)

黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1簡寫為AFB1)是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?，含有一個(gè)雙呋喃環(huán)和一個(gè)氧雜萘鄰?fù)?香豆素)，具有強(qiáng)致癌性以及劇毒性，是迄今發(fā)現(xiàn)的各種真菌毒素中最穩(wěn)定的一種。從1993年開始黃曲霉毒素被認(rèn)定為世界衛(wèi)生組織(WHO)癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定的一類致癌物，是世界公認(rèn)的三大強(qiáng)致癌物質(zhì)之一，而黃曲霉毒素B1由于毒性最大，污染最重，是危害最大的一種黃曲霉毒素[1]。

黃曲霉毒素B1污染的食物主要是花生、玉米、稻谷、小麥、花生油等糧油食品，且以南方高溫、高濕地區(qū)受污染最為嚴(yán)重，北方黃淮地區(qū)特別是玉米、小麥、花生污染程度上升尤為明顯[2]?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》(GB 2761-2011)中對(duì)糧食谷物及其制品中黃曲霉毒素B1的最高限量為20 μg/kg，《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 13078-2001)中對(duì)不同種類的飼料中黃曲霉毒素B1的最高限量標(biāo)準(zhǔn)從10 μg/kg～50 μg/kg不等。

目前，國標(biāo)法測定黃曲霉毒素B1采用HPLC法，需要大型的儀器設(shè)備，價(jià)格昂貴，操作過程復(fù)雜、時(shí)間較長，且無法在現(xiàn)場和基層小型實(shí)驗(yàn)室使用。除此之外，也有采用黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫試劑盒或膠體金快速檢測試紙卡用于大量樣品的篩查，操作簡便，檢測快速，成本也較低，但準(zhǔn)確性和重復(fù)性較差，容易造成假陽性或者假陰性，國外同類進(jìn)口設(shè)備和試劑條準(zhǔn)確性和重復(fù)性雖然有所提高，但成本高，糧油收儲(chǔ)、糧食加工和飼料企業(yè)難以接受。為此，山東糧油檢測中心與南京微測生物科技有限公司對(duì)基于熒光定量免疫層析平臺(tái)的黃曲霉毒素B1熒光定量快速檢測試紙卡進(jìn)行了產(chǎn)品的進(jìn)一步優(yōu)化升級(jí)，使之操作簡單、準(zhǔn)確性和重復(fù)性較高，且使用成本較進(jìn)口降低30%，能更好滿足不同客戶的日常檢測需求，確保糧食和食品安全。

1 材料和方法

1.1 試劑和材料

除注明外，均為分析純，試驗(yàn)用水均為國標(biāo)一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)蒸餾水。

黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙卡由乳膠墊、NC膜、樣品墊及吸收墊組成，乳膠墊上包裹有熒光微球標(biāo)記黃曲霉毒素B1抗體；NC膜上噴涂有黃曲霉毒素B1抗原的檢測線和噴涂有羊抗兔二抗的控制線。樣品提取液、樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)曲線ID卡及標(biāo)準(zhǔn)曲線條形碼均為上海生產(chǎn)。黃曲霉毒素B1的標(biāo)準(zhǔn)品：購自Sigma公司；大米、玉米、小麥、面粉等樣品從超市購得或從企業(yè)獲得。麩皮，小麥、面粉等飼料樣品從糧食加工和收儲(chǔ)企業(yè)獲得。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-600型熒光免疫定量分析儀和FD-2000型試紙卡恒溫孵育器：上海生產(chǎn)；低速離心機(jī)：上海生產(chǎn)；漩渦混勻器：海門生產(chǎn)；電子天平：Sartorius。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的前處理 取具有代表性的待測樣品500 g，用粉碎機(jī)粉碎1 min后過20目篩，收集過篩后的均勻細(xì)小樣品。稱取過篩后的樣品5.0 g±0.02 g于50 mL離心管中，加入25 mL提取液，用漩渦混勻器振蕩5 min(或者搖床振蕩5 min)后，4000RPM離心2 min。

1.3.2 檢測過程 取100 μL離心上清液加入500 μL 樣品稀釋液中，用漩渦混勻器混勻3 s～5 s，然后取100 μL加入到黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙卡的加樣孔中，置于37℃恒溫孵育器中溫育8 min，8 min后將試紙卡插入熒光免疫定量分析儀中讀數(shù)，讀數(shù)值即為樣品的實(shí)際檢測濃度。當(dāng)檢測值大于75 μg/kg時(shí)，可將離心上清液稀釋5倍后再進(jìn)行檢測，所得讀數(shù)值乘以對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為最終的檢驗(yàn)結(jié)果。

1.3.3 試紙卡原理 當(dāng)將待測樣品滴加在試紙卡加樣區(qū)時(shí)，樣品中的黃曲霉毒素B1與結(jié)合墊中熒光微球標(biāo)記的黃曲霉毒素B1抗體結(jié)合并通過毛細(xì)作用向前層析，到達(dá)檢測區(qū)后，檢測線T線上固定的黃曲霉毒素B1抗原與剩余未結(jié)合的熒光微球標(biāo)記黃曲霉毒素B1抗體結(jié)合。檢測線T線上結(jié)合的熒光微球標(biāo)記抗體的量與樣品中待測物的量成反比，質(zhì)控線C線結(jié)合的熒光標(biāo)記物與樣品中待測物的量無關(guān)，剩余或其它熒光標(biāo)記物繼續(xù)層析達(dá)到吸收區(qū)。反應(yīng)結(jié)束后，使用熒光定量快速檢測儀讀取T線和C線的熒光強(qiáng)度并計(jì)算T/C值，通過儀器內(nèi)置的標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出樣品中黃曲霉毒素B1的含量。

1.3.4 試紙卡優(yōu)化 在單T線的基礎(chǔ)上，增加1條矯正T線，形成質(zhì)控線C線1條、檢測線T線2條的方式。

2 結(jié)果分析

2.1 黃曲霉毒素B1試紙卡檢測線數(shù)量由兩線優(yōu)化成三線的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選用國標(biāo)法測定黃曲霉毒素B1濃度值為空白的樣本中分別添加黃曲霉毒素B1的濃度為2.5 μg/kg、5 μg/kg、10 μg/kg、25 μg/kg、50 μg/kg，然后按照黃曲霉毒素B1試紙卡檢測方法同時(shí)進(jìn)行兩線及三線試紙卡檢測，每個(gè)加標(biāo)樣本各檢測2個(gè)平行樣，對(duì)比試紙卡靈敏度，檢測結(jié)果見表1；選取高、中、低3個(gè)加標(biāo)濃度點(diǎn)，每個(gè)加標(biāo)樣本檢測6個(gè)平行樣，檢測對(duì)比試紙卡的重復(fù)性，檢測結(jié)果見表2。

表1 黃曲霉毒素B1兩線與三線試紙卡的靈敏度 (單位：μg/kg)

表2 黃曲霉毒素B1兩線與三線試紙卡的重復(fù)性 (濃度單位：μg/kg)

從表1可知，黃曲霉毒素B1三線試紙卡的2.5 μg/kg檢測靈敏度為22.03%；兩線試紙卡的2.5 μg/kg檢測靈敏度為16.39%；從單一2.5 μg/kg濃度點(diǎn)檢測靈敏度對(duì)比，三線試紙卡靈敏度更高；且綜合對(duì)比不同濃度的檢測靈敏度，也得出黃曲霉毒素B1三線試紙卡靈敏度較兩線試紙卡更高。從樣本加標(biāo)檢測靈敏度對(duì)比，可選黃曲霉毒素B1三線試紙卡。

從表2可知，篩選高、中、低三個(gè)濃度點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)性檢測，黃曲霉毒素B1三線試紙卡檢測變異系數(shù)CV范圍為4.26%～8.11%；兩線試紙卡檢測變異系數(shù)CV范圍為7.50%～11.25%；對(duì)比三線試紙卡與兩線試紙卡的檢測變異系數(shù)CV范圍，三線試紙卡檢測變異系數(shù)CV范圍更小，重復(fù)性更高；從樣本加標(biāo)檢測重復(fù)性對(duì)比，可選黃曲霉毒素B1三線試紙卡。

綜合黃曲霉毒素B1三線試紙卡與兩線試紙卡的靈敏度與重復(fù)性對(duì)比，選擇黃曲霉毒素B1三線試紙卡。

2.2 選用檢測線數(shù)量為三線的黃曲霉毒素B1試紙卡進(jìn)行產(chǎn)品性能檢測

2.2.1 黃曲霉毒素B1試紙卡檢出限及定量限實(shí)驗(yàn)結(jié)果 選用國標(biāo)法測定黃曲霉毒素B1濃度值為空白的樣本20份，然后按照黃曲霉毒素B1試紙卡檢測方法進(jìn)行檢測，每個(gè)樣本檢測1個(gè)試紙卡。檢測結(jié)果見表3。

由表3中檢測數(shù)據(jù)分析可知：黃曲霉毒素B1試紙卡的檢出限為0.4 μg/kg；定量限為0.983 μg/kg。

2.2.2 黃曲霉毒素B1試紙卡的檢測范圍的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 選用國標(biāo)法測定黃曲霉毒素B1濃度值為空白的樣本中分別添加黃曲霉毒素B1的濃度為1 μg/kg、2.5 μg/kg、5 μg/kg、10 μg/kg、25 μg/kg、50 μg/kg、75 μg/kg，然后按照黃曲霉毒素B1試紙卡檢測方法進(jìn)行檢測，每個(gè)加標(biāo)樣本各檢測2個(gè)平行樣。檢測結(jié)果見表4。

通過表4的檢測數(shù)據(jù)可知，在空白樣本中添加黃曲霉毒素B1的濃度為1 μg/kg時(shí)，檢測靈敏度為10.41%，與空白樣本檢測存在梯度差；陰性樣本加標(biāo)濃度從1 μg/kg～75 μg/kg時(shí)，檢測靈敏度范圍為10.41%～95.07%，且不同濃度點(diǎn)檢測抑制率分散率較好，故黃曲霉毒素B1可定量檢測范圍為1 μg/kg～75 μg/kg。

表4 黃曲霉毒素B1試紙卡的檢測范圍 (單位：μg/kg)

2.2.3 黃曲霉毒素B1試紙卡的準(zhǔn)確度和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 選用國標(biāo)法測定黃曲霉毒素B1濃度值為空白的樣本中分別添加黃曲霉毒素B1濃度為1 μg/kg、2.5 μg/kg、5 μg/kg、10 μg/kg、25 μg/kg、50 μg/kg、75 μg/kg，然后按照黃曲霉毒素B1熒光定量試紙卡的檢測方法進(jìn)行檢測，每個(gè)加標(biāo)樣本各檢測3個(gè)平行樣。檢測結(jié)果見表5。

通過表5可知，大米樣本的加標(biāo)回收率為88.34%～103.17%；玉米樣本的加標(biāo)回收率為85.72%～109.09%；小麥樣本的加標(biāo)回收率為95.40%～117.53%；綜合三種不同基質(zhì)樣本加標(biāo)檢測回收率范圍為85.72%～117.53%，說明樣本加標(biāo)檢測回收率高，黃曲霉毒素B1試紙卡檢測準(zhǔn)確度較高。

表5 黃曲霉毒素B1試紙卡的準(zhǔn)確度和重復(fù)性 (單位：μg/kg)

大米樣本的變異系數(shù)CV范圍為0.64%～10.81%；玉米樣本的重變異系數(shù)CV范圍為3.29%～11.25%，小麥樣本的變異系數(shù)CV范圍為2.19%～11.58%；綜合三種不同基質(zhì)樣本加標(biāo)檢測變異系數(shù)CV范圍為0.64%～11.58%，說明黃曲霉毒素B1試紙卡整體變異系數(shù)CV較小，試紙卡重復(fù)性較好。

2.2.4 黃曲霉毒素B1試紙卡穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 黃曲霉毒素B1檢測在2℃～10℃環(huán)境下，并在每個(gè)月固定日期進(jìn)行樣本檢測，篩選固定不同基質(zhì)已知不同濃度值樣本(拜發(fā)質(zhì)控物)用于試紙卡穩(wěn)定性檢測，每個(gè)樣本檢測1個(gè)試紙卡，檢測結(jié)果見表6。

表6 黃曲霉毒素B1試紙卡的穩(wěn)定性

通過表6數(shù)據(jù)可知，黃曲霉毒素B1試紙卡在2℃～10℃保存8個(gè)月，不同基質(zhì)樣本的檢測偏差范圍為4.92%～10.82%，說明黃曲霉毒素B1試紙卡在正常溫度8個(gè)月的保存整體偏差在10%以內(nèi)，說明產(chǎn)品穩(wěn)定性較好。

2.3 利用黃曲霉毒素B1試紙卡測定儀器的穩(wěn)定性與臺(tái)間差

2.3.1 采用一臺(tái)儀器設(shè)備，每小時(shí)測定固定值樣本濃度，連續(xù)測定12次，以該方法12 h測定數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差和極差是否超過標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的重復(fù)性要求來考察設(shè)備穩(wěn)定性。檢測結(jié)果見表7。

通過表7的計(jì)算分析可知，該儀器測定的穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)差和極差均沒有查過標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的重復(fù)性要求，儀器穩(wěn)定性好。

表7 儀器的穩(wěn)定性

2.3.2 兩臺(tái)設(shè)備分別對(duì)6個(gè)濃度梯度的玉米樣本進(jìn)行雙試驗(yàn)檢測，采用配對(duì)t檢驗(yàn)法比較兩臺(tái)儀器的檢測結(jié)果是否存在顯著差異。檢測結(jié)果見表8。

表8 儀器的臺(tái)間差 (單位：μg/kg)

由表8的分析數(shù)據(jù)可知，td=0.43，查t分布表，t0.05,5=2.5706，td

2.4 設(shè)備與產(chǎn)品優(yōu)化后進(jìn)行玉米粉中黃曲霉毒素B1不同單位驗(yàn)證檢測

通過表8～表16的計(jì)算分析可知，驗(yàn)證單位1、驗(yàn)證單位2、驗(yàn)證單位3三家驗(yàn)證單位檢測結(jié)果平均值也符合國家標(biāo)準(zhǔn)適用性要求，說明設(shè)備與產(chǎn)品穩(wěn)定性較好。

表9 檢出限與定量限：玉米基質(zhì) (單位：μg/kg)

表10 濃度水平1準(zhǔn)確性結(jié)果：玉米基質(zhì) (單位：μg/kg)

表11 濃度水平2準(zhǔn)確性結(jié)果：玉米基質(zhì) (單位：μg/kg)

表12 濃度水平3準(zhǔn)確性結(jié)果：玉米基質(zhì) (單位：μg/kg)

表13 濃度水平1臺(tái)間差結(jié)果：玉米基質(zhì) (單位：μg/kg)

表14 濃度水平2臺(tái)間差結(jié)果：玉米基質(zhì) (單位：μg/kg)

表15 濃度水平3臺(tái)間差結(jié)果：玉米基質(zhì) (單位：μg/kg)

表16 濃度水平2重復(fù)性結(jié)果：玉米基質(zhì) (單位：μg/kg)

2.5 優(yōu)化試紙卡與其他產(chǎn)品檢測對(duì)比

通過表17中優(yōu)化產(chǎn)品同國外知名品牌產(chǎn)品對(duì)同一樣本檢測數(shù)據(jù)對(duì)比，從CV與回收率數(shù)據(jù)分析，優(yōu)化產(chǎn)品檢測效果優(yōu)于進(jìn)口產(chǎn)品，說明可以取代進(jìn)口產(chǎn)品。

表17 優(yōu)化產(chǎn)品與進(jìn)口產(chǎn)品黃曲霉毒素B1質(zhì)控品檢測結(jié)果 (單位：μg/kg)

3 結(jié)論

從黃曲霉毒素?zé)晒舛吭嚰埧ㄈ€與兩線的靈敏度、不同濃度點(diǎn)梯度與重復(fù)性等的檢測數(shù)據(jù)對(duì)比可知，三線試紙卡靈敏度更高；不同濃度點(diǎn)分布更合理，且三線試紙卡檢測變異系數(shù)CV范圍更小，重復(fù)性更高。且通過對(duì)三線試紙卡檢測限、檢測范圍、不同基質(zhì)樣本重復(fù)、穩(wěn)定性等檢測驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可知，優(yōu)化后三線試紙卡的準(zhǔn)確度、重復(fù)性、穩(wěn)定性等均達(dá)到更優(yōu)的效果，更能滿足檢測需求。另外熒光定量分析儀根據(jù)重復(fù)性要求，儀器穩(wěn)定性好且兩臺(tái)設(shè)備的測定結(jié)果之間不存在顯著性差異。

綜上所述，普通免疫層析快檢產(chǎn)品通常采用單檢測線(T線)定量方法，產(chǎn)品研發(fā)周期更短，生產(chǎn)工藝更為簡單，成本也更低，但檢測結(jié)果的精密度難以控制，導(dǎo)致結(jié)果的重復(fù)性較差。黃曲霉毒素B1熒光定量快速檢測試紙卡在單T線的基礎(chǔ)上，增加一條矯正T線，與質(zhì)控線(C線)一起，形成“雙保險(xiǎn)”，大大提升了檢測結(jié)果的精密度和重復(fù)性。