郭思慧，向雪萍，匡婷，康佳文，陳曉艷，符曉華，張勇，李樂(lè)賽

根據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)，估計(jì)有60.4萬(wàn)宮頸癌新發(fā)病例和34.2萬(wàn)死亡病例，宮頸癌是導(dǎo)致女性死亡的第4大惡性腫瘤，尤其在發(fā)展中國(guó)家，宮頸癌是女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]。在主要的組織學(xué)類(lèi)型中，宮頸鱗癌占宮頸癌75%～80%，臨床上宮頸鱗癌患者通過(guò)治療取得一定療效[2]，但仍有35%患者在初次治療后發(fā)生復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移/未控而導(dǎo)致預(yù)后差[3]。盡管可通過(guò)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期和腫瘤病理特征反映患者嚴(yán)重程度并判斷患者預(yù)后，但準(zhǔn)確率不高[4]，研究人員積極探索評(píng)估宮頸鱗癌預(yù)后的生物標(biāo)志物，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和p53等。但目前臨床尚無(wú)公認(rèn)的用于評(píng)估預(yù)后的分子標(biāo)志物。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)C-X-C基因序趨化因子配體8（C-X-C motif chemokine ligand 8，CXCL8）和和甲基固醇單加氧酶 1（methylsterol monooxygenase 1，MSMO1）與宮頸鱗癌預(yù)后相關(guān)，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法驗(yàn)證CXCL8和MSMO1基因在宮頸鱗癌細(xì)胞中高表達(dá)以及CCK-8法檢測(cè)MSMO1基因?qū)m頸鱗癌細(xì)胞的增殖影響，為尋找宮頸鱗癌患者預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物提供進(jìn)一步的研究思路和線索。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和試劑

宮頸鱗癌細(xì)胞系Siha以及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）HUVE-12購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶購(gòu)自以色列Bioind公司，Lipo6000?轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司；TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；CXCL8基因、MSMO1基因、內(nèi)參照GAPDH基因引物和攜帶特異性針對(duì)MSMO1基因的siRNA以及陰性對(duì)照（negative control，NC）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

細(xì)胞培養(yǎng)箱（3110型）為美國(guó)Thermo Electron公司產(chǎn)品，倒置光學(xué)顯微鏡（CX41型）為日本Olympus公司產(chǎn)品，電泳儀、PCR儀（CFX96 Touch型）和免疫酶標(biāo)檢測(cè)儀（Synergy型）均為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品，凝膠成像儀（TANON-5000型）為上海天能科技公司產(chǎn)品。

1.2 微陣列數(shù)據(jù)

在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）GEO數(shù)據(jù)庫(kù)檢索宮頸鱗癌相關(guān)基因芯片。檢索詞為“（cervical）or（cervix）”和“（cancer）or（tumor）”，限制研究類(lèi)型為Expression profiling by array，限制種屬為Homo sapiens。納入標(biāo)準(zhǔn)：數(shù)據(jù)集包含正常對(duì)照（normal）和宮頸鱗癌（cancer）；Affymetrix基因表達(dá)譜芯片，平臺(tái)為GPL96。

最終納入2個(gè)數(shù)據(jù)集GSE7803和GSE9750。GSE7803包含10個(gè)正常樣本和21個(gè)宮頸鱗癌樣本[5]。GSE9750包含24個(gè)正常樣本和33個(gè)宮頸鱗癌樣本[6]。使用R軟件ggpubr和ggthemes包對(duì)2個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）以及ggplot2包繪制火山圖展示差異表達(dá)基因分析結(jié)果。在癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)下載304例宮頸鱗癌樣本和3例正常樣本相應(yīng)的臨床資料。本研究流程圖如圖1所示。

1.3 差異表達(dá)基因篩選及分析

利用GEO2R篩選差異表達(dá)基因（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）。差異表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05且|Log2FC|≥1（fold change，F(xiàn)C）。通過(guò)venn圖篩選2組數(shù)據(jù)集重疊的差異表達(dá)基因。利用DAVID（The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery）對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，其中GO分析包括生物過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能3個(gè)部分，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)STRING揭示差異基因編碼蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。利用cytoscape軟件的cytohubba插件篩選關(guān)鍵基因。采用Cytohubba計(jì)算網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的11種拓?fù)浞治龇椒ǎx取每種方法分?jǐn)?shù)排名前10的基因，組成Hub基因集。

1.4 Hub基因分析

利用基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫(kù)分析Hub基因在正常組織和宮頸鱗癌中的表達(dá)水平以及預(yù)后關(guān)系。利用人蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（human protein atlas，HPA）分析Hub基因在正常宮頸組織和宮頸癌中的蛋白表達(dá)水平。使用R語(yǔ)言軟件分析TCGA宮頸鱗癌臨床數(shù)據(jù)中Hub基因?qū)颊叩念A(yù)后價(jià)值。對(duì)Hub基因進(jìn)行基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA），進(jìn)一步探索基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之間的關(guān)系及基因功能和意義。

1.5 單因素和多因素COX風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載304例宮頸鱗癌基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)和臨床資料，分別取CXCL8和MSMO1表達(dá)量的截?cái)嘀捣譃楦弑磉_(dá)組和低表達(dá)組。用χ2檢驗(yàn)分析CXCL8和MSMO1表達(dá)與宮頸鱗癌患者臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性，單因素和多因素COX風(fēng)險(xiǎn)回歸模型檢驗(yàn)預(yù)后相關(guān)因素。

1.6 隨機(jī)森林模型構(gòu)建及驗(yàn)證

通過(guò)構(gòu)建隨機(jī)森林模型來(lái)預(yù)測(cè)患者預(yù)后。采用R軟件讀取CXCL8和MSMO1基因表達(dá)數(shù)據(jù)集及TCGA臨床樣本數(shù)據(jù)304例。使用隨機(jī)函數(shù)，將基因表達(dá)數(shù)據(jù)集按1∶1隨機(jī)分為訓(xùn)練組和驗(yàn)證組，用于隨機(jī)森林模型的構(gòu)建和驗(yàn)證。調(diào)用randomForest包構(gòu)建隨機(jī)森林模型，計(jì)算CXCL8和MSMO1基因的重要程度，其中參數(shù)ntree＝500表示使用500棵決策樹(shù)模型用于隨機(jī)森林的分類(lèi)。應(yīng)用predict和ggboxplot函數(shù)將訓(xùn)練組和驗(yàn)證組的數(shù)據(jù)納入構(gòu)建的隨機(jī)森林模型中，計(jì)算預(yù)測(cè)值并繪制箱型圖。應(yīng)用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）和曲線下面積（area under curve，AUC）評(píng)估預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確性。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)Siha細(xì)胞中CXCL8和MSMO1 mRNA的表達(dá)水平

收集細(xì)胞，用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，加入引物以及適量cDNA，以GAPDH基因作為內(nèi)參照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃ 30 s、95 ℃變性10 s、63 ℃退火30 s、返回95 ℃ 10 s，共39個(gè)循環(huán)；65～95 ℃，每0.5 ℃5 s梯度遞增；終止反應(yīng)。以2-△△Ct值表示目的基因mRNA的表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)組為宮頸鱗癌Siha細(xì)胞，對(duì)照組為HUVE-12細(xì)胞。

CXCL8基因上游引物序列為5’-AACTGAG AGTGATTGAGAGTGG-3’，下游引物序列為5’-ATGAATTCTCAGCCCTCTTCAA-3’；MSMO1基因上游引物序列為5’-GTTCATCA TGAGTTTCAGGCTC-3'，下游引物序列為5’-TACATGATCACACAAAAGCACG-3’；GAPDH基因上游引物序列為5’-CTGCCAAC GTGTCAGTGGTG-3’，下游引物序列為5’-TC AGTGTAGCCCAGGATGCC-3’。

1.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將特異性針對(duì)MSMO1基因的siRNA（siMSMO1）瞬時(shí)轉(zhuǎn)入人宮頸鱗癌Siha細(xì)胞，轉(zhuǎn)染流程參閱試劑盒來(lái)源公司提供的操作流程。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（siNC）、siMSMO1-1組、siMSMO1-2組和siMSMO1-3組。轉(zhuǎn)入siMSMO148h后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，實(shí)驗(yàn)流程同1.7節(jié)。siMSMO1-1正義鏈序列為5’-GCAUAGACUCUUACACCACAATT-3’，反義序列鏈為5’-UUGUGGUGUAAGAGUCUA UGCTT-3’；siMSMO1-2正義鏈序列為5’-CU CUCAGUAUAAUGCCUAUAATT-3’，反義鏈序列為5’-UUAUAGGCAUUAUACUGAGAGTT；siMSMO1-3正義鏈序列為5’-AUGGGUGACC AUUCGUUUAUUTT-3’，正義鏈序列為5’-AAUAAACGAAUGGUCACCCAUTT-3’；siNC正義鏈序列為5’-UUCUCCGAACGUGUC ACGUTT-3’，反義鏈序列為5’-ACGUGACA CGUUCGGAGAATT-3’。

1.9 CCK-8法檢測(cè)

分別于siNC、siMSMO1-1、siMSMO1-2和siMSMO1-3轉(zhuǎn)入Siha細(xì)胞24、48和72 h時(shí)，加入含10% CCK-8溶液的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)各孔的D值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有統(tǒng)計(jì)分析采用R（4.0）和GraghPad Prism 8進(jìn)行。利用R軟件獲得各基因的最佳截?cái)嘀岛蜕媲€。用χ2檢驗(yàn)分析Hub基因表達(dá)與宮頸鱗癌臨床因素的相關(guān)性。進(jìn)行單因素和多因素COX風(fēng)險(xiǎn)回歸分析模型選擇獨(dú)立預(yù)后因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因篩選

對(duì)GSE7803（圖2A）和GSE9750（圖2B）數(shù)據(jù)集進(jìn)行PCA分析，結(jié)果顯示2組數(shù)據(jù)集的樣品組間差異明顯，表明數(shù)據(jù)質(zhì)量好，可進(jìn)行下一步差異分析。

GSE7803數(shù)據(jù)集中共有878個(gè)差異表達(dá)的基因，其中有488個(gè)為表達(dá)上調(diào)的基因，390個(gè)為表達(dá)下調(diào)的基因（圖2C）；GSE9750數(shù)據(jù)集共有2 470個(gè)差異基因，其中有548個(gè)為表達(dá)上調(diào)的基因，1 922個(gè)為表達(dá)下調(diào)的基因（圖2D）。利用venn圖分別將2組數(shù)據(jù)集的上、下調(diào)差異基因取交集，獲得上調(diào)差異基因集和下調(diào)差異基因集，篩選出表達(dá)上調(diào)的基因245個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因334個(gè)，結(jié)果如圖2E和圖2F所示。

2.2 GO和KEGG通路富集分析

GO分析結(jié)果（圖3）顯示，差異表達(dá)基因主要參與RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、細(xì)胞復(fù)制、細(xì)胞分裂和細(xì)胞增殖等生物過(guò)程。差異表達(dá)基因的細(xì)胞組成包括外泌體、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、核漿和細(xì)胞膜等。在分子功能方面，差異表達(dá)基因主要富集于蛋白結(jié)合、染色體結(jié)合、染色體二聚體化和同蛋白結(jié)合等。KEGG分析結(jié)果（表1）顯示，差異表達(dá)基因主要富集在腫瘤、細(xì)胞周期、人類(lèi)嗜T細(xì)胞病毒類(lèi)型Ⅰ（human T-cell leukemia virus type-Ⅰ，HTLV-Ⅰ）感染和腫瘤中的微RNA（microRNA，miRNA）等10條通路中。GO和KEGG分析結(jié)果表明，細(xì)胞增殖和分裂的變化在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程中扮演重要角色。

表1 前10差異基因KEGG富集通路Table 1 Top 10 differential gene kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) enrichment pathway

Fig.2 Principal component analysis (PCA) analysis graph of GSE7803 and GSE9750 data sets (A-B),the volcano diagram (B-C) and venn diagram (E-F) with up-regulated differential genes and the volcano diagram and venn diagram with down-regulated differentially expressed genes.圖2 GSE7803和GSE9750數(shù)據(jù)集的PCA分析圖（A和B）、上調(diào)和下調(diào)差異基因的火山圖（C和D）以及venn圖（E和F）

Fig.3 Gene ontology (GO) analysis of Hub genes:biological process (A),cell composition (B) and molecular function (C).圖3 差異表達(dá)基因GO分析結(jié)果生物過(guò)程（A）、細(xì)胞組成（B）和分子功能（C）

2.3 蛋白-蛋白網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network，PPI）分析和關(guān)鍵基因篩選

通過(guò)Cytohubba插件的11種計(jì)算方法，篩選出58個(gè)關(guān)鍵基因。關(guān)鍵基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)如圖4所示。GEPIA在線工具分析結(jié)果顯示，其中10個(gè)關(guān)鍵基因在宮頸鱗癌中的表達(dá)與患者的預(yù)后顯著相關(guān)；其中CXCL8（P＝3.4×10-5）、MSMO1（P＝4.6×10-3）、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα（topoisomeraseⅡα，TOP2A）（P＝0.031）、微小染色體維持蛋白2（minichromosome maintenance protein，MCM2）（P＝0.01）、細(xì)胞分裂周期45（cell division cycle 45，CDC45）（P＝0.038）、載脂蛋白C1（apolipoprotein C1，APOC1）（P＝0.049）、GINS復(fù)合物亞基2（GINS complex subunit 2，GINS2）（P＝0.037）和增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）（P＝0.023）等8個(gè)基因在宮頸鱗癌中表達(dá)上調(diào)，胰島素樣生長(zhǎng)因子1（insulin like growth factor 1，IGF1）（P＝0.029）和Jun原癌基因（Jun protooncogene，JUN）（P＝0.029）這2個(gè)基因在宮頸鱗癌中表達(dá)下調(diào)。

Fig.4 Protein-protein interaction network (PPI) of hub genes.圖4 Hub基因的PPI

生存分析結(jié)果（圖5A）顯示，CXCL8和MSMO1基因高表達(dá)宮頸鱗癌患者的總生存期（overall survival，OS）較低表達(dá)者明顯縮短（P＝1.5×10-5和P＝0.037），提示CXCL8和MSMO1基因高表達(dá)可能與宮頸鱗癌患者的不良預(yù)后相關(guān)?；赥CGA的數(shù)據(jù)分析結(jié)果（圖5B）顯示，與正常組織比較，CXCL8和MSMO1基因在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)明顯升高。通過(guò)HPA數(shù)據(jù)庫(kù)檢索免疫組織化學(xué)檢測(cè)標(biāo)本，獲得宮頸正常組織標(biāo)本3例，宮頸鱗癌標(biāo)本11例；免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果（圖5C）顯示，宮頸正常組織標(biāo)本中均未檢測(cè)到MSMO1蛋白的表達(dá)，宮頸鱗癌組織中2例MSMO1蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性（https://www.proteinatlas.org/ENSG00000052802-MSMO1/pathology/cervical+cancer#ihc）（所有結(jié)果均已獲得原出版單位授權(quán)）。

Fig.5 Correlation between C-X-C motif chemokine ligand 8 (CXCL8) and methylsterol monooxygenase 1 (MSMO1) gene expression levels and prognosis of patients with cervical squamous carcinoma (A),CXCL8 and MSMO1 gene expression levels in normal and cervical cancer tissues (B) and MSMO1 protein expression in normal and cervical cancer tissue was detected by immunohistochemistry (DAB staining).圖5 CXCL8和MSMO1基因表達(dá)水平與宮頸鱗癌患者預(yù)后的相關(guān)性（A），CXCL8和MSMO1基因在正常組織和宮頸癌組織中的表達(dá)水平（B）以及MSMO1蛋白在正常組織和宮頸癌組織中的表達(dá)水平

2.4 CXCL8和MSMO1 mRNA表達(dá)與宮頸鱗癌臨床相關(guān)因素分析及GSEA富集分析

對(duì)304例宮頸鱗癌患者的臨床病理特征分析結(jié)果（表2）顯示，CXCL8和MSMO1表達(dá)水平與患者的年齡（P＝0.045和P＝0.013）以及OS期（P＝0.015和P＜0.001）均有明顯的相關(guān)性。

表2 CXCL8和MSMO1 mRNA表達(dá)與宮頸鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系Table 2 Correlations between the chemokine C-X-C motif ligand 8 (CXCL8) and methylsterol monooxygenase 1(MSMO1) mRNA expression and clinicopathological factors of patients with cervical squamous cancern (%)

TCGA-CESC臨床數(shù)據(jù)的單變量和多變量COX回歸分析結(jié)果（表3）顯示，腫瘤患者是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、CXCL8和MSMO1基因的表達(dá)水平與宮頸鱗癌患者的OS相關(guān)（P均＜0.05）。GSEA富集分析結(jié)果（圖6）顯示，CXCL8基因主要富集于23條通路（P＜0.05），其中小細(xì)胞肺癌、腎細(xì)胞癌和NOD樣受體信號(hào)等通路與癌癥相關(guān)；MSMO1基因主要富集于29條通路（P＜0.05），其中，抗原處理和呈遞、細(xì)胞黏附分子、移植物抗宿主和原發(fā)性免疫缺陷等通路明顯與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。

表3 影響宮頸癌OS期的單因素和多因素分析結(jié)果Table 3 The results of univariate and multifactorial analyses affecting overall survival (OS) of cervical cancer

Fig.6 Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) enrichment analysis of chemokine(C-X-C motif) ligand 8(CXCL8) (A) and methylsterol monooxygenase 1 (MSMO1) gene (B).圖6 CXCL8（A）和MSMO1基因（B）的GSEA富集分析圖

2.5 隨機(jī)森林模型構(gòu)建結(jié)果

對(duì)CXCL8和MSMO1進(jìn)行森林模型構(gòu)建，計(jì)算臨床數(shù)據(jù)中每個(gè)基因的重要程度，并利用varImpPlot函數(shù)進(jìn)行可視化（圖7）。將訓(xùn)練組數(shù)據(jù)納入構(gòu)建好的森林模型中，結(jié)果（圖8A）顯示在生存組和死亡組中，患者的預(yù)測(cè)評(píng)分存在明顯差異（P＜0.05）。同樣的，將驗(yàn)證組的臨床信息納入模型，結(jié)果同樣顯示該模型可以預(yù)測(cè)宮頸鱗癌患者的生存和死亡狀態(tài)（P＜0.05）。本模型中，訓(xùn)練組預(yù)測(cè)結(jié)果的ROC曲線下面積（area under the curve，AUC）＝1.00，驗(yàn)證組的AUC＝0.71，說(shuō)明模型預(yù)測(cè)能力較好（圖8B）。

Fig.7 The importance of chemokine C-X-C motif chemokine ligand 8 (CXCL8) (A) and methylsterol monooxygenase 1 (MSMO1) gene in the random forest model.The horizontal axis refers to increase in node purity,the higher the value,the greater the importance of the gene,the vertical axis were the genes.圖7 隨機(jī)森林模型中CXCL8和MSMO1基因的重要性

Fig.8 Box diagram and receiver operating characteristic (ROC) curve of model verification results.A:Box plot of the prediction results of the training group and the validation group;B:ROC curve of the model in the training group and the validation group.圖8 訓(xùn)練組和驗(yàn)證組的模型驗(yàn)證結(jié)果[箱型圖（A）及ROC曲線（B）]

2.6 Siha細(xì)胞中CXCL8和MSMO1 mRNA高表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果（圖9）顯示，CXCL8 mRNA在Siha細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量為9.15±2.58，明顯高于HUVE-12細(xì)胞中的1.00±0.00，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。MSMO1 mRNA在Siha細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量為2.53±0.61，明顯高于HUVE-12細(xì)胞中的1.00±0.00，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。

Fig.9 The expression levels of C-X-C motif chemokine ligand 8 (CXCL8) and methylsterol monooxygenase 1 (MSMO1) mRNA in cervical squamous cell carcinoma Siha cells and human umbilical vein endothelial HUVE-12 cells were detected by real-time fluorescent quantitative PCR (n=3).圖9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)MSMO1和CXCL8 mRNA在宮頸鱗癌Siha和人臍靜脈內(nèi)皮HUVE-12細(xì)胞中的表達(dá)水平

2.5 敲低MSMO1基因表達(dá)對(duì)Siha細(xì)胞增殖的影響

為了探討MSMO1基因?qū)θ藢m頸鱗癌Siha細(xì)胞增殖的影響，分別轉(zhuǎn)入siMSMO1-1、siMSMO1-2和siMSMO1-3沉默Siha細(xì)胞中MSMO1基因的表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)結(jié)果（圖10A）顯示，轉(zhuǎn)入siMSMO1 48 h后，siMSMO1-1、siMSMO1-2和siMSMO1-3均能明顯下調(diào)MSMO1 mRNA的表達(dá)水平（P均＜0.000 1）。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果（圖10B）顯示，采用siMSMO1-1、siMSMO1-2和siMSMO1-3沉默MSMO1基因表達(dá)后，Siha細(xì)胞的增殖能力被明顯抑制（P＜0.05）。

Fig.10 The expression level of methylsterol monooxygenase 1 (MSMO1) mRNA in Siha cells transfected with siMSMO1-1,siMSMO1-2 and siMSMO1-3 were detected by real-time fluorescent quantitative PCR(A).The proliferation of Siha cells were detected by CCK-8 method (B).Siha cells were transfected with siNC as the control group.**P ＜ 0.01,****P ＜ 0.000 1,vs siNC group (n=3).圖10 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)入siMSMO1對(duì)Siha細(xì)胞中MSMO1 mRNA表達(dá)水平的影響（A）并采用CCK-8法檢測(cè)沉默MSMO1基因表達(dá)對(duì)Siha細(xì)胞增殖能力的影響（B）

3 討論

宮頸癌是發(fā)展中國(guó)家最常見(jiàn)的婦科腫瘤。盡管應(yīng)用宮頸癌篩查和多種臨床治療手段，其臨床治療效果及預(yù)后得到改善，但仍存在一些難治或復(fù)發(fā)患者，復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者五年生存率僅為30%[7]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CXCL8和MSMO1基因?qū)m頸鱗癌患者預(yù)后判斷具有重要價(jià)值。

CXCL8是一種促炎癥趨化因子，在胃癌[8]、結(jié)直腸癌[9]、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌[10]和其他腫瘤中高表達(dá)，能夠刺激中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞發(fā)生顆粒釋放和氧化。本研究發(fā)現(xiàn)，CXCL8在宮頸鱗癌細(xì)胞和組織中過(guò)表達(dá)，且過(guò)表達(dá)CXCL8的患者預(yù)后更差。有研究報(bào)道，CXCL8過(guò)表達(dá)促進(jìn)宮頸癌的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移，是宮頸癌患者預(yù)后差的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[11-12]，本研究結(jié)果與之相同。CXCL8與腫瘤的炎癥、免疫反應(yīng)和血管新生生成密切相關(guān)[13]。這也與本文在KEGG分析方面的結(jié)果相似，即CXCL8富集于腫瘤和趨化因子信號(hào)通路。ZHANG等[14]在體內(nèi)外研究中均發(fā)現(xiàn)，CXCL8過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、克隆形成和血管生成。以上結(jié)果提示，CXCL8在宮頸癌中發(fā)揮促癌基因作用，其過(guò)表達(dá)是宮頸癌患者預(yù)后不良因子。目前關(guān)于CXCL8在宮頸癌中的機(jī)制研究相對(duì)全面，本文未進(jìn)行后續(xù)分析，需要未來(lái)深入探討。

MSMO1編碼甲基甾醇單加氧酶1催化膽固醇合成途徑中C4-甲基固醇的去甲基化。本研究通過(guò)GSEA富集分析發(fā)現(xiàn)MSMO1主要富集于類(lèi)固醇合成、萜類(lèi)生物合成和不飽和脂肪酸合成等通路。KEGG分析發(fā)現(xiàn)，MSMO1基因涉及細(xì)胞增殖、抗原處理和呈遞、細(xì)胞黏附分子和原發(fā)性免疫缺陷等通路。既往也有研究發(fā)現(xiàn)，MSMO1在高密度脂蛋白膽固醇生物合成、能量代謝和胰島素水平異常中發(fā)揮作用[15]。在肝癌細(xì)胞中，miR-23a和miR-23b下調(diào)MSMO1導(dǎo)致肝癌糖異生、固醇和膽固醇代謝發(fā)生異常[16]。目前，僅有少量研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中膽固醇含量高于正常宮頸組織，且癌癥患者總生存率隨著血清中膽固醇濃度增高而降低[17]。為了進(jìn)一步證實(shí)MSMO1在宮頸癌中的作用，本研究通過(guò)分析TCGA臨床數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)MSMO1高表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后差密切相關(guān)，免疫組織化學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR證實(shí)MSMO1在宮頸癌組織和鱗癌細(xì)胞中高表達(dá)，敲低MSMO1表達(dá)可以抑制Siha細(xì)胞的增殖能力。綜上所述，MSMO1基因在宮頸鱗癌組織和細(xì)胞中過(guò)表達(dá)可能與患者不良的臨床結(jié)局相關(guān)，MSMO1基因具有促進(jìn)宮頸鱗癌Siha細(xì)胞增殖能力的作用，可能是評(píng)估宮頸鱗癌患者預(yù)后的一個(gè)新的分子標(biāo)志物。對(duì)于MSMO1基因在宮頸鱗癌中的作用和功能通路未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，因此MSMO1在宮頸鱗癌中影響及作用機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

本研究存在一定的局限性。生物信息學(xué)計(jì)算方法和數(shù)據(jù)集整合方式不同，可能導(dǎo)致本結(jié)果與其他研究存在差異。另外，生物信息學(xué)分析的結(jié)果需要經(jīng)過(guò)基礎(chǔ)和臨床研究驗(yàn)證才更可靠。因此，在未來(lái)的研究中將在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探索CXCL8和MSMO1基因在宮頸發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制，同時(shí)結(jié)合臨床樣本驗(yàn)證CXCL8和MSMO1基因?qū)δ[瘤患者預(yù)后的判斷作用。