于 洋， 馬成瑤， 黃 東， 張彥龍， 曾偉民

（1.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱150500；2.黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150080）

0 引 言

黑木耳又稱膠耳或樹耳，是擔(dān)子菌中非常珍貴的一種膠體真菌［1］，是中國以及一些亞洲國家最歡迎的食用菌，具有極高的營養(yǎng)價值［2］。黑木耳中含有很多如多糖、黑色素和腺苷等豐富的活性成分，對于黑木耳中含有的大多數(shù)活性成分的特性已有很多報道［3-4］，但對黑木耳凝集素以及相關(guān)特性卻很少有報道。食用菌凝集素是一類普遍存在于真菌中的非免疫來源的糖蛋白或者蛋白質(zhì)［5］。食用菌凝集素能夠通過促進脾臟細胞和淋巴細胞的增生，誘導(dǎo)人和動物體內(nèi)的巨噬細胞分泌多種細胞因子，從而提高機體的免疫力以達到抗腫瘤和抗癌的效果［6］。迄今為止，國內(nèi)對動植物凝集素的免疫作用已經(jīng)進行了廣泛研究［7］，而對于食用菌凝集素的免疫調(diào)節(jié)作用的研究還處于發(fā)展階段。研究表明，從靈芝菌絲體中分離的凝集素不僅對人的淋巴具有免疫抑制作用，還可以抑制幼雌鼠的自身免疫糖尿病，延長鼠類移植皮膚以及脾臟細胞的存活期［7］。草菇凝集素對乳腺瘤細胞815有一定的抑制作用，并且可以延長患病小鼠的壽命，是一種很好的免疫增強劑［8］。雞腿菇凝集素可以增加T細胞數(shù)量，進而調(diào)節(jié)細胞免疫，提高機體抗腫瘤能力［9］。口蘑中分離的凝集素能夠促進巨噬細胞的增殖和抑制白血病細胞的增殖等［10］。

巨噬細胞是一種來源于單核細胞的位于組織內(nèi)的白血球，它是機體固有免疫系統(tǒng)的重要組成成分［11-12］，經(jīng)常以不同形式存在于不同組織的免疫效應(yīng)細胞中［13］。巨噬細胞既參與特異性免疫反應(yīng)，同時又參與非特異性免疫反應(yīng)，并且還是兩者之間的橋梁。巨噬細胞可以分泌很多不同種類的細胞因子，能夠有效地吞噬癌細胞和許多病原微生物［14］。巨噬細胞還具有遞呈抗原的作用，可以將抗原進行加工處理并遞呈給抗原特性T細胞和B細胞［15］。因此，本文選用RAW264.7鼠巨噬細胞作為研究對象，探討黑木耳凝集素對RAW264.7鼠巨噬細胞的影響，以期為黑木耳凝集素在免疫方面的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳由勃利縣食用菌研究所提供，-20℃保存。黑木耳凝集素由黑龍江大學(xué)生化藥物分析實驗室利用硫酸銨沉淀法粗提后，通過親和層析法純化得到，命名為LAA。RAW264.7鼠巨噬細胞委托哈爾濱?；锕举徸灾袊茖W(xué)院細胞庫。

RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；Cell Counting Kit-8購自北京碧云天生物技術(shù)研究所；脂多糖購自美國Sigma公司；中性紅溶液購自北京碧云天生物技術(shù)研究所；吖啶橙購自北京碧云天生物技術(shù)研究所；乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒購自北京碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

3111型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；Imark型酶標儀（美國Bio-Rad公司）；熒光酶標儀（北京原平皓生物技術(shù)有限公司）；Coulter Z2細胞計數(shù)儀（美國Bechman Coulter公司）；DP10型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；BCM-1000型生物凈化工作臺（上海玻璃儀器廠）；Biofuge 22R型高速冷凍離心機（德國Heraeus-Sepatech公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞的培養(yǎng)和處理

選用胎牛血清濃度為10%的RPMI 1460培養(yǎng)基對RAW264.7細胞進行培養(yǎng)，于CO2濃度為5%、溫度為37℃的濕潤培養(yǎng)箱中進行傳代培養(yǎng)。選取處于對數(shù)生長期的RAW264.7巨噬細胞，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次，加入1 mL 0.25%的胰酶處理3 min后，添加RPMI 1460培養(yǎng)基終止消化。重復(fù)輕柔吹打后，收集細胞，用PBS清洗3次，用細胞計數(shù)板進行計數(shù)。根據(jù)實驗所需濃度進行鋪板，以備后續(xù)實驗。

1.3.2 細胞的形態(tài)觀察

當(dāng)RAW264.7細胞鋪滿瓶底面積約80%時，消化細胞，將細胞稀釋至2×105個/孔，接種于96孔板內(nèi)，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜。黑木耳凝集素濃度分別設(shè)置為0、1、5、10、15、25、50、100μg·mL-1，陽性對照孔為1μg·mL-1的LPS，培養(yǎng)24 h。吸盡培養(yǎng)液，倒置顯微鏡鏡檢，拍照。

1.3.3 細胞毒性的檢測

采用乳酸脫氫酶試劑盒來檢測細胞的毒性，將對數(shù)生長期的巨噬細胞稀釋至2×105個/孔后，接種于96孔板內(nèi)，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜。向試驗孔及對照孔中加入不同濃度的黑木耳凝集素，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。到達預(yù)定時間的前1 h，在對照孔中加入LDH釋放液，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)，在96孔板內(nèi)分別加入120μL待測培養(yǎng)液。加入LDH檢測液60μL，避光30 min。用酶標儀檢測OD值，每個樣品重復(fù)測三次，按照公式（1）計算細胞毒性（%）。

1.3.4 細胞增殖活性的檢測

選擇CCK-8法來檢測細胞的增殖活性［16］，試驗設(shè)置調(diào)零孔只加培養(yǎng)基，96孔板的四周加無菌水。當(dāng)RAW264.7細胞鋪滿80%瓶底面積時，消化細胞，將細胞稀釋至2×105個/孔，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜。向試驗孔加入不同濃度的黑木耳凝集素，向?qū)φ湛准尤?μg·mL-1的LPS，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。分別加入CCK-8溶液10μL，孵育2 h。用酶標儀檢測OD值，每個樣品重復(fù)測三次，按照公式（2）計算細胞存活率。

1.3.5 細胞核酸變化的檢測

采用吖啶橙熒光染色法檢測細胞的核酸變化［17］，當(dāng)RAW264.7細胞鋪滿80%瓶底面積時，消化細胞，將細胞稀釋至2×105個/孔后，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜。試驗孔加入不同濃度的黑木耳凝集素，對照孔加入1μg·mL-1的LPS，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。然后，除去含藥培養(yǎng)基，用無菌PBS清洗2～3次。每個處理孔內(nèi)加入無菌4%多聚甲醛，處理15～20 min。除去4%多聚甲醛，用PBS清洗2～3次，每次6 min。每個處理孔內(nèi)加入預(yù)先配制好的無菌0.01%吖啶橙溶液，處理10 min后，用PBS清洗2～3次，每次6 min。核酸熒光強度用熒光酶標儀檢測，每個樣品重復(fù)測三次。

1.3.6 細胞吞噬能力的檢測

采用中性紅檢測法檢測細胞的吞噬能力，試驗設(shè)置調(diào)零孔只加培養(yǎng)基，96孔板的四周加無菌水。當(dāng)RAW264.7細胞鋪滿80%瓶底面積時，消化細胞，將細胞稀釋至2×105個/孔后，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜。向試驗孔加入不同濃度的黑木耳凝集素，對照孔加入1μg·mL-1的LPS，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。每孔分別加入100μL無菌中性紅溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，棄上清液，用無菌PBS清洗2～3次。每孔加入200μL細胞裂解液，37℃溫育3 h。用酶標儀檢測OD值，每個樣品重復(fù)測三次，按公式（3）計算中性紅吞噬率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），各組間采用LSD法進行多重比較檢驗，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAW264.7鼠巨噬細胞的形態(tài)變化

圖1為在倒置顯微鏡放大200倍的狀態(tài)下觀察的RAW264.7鼠巨噬細胞的形態(tài)變化。結(jié)果顯示，圖1（a）未加藥處理組（陰性對照）的細胞形態(tài)為圓形、光亮。加入1μg·mL-1LPS（脂多糖）的處理組（陽性對照）細胞出現(xiàn)了典型的活化后特征，即細胞體積增大，細胞形態(tài)變?yōu)槎噙呅位蜷L梭形，如圖1（b）所示。用不同濃度黑木耳凝集素LAA處理RAW264.7細胞，與陽性對照組相比，細胞形態(tài)發(fā)生改變，出現(xiàn)了活化特征，如圖1（c）～1（i）所示。說明LAA可以活化RAW264.7巨噬細胞。

圖1 RAW264.7鼠巨噬細胞的形態(tài)變化Fig.1 Morphological changes of RAW264.7 cells

2.2 LAA對RAW264.7鼠巨噬細胞毒性的影響

細胞壞死引起的細胞膜結(jié)構(gòu)性破壞，會使細胞內(nèi)穩(wěn)定的乳酸脫氫酶（LDH）釋放出來。所以通過檢測LDH的含量，可以確定LAA對RAW264.7細胞的毒性影響。根據(jù)這個原理設(shè)計乳酸脫氫酶實驗，結(jié)果如圖2所示?？梢钥闯觯S著LAA濃度的增加，LDH分泌量也逐漸增多，但是與空白對照組相比，沒有顯著性差異，表明LAA在100μg·mL-1內(nèi)對RAW264.7鼠巨噬細胞無毒性影響。

圖2 不同質(zhì)量濃度的LAA對RAW264.7細胞的毒性檢測Fig.2 Toxicity test of RAW264.7 cells by LAA with different mass concentrations

2.3 LAA對RAW264.7鼠巨噬細胞增殖的影響

圖3為不同質(zhì)量濃度的LAA對RAW264.7細胞增殖的影響?？梢钥闯?，陽性對照組的細胞活性明顯地增強（P＜0.01），LAA為1μg·mL-1時，可以促進凝集素的增殖。LAA為5～10μg·mL-1，以濃度依賴性極顯著促進RAW264.7細胞的增殖活性。當(dāng)LAA質(zhì)量濃度為10～100μg·mL-1時，雖然增加的存活率開始下降，但與對照組相比仍有顯著性增加。結(jié)果顯示，LAA可以增強RAW264.7細胞活性（P＜0.01）。

圖3 不同質(zhì)量濃度的LAA對RAW264.7細胞增殖的影響Fig.3 Effect of LAA with different mass concentrations on cell proliferationt of RAW264.7

2.4 LAA對RAW264.7鼠巨噬細胞核酸代謝活性的影響

圖4為不同質(zhì)量濃度的LAA對RAW264.7鼠巨噬細胞核酸代謝活性的影響?？梢钥闯?，陽性對照組LPS可以明顯增強RAW264.7細胞核酸熒光強度的相對比例。相對于空白對照組來說，通過LAA處理的RAW264.7鼠巨噬細胞的核酸熒光強度相對比例都有顯著性增強（P＜0.01）。LAA質(zhì)量濃度為1～10μg·mL-1時，隨著質(zhì)量濃度的增加，核酸熒光強度相對比例呈現(xiàn)增強的趨勢（P＜0.01），甚至最高可以達到陽性對照組的效果。LAA質(zhì)量濃度為15～100μg·mL-1時，核酸熒光強度相對比例增強的顯著性（P＜0.05）效果降低，但相對于空白對照組仍有增強作用。結(jié)果顯示，LAA可以增強RAW264.7鼠巨噬細胞核酸熒光強度的相對比例。

圖4 不同質(zhì)量濃度的LAA對RAW264.7細胞核酸代謝的影響Fig.4 Effect of LAA with different mass concentrations on nucleic acid metabolism of RAW264.7 cells

2.5 LAA對RAW264.7鼠巨噬細胞吞噬能力的影響

LPS（脂多糖）能夠誘導(dǎo)巨噬細胞分化成熟，是巨噬細胞的活化劑。中性紅吞噬的實驗結(jié)果如圖5所示，可以看出，LPS刺激RAW264.7鼠巨噬細胞后，其吞噬能力（P＜0.05）明顯提高。LAA刺激RAW264.7細胞后，與空白組相比，LAA質(zhì)量濃度為1μg·mL-1時，可以促進RAW264.7細胞的吞噬能力。LAA質(zhì)量濃度為5～10μg·mL-1時，以濃度依賴性極顯著促進RAW264.7細胞的吞噬能力（P＜0.01）。LAA質(zhì)量濃度為15～100μg·mL-1時，提高吞噬能力效果逐漸開始下降，但與對照組相比也有顯著增強（P＜0.05）。表明LAA可以增強巨噬細胞的吞噬能力。

圖5 不同質(zhì)量濃度的LAA對RAW264.7細胞吞噬作用影響Fig.5 Effect of LAA with different mass concentrations on phagocytosis of RAW264.7 cells

3 討 論

食用菌不僅有食用價值，而且具有很珍貴的藥用價值。它不僅富含黑色素、氨基酸和許多微量元素，還含有多糖以及凝集素等藥用成分。近年來，隨著對真菌藥理學(xué)研究的深入，食用菌凝集素逐漸成為了研究的熱點［18］。而黑木耳作為營養(yǎng)價值極高的食用菌，有關(guān)黑木耳凝集素的研究卻很少［19］。本文選用免疫學(xué)最常用的RAW264.7鼠巨噬細胞作為研究對象，對黑木耳凝集素的免疫作用進行了研究。實驗以LPS作為陽性對照組，LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，在動物實驗中經(jīng)常誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生。本實驗顯示，加入LPS的RAW264.7細胞形態(tài)為圓形、光亮，LPS可以活化巨噬細胞，加入不同濃度的凝集素后，細胞形態(tài)發(fā)生了改變，出現(xiàn)了活化特征。說明黑木耳凝集素LAA可以促進RAW264.7細胞的增殖，為進一步研究黑木耳凝集素LAA的免疫活性作用奠定了基礎(chǔ)。

LAA可以活化RAW264.7巨噬細胞。一些真菌活性物質(zhì)在一些免疫學(xué)研究中會引起毒性的發(fā)生，本實驗對不同濃度LAA處理的RAW264.7進行了檢測，結(jié)果表明LAA處理的RAW264.7無毒性增長。巨噬細胞的活性增強有利于機體的特異性免疫，改善機體的免疫功能［20］。實驗結(jié)果顯示，黑木耳凝集素LAA可以促進RAW264.7細胞的增殖，為進一步研究黑木耳凝集素LAA的免疫活性作用奠定基礎(chǔ)。核酸是一類生物聚合物，是所有已知生命形式必不可少的組成物質(zhì)，核酸代謝活性的增強可以加強免疫［21］。通過吖啶橙熒光染色法檢測到加入不同濃度的LAA時，核酸熒光強度相對比例有明顯的增強，說明LAA可以通過促進核酸代謝活性來加強免疫能力。巨噬細胞是抵抗病原菌的重要防線，當(dāng)病原微生物侵入時，會識別抗原的受體，使自身活化，進而增強吞噬能力并且清除病原體［22］。實驗結(jié)果顯示，LAA能夠顯著增強巨噬細胞的吞噬活性，增強巨噬細胞吞噬病原體的能力。

此外，活化的巨噬細胞可以分泌多種細胞因子。細胞外信號通過細胞表面受體傳導(dǎo)到細胞內(nèi)，細胞內(nèi)的GTP酶和其他蛋白酶作用可以激活MAPKKK，而MAPKK可以被MAPKKK激活，激活后的MAPKK可以激活MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。胞漿內(nèi)存在大量未被激活的ERK，當(dāng)ERK激活后會轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子AP-1的活化，從而促進炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，促進炎癥因子產(chǎn)生，IL-1β、IL-6、TNF-α都是由活化的巨噬細胞分泌的重要的促炎癥因子。黑木耳凝集素可以活化巨噬細胞，活化的巨噬細胞可以直接殺死病原微生物，清除凋亡細胞和突變細胞，并可能通過分泌免疫活性分子參與并調(diào)控特異性免疫應(yīng)答和天然免疫防御。

4 結(jié) 論

LAA可以刺激RAW264.7鼠巨噬細胞形態(tài)發(fā)生改變，使其出現(xiàn)活化特征，并且對細胞無毒性影響。它可以增加RAW264.7的存活率和核酸代謝活性，能夠顯著增強RAW264.7鼠巨噬細胞的吞噬能力，對巨噬細胞的活化有一定的影響。本結(jié)果為LAA在免疫學(xué)方面的研究提供了重要依據(jù)，并且拓展了黑木耳活性物質(zhì)的合理利用范圍。