陳 敏，林琳玲，何悅洋，杜智鋮，張國(guó)君

(廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)中心，廈門(mén)大學(xué)附屬翔安醫(yī)院，廈門(mén)市內(nèi)分泌腫瘤精準(zhǔn)診治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361111)

乳腺癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居女性惡性腫瘤的第一位，死亡率居第二位[1].我國(guó)是世界乳腺癌發(fā)病率最高的國(guó)家，2015年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，年新發(fā)病例數(shù)和年死亡人數(shù)分別約占全世界的12.2%和9.6%，發(fā)病人數(shù)增長(zhǎng)快且趨于年輕化[2].

乳腺癌的治療采用手術(shù)為主的綜合治療策略，手術(shù)方式也逐漸從最大可耐受性手術(shù)向最小有效性手術(shù)演變.對(duì)于早期乳腺癌，保乳術(shù)和/或保腋窩是標(biāo)準(zhǔn)的手術(shù)方式[3].保乳術(shù)成功的關(guān)鍵在于術(shù)中完整切除病灶，保腋窩的前提是前哨淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移，而現(xiàn)階段對(duì)于術(shù)中腫瘤邊界的判定以及前哨淋巴結(jié)的識(shí)別主要憑借術(shù)者的經(jīng)驗(yàn)、眼看、手摸等，不能從微觀層面判斷是否存在腫瘤殘留，術(shù)后切緣陽(yáng)性需要再次手術(shù)的患者高達(dá)20%～55%[4-5]，增加了患者的心理負(fù)擔(dān)及二次手術(shù)感染、術(shù)后外觀不滿意等風(fēng)險(xiǎn).因此，精準(zhǔn)地評(píng)估切緣狀態(tài)對(duì)于保乳術(shù)患者的預(yù)后至關(guān)重要.術(shù)中病理、超聲、微計(jì)算機(jī)斷層掃描(micro-CT)、正電子發(fā)射斷層掃描(PET)等技術(shù)也相繼嘗試應(yīng)用于術(shù)中腫瘤邊界評(píng)估，可在一定程度上降低手術(shù)切緣陽(yáng)性率[6]，但目前仍沒(méi)有一種理想的手段用于術(shù)中精準(zhǔn)評(píng)估切緣.光學(xué)分子影像可實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地監(jiān)測(cè)分子變化，具有高靈敏度、高時(shí)空分辨率等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[7].新的光學(xué)分子影像技術(shù)可以填補(bǔ)術(shù)前影像學(xué)檢查和術(shù)中手術(shù)切除之間的診斷空白，引導(dǎo)外科醫(yī)生在術(shù)中精準(zhǔn)切除腫瘤，進(jìn)而提高手術(shù)效果、改善患者預(yù)后[8].

對(duì)于中晚期乳腺癌患者，全身系統(tǒng)治療對(duì)患者生存十分重要，盡早、準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)療效是改善預(yù)后的關(guān)鍵.目前臨床上普遍使用的是RECIST1.1的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，借助X線、CT、磁共振成像(MRI)等傳統(tǒng)影像技術(shù)，通過(guò)測(cè)量病灶最大直徑的變化來(lái)判斷療效[9]；但這些傳統(tǒng)影像技術(shù)僅能提供解剖結(jié)構(gòu)信息，難以客觀反映藥物治療的真實(shí)反應(yīng)，存在評(píng)估滯后的問(wèn)題.在腫瘤大小發(fā)生變化前，利用光學(xué)分子影像技術(shù)可在體內(nèi)監(jiān)測(cè)上述變化，為盡早、準(zhǔn)確地判定藥物療效提供了可能[10].

本團(tuán)隊(duì)近年來(lái)研發(fā)了靶向細(xì)胞周期的一系列光學(xué)報(bào)告系統(tǒng)，不僅為腫瘤的早期診斷奠定了基礎(chǔ)，而且提供了藥物療效評(píng)估的手段；更重要的是，還將近紅外熒光分子示蹤技術(shù)應(yīng)用于乳腺癌的外科手術(shù)導(dǎo)航.本文將討論光學(xué)分子影像技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究及臨床應(yīng)用現(xiàn)狀，并結(jié)合本團(tuán)隊(duì)在該領(lǐng)域的最新研究成果，對(duì)其在乳腺癌診斷、藥物療效評(píng)估、外科手術(shù)導(dǎo)航中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述.

1 光學(xué)分子影像技術(shù)和光學(xué)分子探針

1.1 生物發(fā)光成像

生物發(fā)光成像是指在體內(nèi)表達(dá)熒光素酶融合報(bào)告基因，利用其產(chǎn)生的熒光素酶與熒光底物的生化反應(yīng)把化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)[11].生物發(fā)光成像靈敏度高，即使只有幾千個(gè)腫瘤細(xì)胞，也能夠通過(guò)生物發(fā)光成像在體內(nèi)精確探測(cè)[12]，并且信背比高，有著良好的應(yīng)用前景[13].

1.2 熒光成像

1.2.1 熒光成像光區(qū)及發(fā)光材料

根據(jù)光的波長(zhǎng)不同，可分為可見(jiàn)光和不可見(jiàn)光，可見(jiàn)光波長(zhǎng)在400～700 nm之間，近紅外光(near-infrared，NIR)波長(zhǎng)在700～3 000 nm之間，其中近紅外一區(qū)(NIR-Ⅰ)波長(zhǎng)為700～900 nm，近紅外二區(qū)(NIR-Ⅱ)波長(zhǎng)為1 000～1 700 nm.組織對(duì)可見(jiàn)光的吸收和散射較強(qiáng)，并且存在較強(qiáng)的自發(fā)熒光，信背比不高，成像效果差[14-15]；相比之下，組織在NIR波段自發(fā)熒光弱，并且對(duì)NIR的散射和吸收較弱，成像的空間分辨率和組織穿透深度更佳[16-17]，信背比更高[18-19]，更適用于體外和體內(nèi)的成像，是目前熒光成像的研究熱點(diǎn)(表1).目前已開(kāi)發(fā)的NIR熒光探針包括小分子有機(jī)染料、碳納米管、量子點(diǎn)和鑭系稀土納米材料等，其中碳納米管和量子點(diǎn)由于毒性作用而臨床轉(zhuǎn)化受限.

1) NIR-Ⅰ熒光成像

臨床上最常用的NIR-Ⅰ染料是ICG[48]，其激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為780和805 nm.ICG進(jìn)入人體后被肝細(xì)胞攝取，經(jīng)膽道入腸，隨糞便排出體外，常被用于人體腔道的成像，包括膽道[49]、淋巴[50]、輸尿管[51]和眼底血管[52]等，在腫瘤顯像、淋巴結(jié)定位及外科手術(shù)導(dǎo)航中也有廣泛應(yīng)用[53-54].此外，ICG還可與靶向載體結(jié)合構(gòu)成光學(xué)分子探針，如ICG結(jié)合貝伐單抗(Bevacizumab-ICG)靶向VEGF，可在內(nèi)窺鏡系統(tǒng)中診斷結(jié)直腸癌[37].菁染料IRDye800CW(激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為774和789 nm)[55]易于化學(xué)修飾，可與抗體、多肽等靶向載體結(jié)合，如：HER2抗體熒光分子探針，可對(duì)人乳腺腫瘤異種移植小鼠進(jìn)行光學(xué)成像[27]；西妥昔單抗熒光分子探針，用于評(píng)估頭頸癌患者頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及手術(shù)導(dǎo)航[28-29].

表1 NIR熒光成像技術(shù)在腫瘤診療領(lǐng)域的臨床轉(zhuǎn)化研究及臨床應(yīng)用Tab.1 Clinical translational research and clinical application of NIR fluorescence imaging technology in tumor diagnosis and treatment

除ICG和IRDye800CW外, 其他菁染料如IR775、IR780、IR783、IR797、IR806、IR808、IR820、IR825和Cypate等均可用于癌癥光學(xué)成像；NIR-Ⅰ染料還有黃嘌呤、卟啉、方腦、酞菁、硼二吡咯甲烷、兩性離子染料和聚集誘導(dǎo)發(fā)光(aggregation-induced emission,AIE)材料，可用于癌癥的診斷[56].

NIR-Ⅰ無(wú)機(jī)染料在腫瘤成像、腫瘤藥物輸送和光熱治療方面具有潛在的應(yīng)用前景.如：可生物降解的多孔硅納米熒光探針，可用于人乳腺癌移植瘤的熒光成像[36]；谷胱甘肽包裹金納米熒光探針，在小鼠體內(nèi)可快速?gòu)难和ㄟ^(guò)腎臟排泄[57].最新報(bào)道的K3ZrF7：Yb/Er稀土熒光探針對(duì)乳腺癌成像效果良好，可在活體內(nèi)生物降解為無(wú)毒的小分子排出[35].上述NIR-Ⅰ納米熒光探針均具有臨床轉(zhuǎn)化的可能.

2) NIR-Ⅱ熒光成像

相比于NIR-Ⅰ，NIR-Ⅱ具有“組織透明窗口”的獨(dú)特性，背景信號(hào)和自發(fā)熒光更弱，對(duì)光的散射和吸收也更弱，成像的空間分辨率和組織穿透深度進(jìn)一步提高，因而備受關(guān)注[16-17].

有機(jī)NIR-Ⅱ染料由于其組織相容性好，有潛在的臨床轉(zhuǎn)化和應(yīng)用前景.研究發(fā)現(xiàn)ICG和IRDye800CW的發(fā)射波長(zhǎng)可延伸到NIR-Ⅱ[58].此外，新研制的有機(jī)染料CH1055代謝快，毒性小，在小鼠腦血管、淋巴系統(tǒng)和腫瘤成像方面均明顯優(yōu)于ICG，在NIR-Ⅱ成像分辨率、信背比及成像深度等方面都有很大的提升[38].進(jìn)一步將CH1055官能團(tuán)上的羧酸改變?yōu)榛撬岷铣傻挠袡C(jī)染料CH-4T，水溶性好，量子產(chǎn)率高，可在成像時(shí)大幅降低染料劑量[59].

此外，具有NIR-Ⅱ發(fā)光的新型無(wú)機(jī)熒光染料也不斷被報(bào)道.其中，稀土納米材料因其易偶聯(lián)、高信背比、低光漂白、低細(xì)胞光損害的特性，在手術(shù)導(dǎo)航、造影成像和腫瘤光敏治療等領(lǐng)域被廣泛研究[60].Wang等[41]使用腫瘤靶向肽修飾的NaGdF4:5%Nd@NaGdF4稀土熒光探針，顯示出了良好的光穩(wěn)定性和組織穿透深度(8 mm)，可用于卵巢轉(zhuǎn)移癌灶的示蹤及手術(shù)導(dǎo)航.小分子量的NIR-Ⅱ鑭系稀土配合物Nd-DOTA代謝快，其N(xiāo)IR-Ⅱ熒光成像可對(duì)直徑≤1 mm的卵巢癌轉(zhuǎn)移癌灶進(jìn)行示蹤并引導(dǎo)術(shù)中精準(zhǔn)切除[42].

相比于NIR-Ⅱa(1 000～1 300 nm)，波長(zhǎng)范圍為1 500～1 700 nm的NIR-Ⅱb熒光成像具有更高的信背比與更大的穿透深度，使NIR-Ⅱb熒光材料成為研究熱點(diǎn).如利用激光氣化法合成半導(dǎo)體單壁碳納米管，對(duì)小鼠乳腺癌組織及其后肢血管進(jìn)行成像時(shí)，相較于其N(xiāo)IR-Ⅰ和NIR-Ⅱa成像，NIR-Ⅱb成像效果更佳[46]；由硫化鉛/硫化鎘核殼結(jié)構(gòu)合成的量子點(diǎn)可產(chǎn)生1 600 nm的發(fā)射光，活體示蹤腫瘤的分辨率高，還可實(shí)現(xiàn)腫瘤血管的3D成像[47]；偶聯(lián)上CD8抗體的硫化鉛量子點(diǎn)，其N(xiāo)IR-Ⅱb成像可活體示蹤腫瘤部位的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，用于評(píng)估腫瘤免疫治療的效果[44]；稀土納米顆粒NaLnF4:Gd/Yb/Er摻雜Ce3+后，其N(xiāo)IR-Ⅱb熒光可活體示蹤小腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤，還可對(duì)腦血管和腫瘤血管進(jìn)行無(wú)創(chuàng)成像[43]；另外，在稀土納米顆粒(NaYbF4:Er,Ce@NaYF4)中摻雜Zn可使NIR-Ⅱb熒光更強(qiáng)，將其與PD-L1抗體偶聯(lián)后可對(duì)腫瘤免疫治療過(guò)程中PD-L1的變化進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)[44].上述納米材料表現(xiàn)出良好的NIR-Ⅱb發(fā)光性能，如能提高其生物安全性，將有廣闊的臨床應(yīng)用前景.

1.2.2 光學(xué)分子探針

1) 非靶向光學(xué)分子探針

與正常組織相比，實(shí)體瘤組織中血管豐富，血管壁間隙較寬，結(jié)構(gòu)完整性差，淋巴回流缺失，對(duì)大分子類(lèi)物質(zhì)和納米顆粒的通透性高，導(dǎo)致大分子和納米顆粒滯留在腫瘤組織中，這種現(xiàn)象被稱(chēng)作實(shí)體瘤組織的高通透長(zhǎng)滯留(enhanced permeability and retention,EPR)效應(yīng)[61].EPR效應(yīng)的強(qiáng)弱與實(shí)體瘤的血管狀態(tài)有關(guān)[62-63].熒光染料可直接通過(guò)EPR效應(yīng)累積在腫瘤部位，也可包裹在非靶向性藥物載體中(如白蛋白[64]、紅細(xì)胞膜[65]和脂質(zhì)體及病毒蛋白籠[66])，增強(qiáng)EPR效應(yīng)，延長(zhǎng)血液循環(huán)時(shí)間.

2) 靶向光學(xué)分子探針

相比于被動(dòng)聚集，利用腫瘤特異性分子修飾熒光材料的靶向性更強(qiáng)，可明顯提高腫瘤部位與瘤周正常組織的信背比，實(shí)現(xiàn)高特異性腫瘤成像.靶向腫瘤的抗體類(lèi)、多肽類(lèi)和核酸適配體受到廣泛關(guān)注，這些探針在臨床癌癥診斷和治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值.

抗體與受體之間具有高度的特異性和親和力，將熒光材料與抗體結(jié)合可實(shí)現(xiàn)靶向成像，用于腫瘤診療和手術(shù)導(dǎo)航[67].如：靶向癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)的AlexaFluor 488-conjugated anti-CEA單抗熒光探針，能夠可視化大腸癌和胰腺癌裸鼠模型中的原發(fā)和轉(zhuǎn)移癌灶[68]；靶向MUC1的聚乙二醇(PEG)化脂質(zhì)體-ICG-hCTM01單抗熒光探針，可用于小鼠乳腺腫瘤成像[23].

相比于其他偶聯(lián)物，多肽對(duì)靶點(diǎn)親和力高，特異性強(qiáng)且毒性小，具有良好的臨床應(yīng)用前景[69].其中，天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸肽(NGR)和精氨酸-甘氨酸-天冬酰胺肽(RGD)被廣泛用于制備腫瘤靶向探針.如：NGR修飾的PEG化量子點(diǎn)可用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤和腫瘤脈管系統(tǒng)的熒光成像[70]；化學(xué)交聯(lián)RGD的NIR-Ⅱ納米探針(APP-Ag2S-RGD)可用于切除直徑約0.2 mm的微小腫瘤轉(zhuǎn)移灶[45].

圖1 一系列用于活體可視化細(xì)胞周期不同時(shí)相的基于生物發(fā)光報(bào)告基因的光學(xué)分子影像技術(shù)Fig.1 A series of optical molecular imaging techniques based on bioluminescent reporter genes to visualize different phases of the cell cycle

核酸適配體通常由20～60個(gè)核苷酸組成.適配體對(duì)靶標(biāo)的識(shí)別方式和抗體對(duì)抗原的識(shí)別類(lèi)似，解離常數(shù)(Kd)能達(dá)到皮摩爾至納摩爾級(jí)，被稱(chēng)為“化學(xué)抗體”，分子量小且免疫原性低[71].如靶向MUC1的核酸適配體-鑭系元素鋱熒光傳感器[40]，可以簡(jiǎn)便、敏感地對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，表現(xiàn)出極高的靈敏度(檢測(cè)限低至70個(gè)細(xì)胞)，且傳感器的合成過(guò)程簡(jiǎn)單，光學(xué)性能穩(wěn)定，生物相容性良好.

2 可視化光學(xué)分子影像平臺(tái)用于癌癥藥物的療效評(píng)估

2.1 可視化監(jiān)測(cè)細(xì)胞周期

腫瘤是一種細(xì)胞周期相關(guān)性疾病，因細(xì)胞周期的異常激活引起細(xì)胞的失控性增殖[72].細(xì)胞周期的正常運(yùn)轉(zhuǎn)依賴(lài)于細(xì)胞周期蛋白(Cyclins)的時(shí)相性表達(dá)及細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶(Cyclin dependent kinases,CDKs)的活化[73].2008年日本理化研究所的Miyawaki團(tuán)隊(duì)首先用紅色和綠色熒光蛋白分別標(biāo)記細(xì)胞周期特異性蛋白Cdt1和Geminin，研發(fā)出FUCCI細(xì)胞周期傳感器，通過(guò)紅綠兩色熒光的改變顯示G1期與S/G2/M期[74].2016年，Lin團(tuán)隊(duì)在FUCCI系統(tǒng)的基礎(chǔ)上又添加了2個(gè)報(bào)告因子，使該傳感器可以把G1期到M期4個(gè)不同時(shí)相分別通過(guò)青、綠、橙、紫4種顏色呈現(xiàn)出來(lái)，并能夠監(jiān)測(cè)不同時(shí)相轉(zhuǎn)變的過(guò)程[75].

本團(tuán)隊(duì)2004年應(yīng)用p27融合蛋白技術(shù)和生物發(fā)光成像手段，研制出CDK2的生物發(fā)光報(bào)告系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)在活體水平監(jiān)測(cè)CDK2的活性和細(xì)胞周期的改變，并用于細(xì)胞周期特異性抗癌藥物的篩選[76]；此后，又研發(fā)了一系列靶向Cyclins/CDKs的生物熒光報(bào)告質(zhì)粒，在細(xì)胞和小動(dòng)物水平上實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞周期不同時(shí)相的可視化，如CYCA-Luc[77]可視化S期，CyclinB-Luc[78]可視化G2/M期；在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用這些報(bào)告系統(tǒng)在細(xì)胞和小動(dòng)物水平對(duì)常用的細(xì)胞周期特異抗腫瘤藥物，如黃吡哆醇(flavopiridol)、紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel)、羥基喜樹(shù)堿(HCPT)和5-氟尿嘧啶(5-Fu)進(jìn)行療效評(píng)價(jià)[76-77,79-80](圖1).這些生物發(fā)光報(bào)告系統(tǒng)與高內(nèi)涵成像系統(tǒng)結(jié)合，可對(duì)活細(xì)胞的細(xì)胞周期實(shí)現(xiàn)高效精確的測(cè)量，用于高通量抗癌藥物篩選[79,81-82].

2.2 可視化監(jiān)測(cè)細(xì)胞凋亡

大多數(shù)化療藥物是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡[83]，因此可視化監(jiān)測(cè)細(xì)胞凋亡可用來(lái)評(píng)估抗腫瘤藥物療效.在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，半胱氨酸蛋白酶(caspase)家族是關(guān)鍵的生物標(biāo)志物[83].基于天冬氨酸-谷氨酸-纈氨酸-天冬氨酸(DEVD)多肽序列可以被caspase-3/7識(shí)別和切割，Ozawa團(tuán)隊(duì)[84-85]開(kāi)發(fā)出一種基因編碼的環(huán)狀螢火蟲(chóng)熒光素酶pcFluc-DEVD，當(dāng)細(xì)胞凋亡時(shí)，caspase-3識(shí)別并切割DEVD，使其恢復(fù)熒光素酶活性，在細(xì)胞或活體動(dòng)物中均可檢測(cè)到這種生物發(fā)光.在轉(zhuǎn)染了pcFluc-DEVD生物發(fā)光報(bào)告質(zhì)粒的人頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞和小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞中，可視化不同濃度阿霉素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)生凋亡的過(guò)程，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡與阿霉素殺傷效果呈時(shí)間與劑量依賴(lài)性[86].

膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)可特異性結(jié)合凋亡細(xì)胞的磷脂酰絲氨酸(PS)，對(duì)凋亡細(xì)胞親和力高，且免疫原性和毒性低，廣泛應(yīng)用于體內(nèi)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)[87].Shah等[30]使用NIR700-Annexin V探針對(duì)曲妥珠單抗治療的HER2陽(yáng)性乳腺癌模型鼠進(jìn)行成像，可實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)曲妥珠單抗治療引發(fā)的乳腺癌細(xì)胞凋亡和腫瘤消退.Leng等[31]利用NIR熒光探針Annexin Vivo 750來(lái)檢測(cè)人源性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療中的乳腺癌細(xì)胞凋亡，在乳腺癌移植瘤中實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的抑瘤效果.

3 光學(xué)分子影像技術(shù)在乳腺癌外科手術(shù)導(dǎo)航中的應(yīng)用

早在2011年，van Dam等[88]合成了可見(jiàn)光染料FITC標(biāo)記葉酸的分子探針，首次將光學(xué)靶向分子探針應(yīng)用到外科手術(shù)中，開(kāi)展術(shù)中探測(cè)卵巢癌及其腹膜轉(zhuǎn)移灶的臨床試驗(yàn)，使腫瘤術(shù)中診療精準(zhǔn)度提升至分子水平.從此開(kāi)啟了熒光分子影像技術(shù)在腫瘤外科手術(shù)導(dǎo)航中的應(yīng)用[56].

3.1 示蹤乳腺癌前哨淋巴結(jié)

傳統(tǒng)腋窩淋巴結(jié)清掃術(shù)(axillary lymph node dissection，ALND)會(huì)大范圍切除腋窩淋巴結(jié)，易導(dǎo)致上肢淋巴水腫、功能障礙和感覺(jué)喪失等并發(fā)癥，降低了患者的術(shù)后生活質(zhì)量.前哨淋巴結(jié)活檢術(shù)(sentinel lymph node biopsy，SLNB)作為腋窩分期的重要手段，通過(guò)NSABP-B32[89]、ACOSOG Z0011[90]和IBCSG 23-01[91]等大量臨床試驗(yàn)證實(shí)，目前已經(jīng)成為臨床腋窩淋巴結(jié)陰性早期乳腺癌的標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)方式，取代了常規(guī)的ALND，避免ALND所致并發(fā)癥，改善了乳腺癌患者的生活質(zhì)量.鑒于此，臨床上通過(guò)SLNB來(lái)判斷SLN是否受腫瘤影響，若SLN陰性，則可避免不必要的淋巴結(jié)切除，顯著提高了患者的術(shù)后生存質(zhì)量[92]，對(duì)乳腺癌手術(shù)方式的改革具有重要意義.目前臨床上用于SLNB的染料主要有美藍(lán)染料、放射性膠體、ICG和納米碳.其中，ICG信背比更高[93-94]，價(jià)格便宜且毒性低[95]，更具優(yōu)勢(shì).

本團(tuán)隊(duì)利用ICG指導(dǎo)乳腺癌術(shù)中SLNB(圖2)，檢出率可達(dá)99%[20-22].此外，發(fā)現(xiàn)ICG示蹤上臂回流至腋窩的淋巴管和淋巴結(jié)的準(zhǔn)確率(87.2%)顯著高于美藍(lán)組(52.5%)，提示ICG也可用于腋窩淋巴系統(tǒng)逆向造影[96].Valente等[97]也將ICG成功用于乳腺癌患者的SLN識(shí)別，可達(dá)到與99mTc類(lèi)似的效果，證實(shí)了其有效性.Schaafsma等[98]通過(guò)ICG和99mTc 整合制備ICG-99mTc-納米膠體，可精確識(shí)別乳腺癌患者的SLN，且淋巴管清晰可見(jiàn).

(a)～(c)術(shù)前ICG示蹤腋窩SLN；(d)～(f)術(shù)中ICG 示蹤腋窩SLN；(g)～(i)術(shù)后離體SLN熒光成像.圖2 ICG引導(dǎo)的人體乳腺癌腋窩SLN術(shù)中示蹤及切除[21]Fig.2 ICG-guided intraoperative detection and resection of the SLN in humans[21]

光學(xué)靶向分子探針也逐漸應(yīng)用于乳腺癌淋巴結(jié)識(shí)別.如：乳腺珠蛋白A抗體熒光分子探針(MamAb-680)可示蹤乳腺癌荷瘤小鼠淋巴結(jié)中的癌轉(zhuǎn)移[99]；CD206抗體-Dylight755熒光分子探針靶向示蹤腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞，可在乳腺癌小鼠模型中檢測(cè)到SLN的腫瘤轉(zhuǎn)移[32]；而有機(jī)染料XB1034結(jié)合西妥昔單抗制備的NIR-Ⅱ熒光分子探針，可在小鼠中示蹤淋巴結(jié)的腫瘤轉(zhuǎn)移，并在術(shù)中引導(dǎo)淋巴結(jié)的切除[39].

3.2 保乳術(shù)中腫瘤邊緣界定

乳腺癌保乳術(shù)是指切除原發(fā)腫瘤和鄰近的乳腺組織，術(shù)后輔以放療.經(jīng)過(guò)NSABP-B06[100]、Milan trial[101]和EORTC[102]等多項(xiàng)大型前瞻性臨床試驗(yàn)證實(shí)，保乳術(shù)輔以放療在局部復(fù)發(fā)率和總體生存率方面，與改良根治術(shù)的療效相比并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.這些研究結(jié)果驗(yàn)證了保乳術(shù)的安全性，使其被逐漸推廣，現(xiàn)已成為早期乳腺癌患者的首選術(shù)式.保乳術(shù)縮小手術(shù)范圍減少了創(chuàng)傷，但增加了病灶殘留和二次手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)；而光學(xué)分子影像技術(shù)可以“點(diǎn)亮”腫瘤組織，引導(dǎo)外科醫(yī)生精準(zhǔn)切除腫瘤并保護(hù)正常組織.

在一項(xiàng)將ICG用于保乳手術(shù)導(dǎo)航的臨床研究中，NIR成像顯著提高了陽(yáng)性邊緣檢出率，但50%(6/12) 的患者在腫瘤切除后瘤床存在異常熒光信號(hào)，提示腫瘤殘留；而術(shù)后病理檢測(cè)證實(shí)切緣陰性，究其原因可能是探針缺乏靶標(biāo)，滯留于周?chē)＝M織而產(chǎn)生假陽(yáng)性[103].因此，使用腫瘤特異性靶向探針開(kāi)展手術(shù)導(dǎo)航至關(guān)重要.

荷蘭van Dam團(tuán)隊(duì)在2017年將靶向VEGF的熒光探針Bevacizumab-IRDye800CW用于乳腺癌保乳術(shù)切緣界定的Ⅰ期臨床試驗(yàn)[24]：對(duì)20例原發(fā)性浸潤(rùn)性乳腺癌患者的保乳術(shù)切緣殘留腫瘤組織進(jìn)行靶向性“點(diǎn)亮”和精準(zhǔn)示蹤，其結(jié)果與病理診斷相符且無(wú)一例發(fā)生不良反應(yīng)(圖3).2018年，張國(guó)君團(tuán)隊(duì)與van Dam教授合作開(kāi)展了此探針的Ⅱ期臨床試驗(yàn)，對(duì)使用劑量進(jìn)行摸索，從微觀和宏觀的水平對(duì)探針進(jìn)行全面評(píng)估，結(jié)果顯示相比于傳統(tǒng)方式，此探針的應(yīng)用將腫瘤邊界的術(shù)中檢出率提高到88%，為后期Bevacizumab-IRDye800CW推向臨床奠定了基礎(chǔ)[26].此外，van Dam團(tuán)隊(duì)[25]在Bevacizumab-IRDye800CW引導(dǎo)的保乳術(shù)中建立了fSTREAM的分析方法，綜合處理熒光、顏色和組織學(xué)信息，設(shè)定區(qū)分腫瘤組織與正常組織的閾值，使術(shù)中對(duì)腫瘤邊界的判定更加客觀.

Whitley等[33]利用組織蛋白酶底物肽將Cy5熒光團(tuán)與猝滅劑QSY21連接，構(gòu)建了酶響應(yīng)性LUM015光學(xué)智能分子探針，并于2016年開(kāi)展了首個(gè)光學(xué)智能探針用于乳腺癌手術(shù)切緣評(píng)估的Ⅰ期臨床試驗(yàn).2018年Smith等[34]證明用LUM015智能探針開(kāi)展手術(shù)導(dǎo)航的平均信背比可達(dá)到4.7，切緣判定與術(shù)后病理檢測(cè)結(jié)果一致.

多個(gè)目前處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段的用于手術(shù)切緣評(píng)估的分子探針也表現(xiàn)出一定的臨床轉(zhuǎn)化潛力.如：連接環(huán)肽cRGD的生物響應(yīng)性NIR-AZAs探針，有較高的信背比和較短的體內(nèi)清除時(shí)間[104]；利用anti-EGFR-IRDye800CW的熒光壽命成像，可以在人類(lèi)乳腺癌的臨床前模型中，提供比基于強(qiáng)度的連續(xù)波熒光成像更顯著的腫瘤對(duì)比度[105]；抗B7-H3抗體[106]、透明質(zhì)酸[107]連接ICG構(gòu)成的探針也能靶向腫瘤組織，用于保乳術(shù)導(dǎo)航.

4 總結(jié)與展望

(a)～(c)對(duì)切除的腫塊進(jìn)行體外光學(xué)成像，可在陽(yáng)性邊緣中檢測(cè)到貝伐單抗-IRDye800CW示蹤劑，其中(a)為白光，(b)為熒光，(c)為假彩色覆蓋；(d)～(f)面包切片；(g)～(i)石蠟切片；(j)～(l)4 μm石蠟切片，其中(j)為蘇木精-伊紅染色，(k)為熒光平板 掃描，(l)為(j)和(k)圖像重疊(*皮膚縫合，**衛(wèi)星腫瘤病灶；紅/白/黑色虛線：腫瘤輪廓；白/黑色箭頭：陽(yáng)性腫瘤邊緣).圖3 光學(xué)分子影像用于腫瘤邊緣界定(修改自文獻(xiàn)[24])Fig.3 Optical molecnlar imaging of tumor margin identification (modified from Ref.[24])

現(xiàn)有的光學(xué)造影劑和光學(xué)分子影像系統(tǒng)憑借其高分辨率、實(shí)時(shí)可視化等優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于臨床和臨床前研究.目前已批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的熒光分子染料僅有ICG，IRD800CW已經(jīng)被批準(zhǔn)進(jìn)行臨床試驗(yàn)，未來(lái)更多的近紅外熒光分子探針有望用于臨床，如可在活體實(shí)現(xiàn)生物降解的稀土發(fā)光材料[35].與此同時(shí)，光學(xué)分子影像技術(shù)還有許多可改進(jìn)的空間：首先，光學(xué)影像穿透深度相對(duì)較低，采用波長(zhǎng)更長(zhǎng)的熒光染料(如NIR-Ⅱ熒光染料)更適合于活體組織成像[38].光聲成像與光學(xué)分子影像類(lèi)似，是一種無(wú)創(chuàng)、無(wú)輻射的影像技術(shù)；但相比之下，光聲成像具有更高的對(duì)比度、空間分辨率和更大的穿透深度，并且對(duì)組織特征敏感，可以呈現(xiàn)良好的解剖和生理學(xué)特征[108].目前，基于內(nèi)源性對(duì)比劑黑色素的光聲成像可用于黑色素瘤肝臟微轉(zhuǎn)移的早期診斷，并指導(dǎo)術(shù)中腫瘤切除[109].相信不久的將來(lái)，光聲成像技術(shù)在乳腺癌檢測(cè)、外科導(dǎo)航以及藥物療效評(píng)估中也將發(fā)揮更大的作用.其次，光學(xué)分子影像融合CT、MRI、PET以及光聲成像等技術(shù)，通過(guò)多模態(tài)間的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，能大幅度提高實(shí)時(shí)手術(shù)中導(dǎo)航與療效監(jiān)測(cè)的精準(zhǔn)度.再者，由于腫瘤存在異質(zhì)性，單靶點(diǎn)分子探針對(duì)腫瘤組織的整體靶向性不足，所以開(kāi)發(fā)具有多靶點(diǎn)、親和力強(qiáng)的分子探針也是未來(lái)發(fā)展的方向.此外，采用能夠識(shí)別腫瘤組織和正常組織的多光譜同時(shí)成像,輔以多參數(shù)分析方法和人工智能技術(shù)，光學(xué)分子影像技術(shù)將有望為乳腺癌患者提供個(gè)體化、精準(zhǔn)化的診療方案，提高生存率和生活質(zhì)量.

致謝：感謝廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院2019級(jí)生理學(xué)博士張永渠、汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院2017級(jí)腫瘤學(xué)博士王尊，以及廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院2020級(jí)腫瘤學(xué)研究生羅忠、明梓何、陳洪宇、黨永穎的大力協(xié)助.