閆軍 周高晉

復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響乳腺癌病人預(yù)后的重要因素，其中自噬發(fā)揮重要的作用[1]。研究表明，乳腺癌組織中Beclin 1高表達(dá)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)[2]。unc-51-like kinase1(ULk1)是自噬體形成的關(guān)鍵蛋白，ULk1蛋白陽性是乳腺癌復(fù)發(fā)的保護(hù)因素[3]。線粒體融合蛋白2(Mfn2)可調(diào)控線粒體融合、轉(zhuǎn)運(yùn)及線粒體自噬，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4]。研究發(fā)現(xiàn)，Mfn2蛋白在乳腺癌組織中低表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)[5]。本研究檢測了乳腺癌組織中自噬相關(guān)基因、Beclin 1、ULk1及Mfn2基因的表達(dá)與復(fù)發(fā)的關(guān)系。

對象與方法

一、對象

2013年12月～2015年6月收治的乳腺癌根治手術(shù)病人100例。均明確診斷，術(shù)前未行放化療、內(nèi)分泌治療，臨床資料完整，該研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批號：2013-015)。排除合并其他器官腫瘤，嚴(yán)重精神疾病，合并嚴(yán)重的心肝腎疾病。病人均為女性，年齡30～74歲，中位年齡(45.34±8.23)歲；病理類型：浸潤性導(dǎo)管癌84例，浸潤性小葉癌6例，其他10例；分期：ⅡA 6例，ⅡB 52例，Ⅲ 42例；組織學(xué)分級：Ⅰ級24例、Ⅱ級36例、Ⅲ級40例；術(shù)后化療周期：>6個72例；≤6個28例；接受內(nèi)分泌治療病人64例。病人隨訪5年，根據(jù)是否復(fù)發(fā)分為復(fù)發(fā)組(37例)和未復(fù)發(fā)組(63例)。37例復(fù)發(fā)病例中局部復(fù)發(fā)11例，區(qū)域復(fù)發(fā)19例，局部+區(qū)域復(fù)發(fā)7例。

二、方法

1.外周血單個核細(xì)胞(PBMC)分離：病人術(shù)前空腹抽取肘靜脈血4 ml，加入同體積的淋巴細(xì)胞分離液，以300×g離心25分鐘后可發(fā)現(xiàn)離心后管內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞分層，中上層之間乳白色液面即為單個核細(xì)胞層，采用毛細(xì)吸管將該層細(xì)胞移入另一離心管，加入Hanks液清洗后保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 復(fù)發(fā)組及未復(fù)發(fā)組病人Atg5、Atg9、Beclin 1、ULk1及Mfn2 mRNA表達(dá)量比較

表3 乳腺癌復(fù)發(fā)的影響因素Logistic回歸分析

2.Atg5、Atg9、Beclin 1、ULk1及Mfn2基因水平檢測：采用RT-PCR法。Trizol溶液裂解PBMC，提取總RNA，檢測RNA質(zhì)量，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列見表1。隨后進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件：94 ℃ 5分鐘；94 ℃ 30秒，56 ℃ 30秒，72 ℃ 30秒，30個循環(huán)，72 ℃延伸10分鐘。每個樣本均3個重復(fù)，GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法評估目的基因的相對水平。以2倍差異為閾值判斷基因是否顯著差異表達(dá)。表達(dá)倍數(shù)變化為≤2標(biāo)本定義為低表達(dá)，表達(dá)倍數(shù)變化>2的標(biāo)本定義為高表達(dá)。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

表1 Atg5、Atg9、Beclin 1、ULk1及Mfn2引物序列

結(jié)果

1.Atg5、Atg9、Beclin 1、ULk1及Mfn2 mRNA在復(fù)發(fā)組及未復(fù)發(fā)組病人PBMC中的表達(dá)見表2。復(fù)發(fā)組Atg5 mRNA表達(dá)量高于未復(fù)發(fā)組，Atg9、Beclin 1、ULk1及Mfn2 mRNA表達(dá)量低于未復(fù)發(fā)組素(P<0.05)。

2.影響乳腺癌病人復(fù)發(fā)的Logistic回歸分析見表3。結(jié)果表明，臨床Ⅲ期、組織學(xué)分級Ⅲ級、Atg9、Beclin 1、ULk1、Mfn2低表達(dá)是乳腺癌病人復(fù)發(fā)的危險因素，Atg5低表達(dá)是乳腺癌病人復(fù)發(fā)的保護(hù)因素(P<0.05)。

討論

Atg5可與Atg12、Atg16形成復(fù)合物，促進(jìn)前自噬體膜的延伸和擴(kuò)展，進(jìn)而激活自噬[6]。研究發(fā)現(xiàn)，Atg5在消化道腫瘤組織中低表達(dá)，與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)[7]。Atg9是Atg家族中唯一的跨膜蛋白，缺失或下調(diào)Atg9基因的細(xì)胞自噬過程停滯。張雪梅等[8]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞中Atg9低表達(dá)，與乳腺癌惡性病理特征密切相關(guān)。

Beclin1蛋白是啟動自噬的蛋白，與PI3K形成結(jié)合體，調(diào)控Atg蛋白的位置，進(jìn)而加速自噬體的形成。有研究發(fā)現(xiàn)，人乳腺癌組織中Beclin1蛋白低表達(dá)，Beclin 1上調(diào)的MCF-7細(xì)胞增殖能力降低，侵襲性乳腺導(dǎo)管癌組織中Beclin 1基因低表達(dá)[9]。因此，Beclin1 基因可能是一個潛在的乳腺癌抑制基因。

ULk1是調(diào)控自噬的重要因子，可通過正向調(diào)控自噬，抑制腫瘤組織血管生成，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移[10]。韓赫林等[11]研究發(fā)現(xiàn)，ULk1蛋白低表達(dá)是乳腺癌復(fù)發(fā)的危險因素之一。還有研究發(fā)現(xiàn)，通過藥物抑制ULk1蛋白后，腫瘤細(xì)胞的增殖能力明顯升高[12]。

本研究結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)組病人Atg9、Beclin1及ULk1 mRNA表達(dá)水平低于未復(fù)發(fā)組，Atg5 mRNA表達(dá)水平高于未復(fù)發(fā)組。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，Atg9、Beclin 1、ULk1低表達(dá)是乳腺癌病人復(fù)發(fā)的危險因素，Atg5低表達(dá)是乳腺癌病人復(fù)發(fā)的保護(hù)因素。提示自噬在乳腺癌的復(fù)發(fā)中可能起到一定的作用。自噬相關(guān)因子在乳腺癌復(fù)發(fā)中的作用如下：(1)上述因子抑制了腫瘤細(xì)胞的凋亡，使得癌細(xì)胞免于死亡；(2)上述基因的異常表達(dá)參與了乳腺癌的惡性表型的分子機(jī)制；(3)在癌細(xì)胞與自噬相關(guān)信號之間起到橋梁作用，使腫瘤細(xì)胞開始自噬過程，延長腫瘤細(xì)胞的生存時間。

Mfn2在調(diào)控線粒體融合、維持線粒體正常形態(tài)中起作用，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體自噬，腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等。研究發(fā)現(xiàn)，Mfn2在乳腺癌組織中低表達(dá)[13]，水平越低的乳腺癌病人，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)會越大，提示Mfn2與乳腺癌發(fā)展、進(jìn)展有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)組病人Mfn2基因表達(dá)水平低于未復(fù)發(fā)組，Mfn2基因低表達(dá)是乳腺癌病人復(fù)發(fā)的危險因素。提示Mfn2與乳腺癌病人的復(fù)發(fā)有關(guān)。

綜上所述，乳腺癌中Atg 9、Beclin 1、ULk1及Mfn2 mRNA低表達(dá)，Atg5 mRNA高表達(dá)， 是乳腺癌病人復(fù)發(fā)的危險因素，Atg5低表達(dá)是乳腺癌病人復(fù)發(fā)的保護(hù)因素。本研究樣本量較少，尚待進(jìn)一步多中心、多病例分析，評估各指標(biāo)改變的臨床意義。