李少偉，王致萍，池 鑫，陳 潔,李婷婷，顧 穎，張 軍，夏寧邵*

(1.廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，分子疫苗學(xué)和分子診斷學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361102；2.廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，國(guó)家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361102)

在自然界中，有一類廣泛感染脊椎動(dòng)物的古老病毒，被稱為乳頭瘤病毒(PV)，有著幾百萬年的存在歷史[1].20世紀(jì)30年代，美國(guó)科學(xué)家Shope等[2]首次從雪兔中分離得到了棉尾兔乳頭瘤病毒(CRPV)，隨后的研究發(fā)現(xiàn)該病毒可導(dǎo)致兔產(chǎn)生腫瘤[3].在CRPV被分離鑒定之后，許多其他PV如牛乳頭瘤病毒(BPV)和犬口腔乳頭瘤病毒(COPV)也陸續(xù)被分離鑒定[4-5].早期PV和另一類多瘤病毒統(tǒng)一歸類為乳多空病毒科(Papovaviridae).20世紀(jì)70年代，隨著分子生物學(xué)技術(shù)迅速發(fā)展，人們認(rèn)識(shí)到PV與多瘤病毒在基因序列、轉(zhuǎn)錄方式和編碼蛋白的同源性等方面存在極大差異，因此國(guó)際病毒分類委員會(huì)(ICTV)于2000年將PV歸類為乳頭瘤病毒科(Papillomaviridae).在1983年和1984年，德國(guó)zur Hausen課題組從宮頸癌組織中分離得到人乳頭瘤病毒HPV16和HPV18型毒株，揭示了HPV感染與宮頸癌發(fā)生的密切關(guān)系[6-7].2006年美國(guó)Merck公司的第一個(gè)HPV疫苗上市，使得HPV導(dǎo)致的宮頸癌和尖銳濕疣等成為可預(yù)防的疾病.zur Hausen因發(fā)現(xiàn)HPV和癌癥的關(guān)系而獲得2008年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng).本文綜述HPV的生物學(xué)和流行病學(xué)特征，及其預(yù)防性和治療性疫苗的最新研究進(jìn)展，為其他病毒疫苗的創(chuàng)新研究提供思路和借鑒.

1 HPV的生物學(xué)和流行病學(xué)特征

1.1 HPV病毒基因組、蛋白及分型

PV是一類無包膜的雙鏈環(huán)狀DNA病毒，其直徑約55 nm，呈二十面體結(jié)構(gòu).HPV屬于乳頭瘤病毒科乳頭瘤病毒屬(Papillomavirus)，其基因組長(zhǎng)度為7～8 kb，可劃分為3個(gè)區(qū)域：編碼早期蛋白的早期區(qū)，主要負(fù)責(zé)編碼病毒復(fù)制和宿主細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化所需的各種蛋白(E1、E2、E4、E5、E6和E7)，長(zhǎng)度約4 kb；編碼晚期蛋白的晚期區(qū)，主要負(fù)責(zé)編碼病毒的兩個(gè)衣殼蛋白L1和L2，長(zhǎng)度約3 kb；剩下的為非編碼區(qū),長(zhǎng)度約1 kb，包含轉(zhuǎn)錄調(diào)控原件，因此也被稱為長(zhǎng)調(diào)控區(qū)(LCR)(圖1)[8].

E1.調(diào)控病毒DNA復(fù)制；E2.病毒轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子；E4.促進(jìn) 病毒成熟與釋放；E5.宿主轉(zhuǎn)化相關(guān)，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子信號(hào)通路； E6.宿主轉(zhuǎn)化相關(guān)，促進(jìn)p53降解；E7.細(xì)胞轉(zhuǎn)化相關(guān)， 結(jié)合pRb蛋白；L1.主要衣殼蛋白；L2.次要衣殼蛋白； P97/PE.早期啟動(dòng)子；P670/PL.晚期啟動(dòng)子.圖1 HPV16基因組結(jié)構(gòu)Fig.1 Genomic organisation of HPV16

早期蛋白主要在病毒感染早期表達(dá)(除E4表達(dá)于病毒復(fù)制晚期外)，通過相互作用調(diào)節(jié)病毒擴(kuò)增和宿主細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[9-12].其中，E1是DNA解旋酶，也是唯一由PV編碼的酶[13];E2是序列特異性的DNA結(jié)合蛋白，是主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[14];E4可能具有促進(jìn)病毒成熟和釋放的功能[15];E5、E6和E7是重要的癌蛋白，與宿主細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)[16-17].

(a)HPV16 L1單體(PDB:1DZL[18]);(b)HPV58 L1五聚體(PDB:5Y9E[19]);(c)HPV16 L1 VLP(PDB:3J6R[20]).圖2 HPV L1單體、五聚體和病毒樣顆粒(VLP)Fig.2 HPV L1 monomer,pentamer and capsomer (VLP)

晚期蛋白是形成HPV衣殼的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒感染晚期表達(dá)，包括L1和L2，兩者共同組成了病毒的球狀顆粒結(jié)構(gòu).L1分子質(zhì)量約55 ku，單個(gè)L1分子主要包括α螺旋、β折疊和β折疊片之間的柔性環(huán)狀連接肽(圖2(a))，其中β折疊形成的“桶狀”結(jié)構(gòu)是L1的核心區(qū)[18].研究發(fā)現(xiàn)HPV衣殼顆粒結(jié)構(gòu)可僅由L1形成，5個(gè)L1首先形成五聚體的基本結(jié)構(gòu)單位[19](圖2(b))，72個(gè)五聚體再進(jìn)一步組裝為三角形剖分?jǐn)?shù)T=7的二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)(圖2(c))，又稱為病毒樣顆粒(VLP)[20]，其具有良好的免疫原性，是目前已上市HPV疫苗的抗原成分.L2在病毒顆粒中占比很少，最多可占病毒衣殼總量的1/6，但其對(duì)于病毒的組裝和感染具有重要作用[21]，因其序列在各型HPV中非常保守，故具有成為廣譜疫苗的潛力，但其分子結(jié)構(gòu)及與L1的相互作用細(xì)節(jié)尚未知.

病毒分類主要基于病毒基本性質(zhì)，如基因序列、組織嗜向性、感染模型等[22].雖然PV的宿主范圍十分廣泛，但是其具有嚴(yán)格的宿主特異性和組織特異性[23].由于缺乏相應(yīng)的血清標(biāo)志物，所以采用其宿主特異性和基因序列同源性進(jìn)行分類.能感染人的HPV主要屬于α、β、γ、μ和ν 5個(gè)屬；引起惡性腫瘤的HPV主要在α屬中，其中最常見的HPV16和HPV18分別屬于α屬的9種和7種.目前已鑒定超過200型HPV，其中絕大多數(shù)型別已完成全基因組測(cè)序.

1.2 HPV生活史及致病機(jī)理

HPV的生活周期嚴(yán)格依賴于宿主上皮細(xì)胞的增殖和分化過程[24]:首先HPV由皮膚或黏膜的微小創(chuàng)傷接觸具有分化能力的基底層細(xì)胞，并通過衣殼蛋白與受體的相互作用進(jìn)入上皮的基底細(xì)胞后，在衣殼蛋白L2的協(xié)助下，病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞核.在HPV感染早期，細(xì)胞仍可以維持正常的生理活動(dòng)，但此時(shí)HPV的早期蛋白E1和E2開始表達(dá)，并借助宿主細(xì)胞的復(fù)制系統(tǒng)獲得病毒的基因拷貝，此時(shí)拷貝數(shù)一般較低；在較低層的宿主細(xì)胞中也會(huì)表達(dá)癌蛋白，使得宿主細(xì)胞長(zhǎng)期處于分裂狀態(tài).隨著宿主細(xì)胞的向上遷移和分化，多種病毒基因組復(fù)制所需蛋白被上調(diào)，協(xié)助病毒基因組進(jìn)行大量復(fù)制.在病毒感染終末期，早期蛋白E4和晚期蛋白L1和L2開始表達(dá)，晚期蛋白和基因組形成的新病毒顆粒在E4的幫助下從細(xì)胞中釋放，進(jìn)行下一輪感染.從最初的HPV感染到發(fā)展為組織良性或者惡性的病變過程十分漫長(zhǎng).HPV感染細(xì)胞后，為了維持自身基因組的復(fù)制和表達(dá)，通過癌蛋白E5、E6和E7的作用對(duì)宿主的細(xì)胞周期進(jìn)行干擾，使得宿主細(xì)胞持續(xù)增殖、無法脫落，這是導(dǎo)致宿主細(xì)胞持續(xù)分裂成疣狀病變或發(fā)展為癌癥的主要原因.此外，在有絲分裂的過程中，HPV基因組通過非同源重組整合入宿主基因，通常引起E2編碼基因區(qū)斷裂，進(jìn)一步增強(qiáng)癌蛋白E6和E7的表達(dá).

1.3 HPV免疫學(xué)機(jī)制

人體免疫系統(tǒng)的天然免疫和適應(yīng)性免疫會(huì)對(duì)感染的HPV進(jìn)行控制和清除，因此大部分感染都是自限性的.研究表明90%以上的感染者會(huì)在3年內(nèi)將病毒清除[25]；但是由于HPV有多種逃逸免疫系統(tǒng)的機(jī)制，仍然會(huì)有小部分人成為持續(xù)感染者.

在皮膚或黏膜發(fā)生物理損傷后，病毒得以接觸基底層細(xì)胞，此時(shí)起作用的是第一道免疫防線，也稱為天然免疫或固有免疫.自然殺傷(NK)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在其中起關(guān)鍵作用.正常情況下，NK細(xì)胞上的殺傷抑制受體(KIR)與主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅰ類分子結(jié)合，抑制其對(duì)正常細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，而HPV感染會(huì)下調(diào)MHC Ⅰ類分子，啟動(dòng)NK細(xì)胞的殺傷功能；另外，白介素2(IL-2)、干擾素(IFN-α/β/γ)等多種細(xì)胞因子也對(duì)病毒感染起清除和抑制作用[26-27].

適應(yīng)性免疫作為HPV免疫的第二道防線，需要經(jīng)歷識(shí)別、提呈、效應(yīng)過程，免疫響應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，但其具有特異性，且存在免疫記憶，仍是HPV免疫的重要組成部分.CD8+細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)殺傷效應(yīng)能夠清除被感染的細(xì)胞，而E6和E7存在多個(gè)CTL表位，可以引起這種特異性細(xì)胞殺傷[28].HPV感染后，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生針對(duì)L1、L2和E6等多種蛋白的抗體，其中L1的抗體占比最大，但大多為型別特異性抗體，難以產(chǎn)生型別交叉免疫保護(hù)；HPV的抗體分子類型以IgG和IgA為主，其中IgA又分為血清型和分泌型，早期認(rèn)為其在黏膜中的作用大于IgG(IgG主要分布于血清中，可透過血管壁浸潤(rùn)周圍組織)，但后期的臨床試驗(yàn)證明IgG類抗體在抗HPV感染中起主要作用[29-30].

HPV的基因組雖然簡(jiǎn)單，但是進(jìn)化出諸多復(fù)雜的機(jī)制來逃避宿主的免疫監(jiān)控和清除.HPV感染初期，病毒早期抗原表達(dá)量低，且不表達(dá)晚期抗原；在后期遷移到離基底層細(xì)胞較遠(yuǎn)的表層才開始大量表達(dá)晚期抗原，且不會(huì)引起細(xì)胞的裂解，因此難以引起免疫系統(tǒng)的有效應(yīng)答[31].L2也在HPV的免疫逃逸中起重要作用，主要通過阻止朗格漢斯(Langerhans)細(xì)胞表面的免疫相關(guān)信號(hào)分子數(shù)量上升，并抑制其激活T細(xì)胞的能力[32].另外，某些型別的E6和E7可以通過干擾細(xì)胞周期來下調(diào)Ⅰ型IFN的表達(dá)[33].

1.4 HPV流行病學(xué)現(xiàn)狀

HPV感染十分常見，傳播途徑主要為性傳播.在一項(xiàng)對(duì)女性的長(zhǎng)期觀察數(shù)據(jù)分析中發(fā)現(xiàn)，18～35歲女性中HPV檢出率為42.6%，但只有小部分會(huì)持續(xù)感染發(fā)展為癌癥[34]，癌癥發(fā)展過程通常在10年以上.男性群體的HPV檢出率在不同地區(qū)和群體中差異很大，但在性行為活躍的男性中HPV檢出率較高[35].HPV感染的人群呈現(xiàn)明顯年齡差異特征，目前比較主流的觀點(diǎn)是呈現(xiàn)雙峰分布，即存在25歲以下及65歲以上兩個(gè)感染高峰[36].據(jù)2019年世界衛(wèi)生組織(WHO)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示：世界范圍內(nèi)，每年約有57萬新發(fā)宮頸癌病例，31.1萬死亡病例[37].HPV在全世界范圍內(nèi)廣泛流行，但由于經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平、文化差異、地理環(huán)境等因素的不同，在各地區(qū)HPV的流行率存在較大差異，亞洲和歐洲的感染率較低，而非洲和大洋洲的感染率較高.

目前鑒定出的HPV型別超過200多種，國(guó)際癌癥研究中心根據(jù)其危險(xiǎn)性，將HPV分為低危型和高危型；根據(jù)高危型的致癌能力強(qiáng)弱又將其分為3類：1類(致癌)包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和59共12個(gè)型別，2A類(很可能致癌)僅包括HPV68一個(gè)型別，2B類(可能致癌)包括HPV26、30、34、53、66、67、69、70、73、82、85和97共12個(gè)型別[38].低危型HPV主要引起組織的良性病變，如HPV11和HPV6的感染通常引起肛門和外生殖器疣，是15～24歲人群中的高發(fā)性傳播疾病，某些嗜皮膚型低危HPV也可以引起扁平疣和跖疣等皮膚病變;高危型HPV則與組織癌變有關(guān)，包括宮頸癌、口咽癌、頭頸癌、陰道癌、外陰癌、陰莖癌和肛門癌等[23].在宮頸癌患者中，HPV16和HPV18的檢出率最高，約占全球患者的70%以上，中國(guó)人群中84.5%的宮頸癌由這兩種HPV病毒引起；此外，HPV58、52和33也是檢出率較高的型別[39].

2 HPV預(yù)防性疫苗的研究進(jìn)展

疫苗是人類歷史上最偉大的發(fā)明之一，接種HPV預(yù)防性疫苗是預(yù)防HPV感染及其相關(guān)疾病最經(jīng)濟(jì)有效的方法.HPV自然感染引起的免疫反應(yīng)較弱，難以產(chǎn)生足夠滴度的抗體來中和入侵的病毒；而接種HPV預(yù)防性疫苗可以刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度的中和抗體，清除入侵病毒.臨床結(jié)果顯示，HPV疫苗產(chǎn)生的中和抗體可以滲透血管壁到達(dá)感染部位，結(jié)合病毒使其喪失感染細(xì)胞的能力[40]，L1和L2均是良好的預(yù)防性疫苗候選蛋白.

近期有研究結(jié)果表明，青少年女性的HPV疫苗(馨可寧?/Ceclin?)接種聯(lián)合成年女性每5年一次的careHPV篩查是中國(guó)宮頸癌防控最具成本效益的策略[41].2020年10月1日發(fā)表的瑞典最新HPV疫苗大規(guī)模接種人群(1 672 983名10～30歲的女孩和婦女)2006—2017年的隨訪研究結(jié)果顯示，17歲前完成HPV疫苗接種可減少88%的宮頸癌發(fā)生，18～30歲接種可減少53%的宮頸癌發(fā)生[42].可見接種HPV疫苗能顯著降低宮頸癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，且接種HPV疫苗越早，接種年齡越小，預(yù)防宮頸癌的效果越好.HPV 具有嚴(yán)格的種屬和組織特異性，感染高度未分化的上皮細(xì)胞，在體外難以大規(guī)模培養(yǎng)，因此目前已上市的HPV預(yù)防性疫苗都是L1蛋白的VLP形式，其結(jié)構(gòu)與天然HPV高度相似，具有良好的免疫原性，免疫機(jī)體可誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的針對(duì)疫苗型別HPV的中和抗體；此外，這種形式的疫苗不含有病毒的基因組成分，不存在致癌的可能，具有良好的安全性.

2.1 已上市的HPV預(yù)防性疫苗現(xiàn)狀

截至2020年10月，已上市的HPV疫苗有4種，分別是2006年上市的4價(jià)疫苗Gardasil?4[43]、2007年上市的2價(jià)疫苗Cervarix?[44]、2014年底上市的9價(jià)疫苗Gardasil?9[45]和2019年底上市的2價(jià)疫苗馨可寧?/Cecolin?.這4種疫苗均基于L1 VLP研制.

2.1.1 Gardasil?4

2006 年美國(guó)Merck公司研制的Gardasil?4(加衛(wèi)苗)是全球首個(gè)上市的HPV疫苗，該疫苗含有釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表達(dá)的HPV6、11、16和18這4種型別的L1 VLP，通過吸附到羥基磷酸鋁硫酸鹽佐劑(AAHS)上制成疫苗[46]，可以預(yù)防約90%的尖銳濕疣和約70%的宮頸癌.每劑Gardasil?4疫苗中HPV6、11、16和18 VLP的含量分別為20，40，40 和20 μg，接種目標(biāo)人群為9～26歲女性，接種方式為肌肉注射，程序采用0，2和6個(gè)月三針免疫.

Gardasil?4上市前，先后進(jìn)行了10次以上臨床試驗(yàn)，結(jié)果表明其具有良好的安全性和有效性，疫苗有效率可達(dá)100%.2007年一項(xiàng)覆蓋12 167名15～26歲女性的隨機(jī)雙盲多中心的Ⅲ期臨床試驗(yàn)顯示，Gardasil?4對(duì)HPV16和18引起的宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)2級(jí)或3級(jí)以及原位癌的保護(hù)率高達(dá)98%，對(duì)非疫苗型別感染也有一定的預(yù)防作用[47]；2007年一項(xiàng)覆蓋5 455名16～24歲女性的臨床試驗(yàn)顯示，Gardasil?4對(duì)宮頸病變的保護(hù)率為98%[48]；2009年一項(xiàng)覆蓋1 910 名24～45歲女性的臨床試驗(yàn)顯示，Gardasil?4對(duì)HPV16和18感染引起相關(guān)疾病的保護(hù)率為83.1%，對(duì)HPV6和11感染引起相關(guān)疾病的保護(hù)率為100%[49]；而且在多次臨床試驗(yàn)中該疫苗均未出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，證明其安全性和有效性良好[49-53].

2008年12月31日，Gardasil?4在中國(guó)啟動(dòng)Ⅲ期臨床試驗(yàn)，共有3 006名20～45歲女性參與，第30個(gè)月和第78個(gè)月的隨訪報(bào)告顯示，其對(duì)6和12個(gè)月宮頸持續(xù)感染的療效分別達(dá)91.6%和97.5%，還降低了與HPV6、11、16、18相關(guān)的宮頸細(xì)胞學(xué)異常率，有效率為94.0%[54]，提示Gardasil?4對(duì)20～45歲的中國(guó)女性的持續(xù)感染和生殖器癌前病變是有效的.2017年，Gardasil?4獲中國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市.隨后90個(gè)月的隨訪報(bào)告顯示，Gardasil?4在20～45歲的中國(guó)婦女中耐受性良好，且具有良好的安全性，這與全球試驗(yàn)和安全性監(jiān)測(cè)研究的結(jié)果一致[55].

此外，2011年的一項(xiàng)覆蓋18個(gè)國(guó)家的4 065名16～26歲健康男性的臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，Gardasil?4對(duì)HPV6、11、16和18相關(guān)病變的有效率為90.4%，表明Gardasil?4可預(yù)防HPV6、11、16和18感染引起的16～26歲男性外生殖器相關(guān)病變的發(fā)生[56].另有臨床試驗(yàn)評(píng)估了Gardasil?4在3 252例27～45歲女性中的有效性，隨訪時(shí)間中位數(shù)為3.5年，結(jié)果顯示Gardasil?4在預(yù)防HPV6、11、16和18相關(guān)的任何級(jí)別CIN的有效率為87.7%[49,57].基于上述臨床數(shù)據(jù)，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)在2018年10月批準(zhǔn)將Gardasil?4的適用人群擴(kuò)大到27～45歲的女性和男性[49，57].

臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，4價(jià)疫苗對(duì)其他高危型HPV如HPV31、33和45的傳播也有預(yù)防作用，但交叉保護(hù)效力較低，對(duì)HPV31、33和45的保護(hù)效力分別為46.2%，24.0%和7.8%[58].

2.1.2 Cervarix?

2007年9月，英國(guó)葛蘭素史克(GlaxoSmithKline，GSK)公司研發(fā)的疫苗Cervarix?(卉妍康)獲得歐盟批準(zhǔn)上市，2009年10月獲得美國(guó)FDA通過，2016年于中國(guó)大陸獲批上市.該疫苗含桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)的 HPV16和18兩種VLP組分，含量均為20 μg，不包含低危型 HPV，因此并不能預(yù)防尖銳濕疣，但同樣可以保護(hù)約70%的宮頸癌.該疫苗使用的佐劑是GSK公司研發(fā)的AS04佐劑，包含氫氧化鋁和單磷酰脂質(zhì)(MPL)A[59]，性能優(yōu)于氫氧化鋁佐劑，具備較好的免疫增強(qiáng)效應(yīng)[60].接種目標(biāo)人群為9～45歲女性，接種程序?yàn)?，1和6個(gè)月三針免疫，采用肌肉注射.

Cervarix?的Ⅲ期臨床試驗(yàn)規(guī)模比Gardasil?更大，有來自亞、歐、美洲的14個(gè)國(guó)家的18 729名15～25歲女性參與.2009年的臨床試驗(yàn)顯示Cervarix?對(duì)HPV16和18相關(guān)的2級(jí)及以上CIN有98.1%的保護(hù)率[61]；同時(shí)該疫苗具有良好的長(zhǎng)效性，接種疫苗4～5年后，免疫人群中 HPV16和18抗體的陽性率仍達(dá)到98%，而且疫苗所誘導(dǎo)的抗體滴度在接種4年后依然維持在較高水平[62-66].在一項(xiàng)7年的橫斷面研究中，Kavanagh等[67]明確了2價(jià)疫苗具有重要的交叉保護(hù)作用：12～13歲的女性接受2價(jià)疫苗的接種，20～22歲時(shí)接受宮頸細(xì)胞學(xué)篩查并檢測(cè)HPV DNA，以評(píng)估HPV疫苗對(duì)病毒傳播的預(yù)防作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPV疫苗減少了89%的HPV16和18感染和傳播；更重要的是，2價(jià)疫苗對(duì)HPV31、33和45亞型感染均有預(yù)防和減少傳播的作用，其交叉保護(hù)效力分別為93.8%(95%可信區(qū)間83.8%～98.5%)，79.1%(95%可信區(qū)間64.2%～89.0%)和82.6%(95%可信區(qū)間61.5%～93.9%).Cervarix?在安全性方面同樣較好，但由于該疫苗含有MPL成分，接種疫苗后產(chǎn)生的不良反應(yīng)發(fā)生率相比于Gardasil?略高[68-69].

2.1.3 Gardasil?9

2014年12月，Merck公司研制的Gardasil?9在美國(guó)獲批上市.該疫苗同樣在釀酒酵母中表達(dá)，含有HPV6、11、16、18、31、33、45、52和58共9種VLP組分，含量分別為30，40，60，40，20，20，20，20和20 μg，抗原總量高達(dá)270 μg，接種程序?yàn)?，2和6個(gè)月三針免疫，采用肌肉注射，適宜人群為9～26歲女性和9～15歲男性.Gardasil?9可以預(yù)防由7種高危型HPV導(dǎo)致的約90%的宮頸、陰道、外陰和肛門癌癥，以及由低危型 HPV6和11導(dǎo)致的約90%的尖銳濕疣.

2017年報(bào)道的一項(xiàng)覆蓋18個(gè)國(guó)家的14 215名16～26歲女性的臨床試驗(yàn)顯示：Gardasil?9對(duì)高度宮頸病變、外陰及陰道病變的保護(hù)率為97.4%；與Gardasil?4相比，9價(jià)疫苗誘導(dǎo)的抗體滴度在接種疫苗3年內(nèi)無明顯降低；總的來說，Gardasil?9能預(yù)防約90%的宮頸癌，疫苗的效力能維持至少6年[70].在安全性方面，兩組間嚴(yán)重不良事件無顯著差異，11名參與者在研究隨訪期間死亡(Gardasil?9 疫苗組6人，Gardasil?4疫苗組5人)，但這些死亡事件均與疫苗無關(guān)，Gardasil?9總體上具有更廣病毒型別保護(hù)范圍和良好的安全性[71-72].

2.1.4 馨可寧?(Cecolin?)

2019年12月，由廈門大學(xué)聯(lián)合廈門萬泰滄海生物技術(shù)有限公司研制的首個(gè)國(guó)產(chǎn)宮頸癌疫苗馨可寧?(Cecolin?)在我國(guó)獲批上市，標(biāo)志著我國(guó)成為繼美國(guó)、英國(guó)之后世界上第3個(gè)實(shí)現(xiàn)HPV疫苗自主供應(yīng)的國(guó)家.與之前上市的HPV疫苗不同的是，該疫苗首次采用高效、簡(jiǎn)便、快速、低廉的大腸桿菌(Escherichiacoli)重組表達(dá)系統(tǒng)獲得疫苗抗原，即HPV16和18的L1 VLP，大大降低了生產(chǎn)成本，并提高了產(chǎn)量，為WHO 2018年提出的要在2030年全球消除宮頸癌計(jì)劃和2020年兩會(huì)政協(xié)提案——將HPV疫苗納入國(guó)家免疫規(guī)劃(9～14歲女孩免費(fèi)接種)，提供了可行性基礎(chǔ).

馨可寧?含有HPV16和18兩種VLP組分，每劑含量分別為40和20 μg，使用鋁佐劑.2020年，一項(xiàng)7 372 名18～45歲中國(guó)女性參與的臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，馨可寧?對(duì)HPV16和18相關(guān)的高度生殖道病變保護(hù)率為100%，對(duì)HPV16和18持續(xù)感染的保護(hù)率為97.8%[73].由于上市時(shí)間短，還未有相關(guān)的交叉保護(hù)數(shù)據(jù)報(bào)道.2020年4月21日，馨可寧?首批93 643支疫苗獲國(guó)家藥品監(jiān)督管理局的生物制品批簽發(fā)證明，2020年5月18日全國(guó)首針國(guó)產(chǎn)HPV疫苗在湖北省武漢市婦幼保健院接種，截至2020年9月全國(guó)已有18個(gè)省份實(shí)現(xiàn)了國(guó)產(chǎn)2價(jià)苗接種，分別為湖北、江西、云南、新疆、山東、河南、廣東、河北、上海、天津、湖南、福建、海南、浙江、吉林、山西、內(nèi)蒙古和四川，批簽發(fā)數(shù)量超過200萬支.另外，一項(xiàng)979名9～26歲女性接種馨可寧?的臨床試驗(yàn)表明，9～14歲女孩接種3或2劑HPV疫苗的免疫原性與年輕成年婦女的免疫原性沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并首次獲批9～14歲女孩兩針法免疫接種程序[74].在產(chǎn)能一定的情況下，減少接種次數(shù)可增加接種人數(shù)并提高接種完成度.

2.2 處于臨床階段的HPV疫苗研究現(xiàn)狀

除了已經(jīng)上市的4種HPV疫苗外，還有多種疫苗也進(jìn)入臨床階段，其中包括L2肽段為抗原的疫苗和靶向癌蛋白的重組腺病毒(Ad)載體疫苗，但大多數(shù)仍以HPV L1蛋白作為免疫原.國(guó)外多數(shù)進(jìn)入臨床階段的HPV疫苗為治療性疫苗.目前，我國(guó)有5個(gè)研發(fā)單位的HPV 9價(jià)疫苗已經(jīng)進(jìn)入臨床階段，其中，廈門大學(xué)聯(lián)合廈門萬泰滄海生物技術(shù)有限公司[75]和上海博唯生物技術(shù)公司的HPV 9價(jià)疫苗已經(jīng)進(jìn)入Ⅲ期臨床；HPV 4價(jià)疫苗和HPV 2價(jià)疫苗也分別有2和3個(gè)研發(fā)單位進(jìn)入臨床階段；除了常見的2價(jià)、4價(jià)和9價(jià)疫苗外，3價(jià)、11價(jià)和14價(jià)疫苗也獲批進(jìn)入臨床階段的研究(表1).

2.3 新一代HPV預(yù)防性疫苗的研究

目前上市的預(yù)防性疫苗均是以含有野生型蛋白序列的HPV L1 VLP為抗原、多型別混合制備的，其中保護(hù)范圍最廣的是9價(jià)疫苗Gardasil?9(約90%)，其保護(hù)機(jī)制是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的中和抗體[76].然而，HPV具有高度的型別特異性，單一型別VLP誘導(dǎo)的抗體難以對(duì)其他型別產(chǎn)生交叉中和，導(dǎo)致現(xiàn)有上市的HPV疫苗難以保護(hù)疫苗涵蓋型別之外的其他HPV型別；而目前已知的高危型HPV在15種以上，不同地區(qū)宮頸癌相關(guān)HPV型別分布也有較大的差異，其中9價(jià)疫苗保護(hù)范圍外的HPV59和35兩種型別在西非的分布分別占9.8%和4.4%[41].新一代疫苗需要考慮達(dá)到更廣的型別保護(hù)范圍，然而繼續(xù)增加新型別HPV L1 VLP將加大生產(chǎn)工藝的復(fù)雜性和潛在的副作用，且多種不同型別VLP混合免疫在體內(nèi)可能會(huì)產(chǎn)生不同型別免疫原的免疫反應(yīng)干擾，影響保護(hù)效果.因此，新一代HPV預(yù)防性疫苗研發(fā)需突破原有疫苗僅產(chǎn)生型別特異性保護(hù)的限制，在理論和技術(shù)上另辟蹊徑.

表1 我國(guó)臨床階段的HPV疫苗Tab.1 The HPV vaccines at clinical stages in China

廈門大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)關(guān)于HPV58和59的型別特異性中和表位結(jié)構(gòu)的研究表明[20]：1) HPV嚴(yán)格的型別特異性結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是型別特異性中和表位氨基酸在同一型別蛋白序列中高度保守，但在不同型別間有較大的差異，這些氨基酸與HPV感染宿主細(xì)胞相關(guān)；2) 型別特異中和表位氨基酸大多數(shù)位于HPV L1五聚體表面的環(huán)區(qū)，而不同型別的中和表位關(guān)鍵氨基酸所處的結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)不盡相同[77-78]；3) 將一種型別特異的中和表位關(guān)鍵氨基酸替換到型別進(jìn)化親緣關(guān)系近的HPV L1蛋白上，突變的VLP具有結(jié)合被移植型別的特異中和抗體的活性，表明型別特異性中和表位可以被移植重塑，型別間中和表位移植具有構(gòu)建產(chǎn)生不同型別保護(hù)抗原的潛力.

根據(jù)上述結(jié)果，廈門大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步開展了新一代疫苗的理想設(shè)計(jì)：首先分析國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)分類中20種危害較大型別HPV的主要結(jié)構(gòu)蛋白L1的進(jìn)化關(guān)系，并與其中8種型別HPV的衣殼粒五聚體晶體結(jié)構(gòu)保守性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)型別特異性的優(yōu)勢(shì)中和表位是由表面的型別特異性氨基酸和病毒顆粒保守性整體結(jié)構(gòu)共同組成的；利用基于結(jié)構(gòu)信息的同源替換方法，在一種經(jīng)過分子改造的HPV58/33/52 3型別嵌合VLP上實(shí)現(xiàn)了各型別HPV的抗原性和免疫原性兼顧，并在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)出與3倍劑量的野生型混合VLP相當(dāng)?shù)慕徊婷庖弑Ｗo(hù)抗體滴度；進(jìn)一步利用晶體結(jié)構(gòu)和冷凍電鏡(cryo-EM)結(jié)構(gòu)測(cè)定揭示了這種嵌合型VLP產(chǎn)生交叉保護(hù)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；此外還成功設(shè)計(jì)出另外的4種3型別嵌合VLP(HPV16/31/35、HPV56/66/53、HPV39/68/70和HPV18/45/59)，驗(yàn)證了這種分子設(shè)計(jì)策略的通用性，從而為研制7種嵌合VLP保護(hù)20種型別HPV感染的新一代HPV疫苗開辟了新途徑[79].基于該設(shè)計(jì)的新型HPV疫苗與目前上市的預(yù)防性疫苗相比，減少了疫苗顆粒的種類，從而降低了免疫劑量、生產(chǎn)工藝難度以及生產(chǎn)成本，同時(shí)提高了疫苗保護(hù)范圍.

早期研究發(fā)現(xiàn)，HPV L1的C末端存在一個(gè)伸入相鄰五聚體的“折返”結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)中的一個(gè)保守半胱氨酸與相鄰五聚體中EF環(huán)的保守半胱氨酸形成二硫鍵[80]，這兩處突變會(huì)導(dǎo)致五聚體無法形成VLP；在HPV16中這兩處位點(diǎn)為C175和C428，通過序列比對(duì)將其他型別的對(duì)應(yīng)位置半胱氨酸也命名為C175和C428.為了進(jìn)一步提高多型疫苗的覆蓋范圍，也考慮其他高變異病毒疫苗和靶向腫瘤新抗原的疫苗設(shè)計(jì)中所需的多種表位聚集，廈門大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)對(duì)HPV VLP組裝機(jī)制已有深入認(rèn)識(shí)[81]：兩個(gè)不同型別的L1-C175A五聚體和L1-C428A五聚體雜合組裝可以恢復(fù)L1蛋白形成VLP的能力，且其顆粒形態(tài)與野生型VLP類似，均為T=7的二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，這種單一顆粒被稱為雜合病毒樣顆粒(chVLP).基于此，該團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種能夠針對(duì)多種型別HPV同時(shí)產(chǎn)生免疫保護(hù)效果的chVLP，并證明該雜合組裝方式是一種不限HPV型別的隨機(jī)組裝，實(shí)驗(yàn)測(cè)試中2～9種不同型別的L1五聚體均可雜合組裝成chVLP，理論上一個(gè)chVLP中能容納72種不同型別的L1五聚體.使用多種型別或chVLP特異的單克隆抗體分析顆?？乖园l(fā)現(xiàn)，chVLP在保留了大部分型別特異性表位的同時(shí)也產(chǎn)生了不同于野生型的新表位.進(jìn)一步使用該雜合組裝策略將9種型別(HPV6、11、16、18、31、33、45、52和58)的L1五聚體裝配至單顆粒中形成9型(nona-type)chVLP，在小鼠模型中能誘導(dǎo)得到與已上市的HPV 9價(jià)疫苗Gardasil?9相當(dāng)?shù)母咧泻涂贵w滴度，且在疫苗制備方法上具有一定優(yōu)勢(shì)：純化過程中五聚體狀態(tài)更穩(wěn)定，顆粒組裝過程更加可控且不需要加入還原劑(如二硫蘇糖醇)[82].如果將該雜合組裝技術(shù)與前期設(shè)計(jì)的3型別嵌合顆粒技術(shù)相結(jié)合，理論上可以通過在單一chVLP上簇集216種型別的HPV中和表位而制成pan-HPV廣譜疫苗，可涵蓋目前鑒定的200多種型別的HPV.

在新一代HPV疫苗研發(fā)中，新型佐劑可發(fā)揮增強(qiáng)免疫原性和延長(zhǎng)免疫持久性的作用，如GSK公司在HPV 2價(jià)疫苗Cervarix?中使用的AS04佐劑.基于此，2019年廈門大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)聯(lián)合廈門萬泰滄海生物技術(shù)有限公司，與GSK簽署合作協(xié)議，利用廈門大學(xué)的創(chuàng)新抗原技術(shù)與GSK的新型佐劑系統(tǒng)聯(lián)合研發(fā)新一代的HPV疫苗.這是中國(guó)疫苗行業(yè)首次借助獨(dú)創(chuàng)技術(shù)與國(guó)際頂尖疫苗企業(yè)緊密合作，共同開發(fā)重磅疫苗品種并在全球商業(yè)化，也是中歐醫(yī)藥界推進(jìn)合作共贏的一項(xiàng)代表性事件，標(biāo)志著中國(guó)的疫苗關(guān)鍵核心技術(shù)已得到國(guó)際同行的高度認(rèn)可.

2.4 基于L2的預(yù)防性疫苗研究進(jìn)展

另一種HPV預(yù)防性疫苗的策略主要聚焦于具有潛在廣譜保護(hù)性的L2蛋白.20世紀(jì)90年代，一些研究報(bào)道了重組表達(dá)的L2可以作為免疫原，抵抗動(dòng)物PV的感染[83-84].也有研究發(fā)現(xiàn)L2 N端的肽段具有高度保守性，廣譜中和表位位于L2 N端第17～120位氨基酸區(qū)域.Gambhira等[85]篩選獲得一株可以中和HPV16型假病毒的單克隆抗體RG-1，其結(jié)合表位位于HPV16 L2肽段(第17～36位氨基酸)，而采用該肽段進(jìn)行免疫小鼠獲得的血清可以中和多種HPV型別的假病毒以及BPV1型，表現(xiàn)出其具有成為廣譜HPV預(yù)防性疫苗的潛力.BPV L2 N端的由88個(gè)氨基酸構(gòu)成的肽段可以中和多種HPV型別的假病毒[86].將L2的第108～120位氨基酸肽段替換到HPV16 L1 C末端螺旋4，構(gòu)建嵌合抗原，其小鼠免疫血清可以中和同源HPV16/52假病毒[87].

盡管HPV L2重組蛋白作為免疫原表現(xiàn)出較好的廣譜保護(hù)性，但仍具有一定的局限性，如：其誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體滴度遠(yuǎn)低于L1 VLP抗原；雖然其具有保守性，但是缺乏充分的研究數(shù)據(jù)表明其廣譜性優(yōu)于上市的9價(jià)疫苗，且沒有證據(jù)表明L2抗原疫苗能夠預(yù)防所有的高危型HPV感染；L2蛋白在病毒感染的多個(gè)過程中起重要作用，作為疫苗抗原的安全性仍然需要進(jìn)一步考察.目前基于L2蛋白的預(yù)防性疫苗研究主要集中于通過分子內(nèi)佐劑、載體展示、表位串聯(lián)等方式提高其誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體滴度，聚焦于中和表位，提高安全性.

有研究通過分子內(nèi)佐劑增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答，從而提高交叉中和抗體滴度，如強(qiáng)黏膜佐劑大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素(LT)，將其去毒突變體融合至L2 C端作為分子內(nèi)佐劑[88]；細(xì)菌鞭毛蛋白(Fla)融合L2也有類似效果[89].此外有研究使用鈣網(wǎng)蛋白增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[90]；或采用Toll樣受體2(TLR2)配體Pam2Cys (P2C)聯(lián)合日本血吸蟲(Schistosomajaponicum)蟲卵抗原Th1表位肽P25與HPV1 L2的第17～36位氨基酸肽段組合，提高其免疫原性，可中和多種HPV型別的假病毒[91].

利用載體蛋白或顆粒展示肽段是常用的增強(qiáng)肽段表位免疫原性的方法，VLP表面展示是其中的主要方法之一.顆粒性抗原有利于抗原呈遞，表面多價(jià)表位容易刺激B細(xì)胞[92]，并可促進(jìn)B細(xì)胞受體交聯(lián)[93].有研究采用HPV VLP展示L2肽段，同時(shí)將L2的不同肽段插入或替換L1的不同位置(如D-E環(huán)區(qū)[94-97]和h4[87])，相比單一肽段免疫，提高了L2中和抗體的滴度，還可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)L1的高滴度抗體，具有產(chǎn)生L1和L2中和抗體的雙重效果.也有利用其他病毒的VLP開展類似的L2疫苗研究，包括腺相關(guān)病毒(AAV)[98]、5型腺病毒(Ad5)[99]、乙肝病毒核心蛋白VLP[95]、馬鈴薯病毒X(PVX)[100]和噬菌體VLP[101]等.

最近一項(xiàng)載體表面展示結(jié)合多價(jià)混合的研究表明，HPV L1 VLP的D-E環(huán)區(qū)展示或MS2噬菌體、VLP展示HPV16 L2的第17～36位氨基酸肽段表位效果最好[94,102-103]，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)HPV6、11、16、18、26、31、33、34、35、39、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68和73多達(dá)22種型別的中和抗體.然而，載體展示疫苗可能存在諸如難以產(chǎn)生高滴度抗體和VLP抗原的熱穩(wěn)定性降低[104]等問題，故基于L2的廣譜預(yù)防性疫苗研究仍然充滿挑戰(zhàn).

3 HPV治療性疫苗的研究進(jìn)展

目前的預(yù)防性HPV疫苗并不能消除先前存在的HPV感染和相關(guān)病變，受感染細(xì)胞的清除依賴于誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng).基于HPV致癌機(jī)制的研究，目前HPV治療性疫苗針對(duì)的靶抗原蛋白主要是E6、E7、E2和E5.其中，E6和E7被認(rèn)為是最重要的致瘤蛋白,當(dāng)前大多數(shù)治療性疫苗的研發(fā)是針對(duì)E6和E7，目的是以不同形式將E6和E7抗原遞送到抗原提呈細(xì)胞(APC)，以分別激活HPV抗原特異性的CD8+CTL反應(yīng)或CD4+輔助T細(xì)胞反應(yīng)，從而清除病毒及已感染病毒的細(xì)胞.目前已經(jīng)開發(fā)了幾種類型的治療性疫苗，并在臨床前和臨床試驗(yàn)中進(jìn)行了測(cè)試，包括活載體疫苗、亞單位疫苗、DNA疫苗和樹突狀細(xì)胞(DC)疫苗.

3.1 活載體疫苗

活載體疫苗是將編碼HPV特異性抗原(E6和E7)的基因插入到無毒或減毒的病毒載體、細(xì)菌載體中，利用這些載體在體內(nèi)復(fù)制并促進(jìn)抗原的傳播.其免疫原性高，可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，但也有如下缺點(diǎn)：對(duì)免疫功能缺失的個(gè)體不是100%安全；機(jī)體對(duì)載體本身的免疫反應(yīng)使其不宜反復(fù)使用；外源性HPV抗原表達(dá)量過低，對(duì)載體的免疫反應(yīng)可能超過對(duì)HPV抗原的免疫反應(yīng)；表達(dá)的HPV抗原可能與天然抗原有差異.

3.1.1 細(xì)菌載體疫苗

減毒的細(xì)菌載體具有誘導(dǎo)黏膜、體液和細(xì)胞免疫的能力，且細(xì)菌載體的生產(chǎn)相對(duì)簡(jiǎn)單、便宜、穩(wěn)定，易于大規(guī)模應(yīng)用.目前單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、乳酸乳球菌(Laciococcuslactis)、植物乳桿菌(L.plantarum)和干酪乳桿菌(L.casei)[105-108]等多種細(xì)菌載體被應(yīng)用于HPV治療性疫苗的研究，其中基于李斯特菌的疫苗Lm-LLO-E7包含截短的李斯特菌成孔蛋白O(LLO)和HPV16 E7蛋白.ADXS11-001是編碼HPV16 E7的李斯特菌減毒活疫苗，2020年一項(xiàng)針對(duì)持續(xù)性或復(fù)發(fā)性宮頸鱗狀細(xì)胞癌或非鱗狀細(xì)胞癌患者覆蓋50人的Ⅱ期臨床試驗(yàn)(NCT01266460)結(jié)果顯示：ADXS11-001疫苗是安全、可耐受的，并滿足在宮頸癌志愿者中開展進(jìn)一步調(diào)查所需協(xié)議規(guī)定的活性基準(zhǔn)[109].

3.1.2 病毒載體疫苗

最廣泛的病毒載體是Ad、AAV、甲型病毒和痘苗病毒(如改良安卡拉痘苗(MVA)病毒).1) TG4001疫苗是以減毒的重組牛痘病毒MVATG8042為載體，含有修飾過的HPV16E6/E7基因和IL-2基因.2011年Ⅰ期臨床結(jié)果顯示，21名HPV16相關(guān)CIN2級(jí)和3級(jí)的患者中，有10名患者(48%)顯示疾病消退，8名患者的HPV DNA清除和7名患者的mRNA清除[110].2) 進(jìn)展最快的MVA E2治療性疫苗已經(jīng)進(jìn)入臨床Ⅲ期研究，該疫苗能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)HPV的免疫反應(yīng)并使高級(jí)別病變減退.MVA E2疫苗是含有BPVE2基因的重組牛痘病毒，2014年Ⅲ期臨床結(jié)果顯示，在1 176例HPV引起上皮內(nèi)病變的女性和180例僅患有疣的男性中， 89.3%女性的病變消退，100%男性的病變消退[111]；但可能由于需要將MVA E2疫苗直接注射到子宮、尿道、外陰或肛門，這一治療方式?jīng)]有被廣泛推廣.3) 目前國(guó)內(nèi)浙江普康生物技術(shù)股份有限公司的表達(dá)HPV16 E6和E7融合蛋白的重組腺病毒載體(Ad-HPV16 E6/E7)疫苗正在進(jìn)行臨床試驗(yàn).

3.2 亞單位疫苗

亞單位疫苗是以多肽或蛋白形式遞呈抗原.這類疫苗具有安全、穩(wěn)定和易于生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn);但疫苗的免疫原性較低，限制了其對(duì)惡性腫瘤的治療效果.因此需要輔以佐劑或免疫刺激分子，增強(qiáng)其免疫效應(yīng).

3.2.1 多肽疫苗

1) 合成長(zhǎng)肽疫苗HPV16-SLP由E6和E7重疊多肽和Montanide ISA-51作為佐劑組成，多項(xiàng)臨床試驗(yàn)研究證明其具有一定的治療效果.在一項(xiàng)對(duì)9名HPV16高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)接種HPV16-SLP疫苗的Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，接種后均顯示強(qiáng)烈的HPV特異性T細(xì)胞反應(yīng)[112].2) PepCan疫苗由HPV16 E6蛋白的4種合成長(zhǎng)肽及新型佐劑Candin組成.2016年31例HSIL患者的Ⅰ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，PepCan的安全性良好，且每肽50 μg的劑量顯示出最好的組織學(xué)效果，50%的患者組織學(xué)完全恢復(fù)，85%的患者實(shí)現(xiàn)病毒清除[113].目前正在進(jìn)行一項(xiàng)125名HSIL患者的Ⅱ期臨床試驗(yàn)(NCT02481414)，以進(jìn)一步評(píng)估PepCan聯(lián)合佐劑 Candin的有效性.

3.2.2 蛋白疫苗

多肽疫苗具有易生產(chǎn)、安全性高的特點(diǎn)，但受限于人類白細(xì)胞抗原(HLA)及需佐劑或高效給藥系統(tǒng)輔助等缺點(diǎn)；而蛋白疫苗具有所有的抗原表位，因此不受HLA表型限制.目前文獻(xiàn)報(bào)道主要有TA-CIN、GTL001和HSP65-E7融合蛋白疫苗.1) 國(guó)內(nèi)上海澤潤(rùn)安珂生物制藥有限公司的重組HPV 16型E7融合蛋白疫苗已獲得臨床試驗(yàn)批件.2) TA-CIN是一種融合了HPV16 L2、E6和E7的蛋白疫苗[114]，已經(jīng)在幾項(xiàng)Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗(yàn)中被證明具有免疫原性和安全性[115-117].目前，另一項(xiàng)Ⅰ期研究計(jì)劃評(píng)估TA-CIN聯(lián)合GPI-0100佐劑治療HPV16相關(guān)宮頸癌(NCT02405221)的安全性和有效性.3) GTL001是一種將HPV16 E7和HPV18 E7都融合到來自百日咳博德特氏菌(Borderellapertusis)的解毒腺苷酸環(huán)化酶中的2價(jià)治療性HPV蛋白疫苗.但2016年Genticel發(fā)布了233名HPV16/18+細(xì)胞學(xué)未見上皮內(nèi)細(xì)胞病變(NILM)、無明顯意義的非典型鱗狀上皮細(xì)胞異常(ASCUS)和低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)的患者中使用GTL001的雙盲、安慰劑對(duì)照的Ⅱ期研究的中期(18個(gè)月)結(jié)果(NCT01957878)，顯示接受GTL001疫苗的HPV16/18陽性患者的病毒清除與安慰劑沒有顯著差異.4)TVGV-1疫苗包括HPV16E7與銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向序列的融合蛋白和GPI-0100佐劑.目前正在進(jìn)行一項(xiàng)10名宮頸HSIL患者的Ⅱa期臨床試驗(yàn)(NCT02576561)，研究該疫苗的安全性和有效性，評(píng)估其作為治療性HPV蛋白疫苗候選的潛力.

3.3 DNA疫苗

DNA疫苗是將HPV的基因片段插入真核表達(dá)質(zhì)粒中，用質(zhì)粒進(jìn)行免疫，通過人體細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)生HPV抗原，由MHCⅠ類分子遞呈激活免疫系統(tǒng)，以達(dá)到治療HPV感染相關(guān)疾病的目的.1) GX-188E疫苗為共表達(dá)HPV16/18的E6和E7蛋白及FMS樣酪氨酸激酶配體(Flt3L)的DNA疫苗，其中Flt3L為已知的DC激活劑，可以促進(jìn)DC對(duì)抗原的加工和呈遞.2014年Ⅰ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示該疫苗具有較好的安全性和有效性[118]，Ⅱ期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中(NCT02596243和NCT02139267).2) VGX-3100是優(yōu)化的HPV16/18的E6和E7兩個(gè)質(zhì)粒的組合[83-84]，通過肌內(nèi)注射遞送，以小電荷形式進(jìn)行電穿孔，也是目前最受矚目的治療性疫苗.該疫苗是全球首個(gè)開發(fā)用于治療HPV癌前病變的疫苗，目前正在進(jìn)行一項(xiàng)覆蓋201名HPV16/18陽性的CIN2級(jí)和3級(jí)患者的Ⅲ期臨床試驗(yàn)(NCT03185013),以證實(shí)VGX-3100的有效性、安全性和耐受性.

治療性DNA疫苗有安全性高、穩(wěn)定性高、易于生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì)，具有潛在的研究?jī)r(jià)值.此外，與活載體疫苗不同，DNA疫苗在患者體內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生針對(duì)載體的中和抗體，可以反復(fù)加強(qiáng)[119].然而目前大多數(shù)HPV DNA疫苗還只針對(duì)HPV16/18這兩個(gè)高危型別，對(duì)其他型別引起的宮頸癌還需要進(jìn)一步的臨床研究.

3.4 DC疫苗

DC是呈遞能力最強(qiáng)的APC，可以通過各種不同的抗原加載策略來完成疫苗的準(zhǔn)備，如用各種多肽或蛋白刺激DC，或直接將腫瘤抗原轉(zhuǎn)移至DC，通過增強(qiáng)T細(xì)胞間的相互作用來增強(qiáng)其刺激免疫系統(tǒng)的能力，再將這些DC運(yùn)送到受感染的宿主[120-124].針對(duì)HPV的DC疫苗可以通過兩種策略進(jìn)行準(zhǔn)備：一種是將DC在體外培養(yǎng)并用HPV抗原刺激，另一種是用HPV抗原表達(dá)載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的DC，這些策略已經(jīng)被證明可在小鼠中產(chǎn)生更大的抗原特異性CD8+T細(xì)胞激活和抗腫瘤效應(yīng)[123,125].然而DC疫苗也存在一定的局限性：1) 由于技術(shù)的限制，從每個(gè)患者身上收獲的DC數(shù)量及質(zhì)量難以保證；2) 人體細(xì)胞離體培養(yǎng)需要高技術(shù)、高耗材、長(zhǎng)耗時(shí)等條件，難以進(jìn)行大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn).因此DC疫苗的有效開發(fā)仍需更全面和深入的探索.

4 總結(jié)與展望

近20年來，HPV預(yù)防性疫苗的研究取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，除了已經(jīng)上市的4種疫苗外，許多疫苗已完成Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗(yàn)，正在進(jìn)行更深入的研究.但HPV治療性疫苗的研究與臨床應(yīng)用仍尚有距離，特別是存在臨床可能產(chǎn)生的副作用和低免疫原性、HPV病毒嚴(yán)格的種屬特異性、難以建立動(dòng)物模型評(píng)價(jià)疫苗的免疫效果以及疫苗自身安全性等問題.另外，如何選擇最佳的疫苗策略，如載體的優(yōu)化、高效簡(jiǎn)便的表達(dá)系統(tǒng)的選擇、整合染色體表達(dá)菌株的構(gòu)建、劑量瓶頸的理性優(yōu)化、利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)等交叉學(xué)科手段開展理性并高效的新型疫苗設(shè)計(jì)、疫苗遞送方式的優(yōu)化、高效新型佐劑的研發(fā)、各型別在人群中流行率的變化、聯(lián)合治療等策略的探索以及臨床應(yīng)用疫苗條件的合理選擇等，都應(yīng)該是研發(fā)HPV預(yù)防性和治療性疫苗時(shí)應(yīng)考慮的內(nèi)容.

目前HPV預(yù)防性疫苗已取得相當(dāng)不錯(cuò)的進(jìn)展，從2價(jià)、4價(jià)到9價(jià)疫苗.在國(guó)內(nèi)，以廈門大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)的HPV系列疫苗研究為例，聯(lián)合廈門萬泰滄海生物技術(shù)有限公司的2價(jià)疫苗(HPV16/18)[126]已于2019年底上市，9價(jià)疫苗(HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58)于2020年9月開展Ⅲ期臨床試驗(yàn)；2018年提出 “七防二十”的HPV 20價(jià)疫苗[127]的理性設(shè)計(jì)，被《科技日?qǐng)?bào)》等媒體譽(yù)為“率先敲開第三代宮頸癌疫苗研制大門”；2020年提出的單一chVLP預(yù)防216種HPV型別[82]的疫苗設(shè)計(jì)，體現(xiàn)了在我國(guó)疫苗創(chuàng)新領(lǐng)域具備趕超國(guó)外同行的能力.宮頸癌在貧窮偏遠(yuǎn)、欠發(fā)達(dá)地區(qū)發(fā)病率高，腫瘤的篩檢普查條件不具備，這里是最需要HPV預(yù)防性疫苗的地方；但國(guó)內(nèi)現(xiàn)在HPV預(yù)防性疫苗的接種主要在城市發(fā)達(dá)地區(qū)，價(jià)格昂貴且一苗難求.國(guó)產(chǎn)大腸桿菌疫苗為解決這一問題提供了解決方案，在保證疫苗有效性和安全性的同時(shí)，提高了產(chǎn)量，降低了價(jià)格，也為全球范圍內(nèi)低等收入和中等收入國(guó)家的宮頸癌有效預(yù)防提供了可能.

目前沒有一種十分有效、安全性良好的HPV治療性疫苗得到應(yīng)用.雖然美國(guó)Inovio生物制藥公司已將HPV DNA免疫療法VGX-3100推至Ⅲ期臨床試驗(yàn)，并于2019年6月完成Ⅲ期臨床試驗(yàn)198名志愿者招募，研究的最終目標(biāo)是宮頸HSIL的消退以及宮頸中HPV16和(或)18的病毒學(xué)清除，但目前臨床效果尚未可知.

總之，HPV預(yù)防性疫苗已經(jīng)在WHO發(fā)布的《2030年消除宮頸癌全球戰(zhàn)略》中發(fā)揮了重要作用.新一代的HPV疫苗設(shè)計(jì)引入基于結(jié)構(gòu)的疫苗理性設(shè)計(jì)方案，并已經(jīng)取得一定進(jìn)展，這些案例也將為其他復(fù)雜多變的病毒疫苗研發(fā)提供借鑒.HPV治療性疫苗主要針對(duì)HPV的致癌性進(jìn)行干預(yù)，并已取得初步進(jìn)展，然而在對(duì)尖銳濕疣、不典型增生及宮頸癌的治療方面尚未見成效，因此仍需加強(qiáng)對(duì)HPV病毒學(xué)和感染致病機(jī)制的研究.隨著對(duì)HPV研究的進(jìn)一步深入，期待不久的將來預(yù)防性和治療性疫苗能夠雙管齊下，為保護(hù)人類免受HPV感染及其導(dǎo)致的惡性疾病困擾提供終極武器.