羅煒，林夏潔，李玉林，劉昌勝

華東理工大學(xué) 材料學(xué)院，教育部醫(yī)用生物材料工程研究中心，材料生物學(xué)與動態(tài)化學(xué)前沿科學(xué)中心（上海，200237）

0 引言

由于傷口、創(chuàng)傷、燒傷、衰老和手術(shù)引起的皮膚損失和功能障礙可能導(dǎo)致截肢或其他威脅生命的后果，從而極大地影響人類健康［1］。自體移植、同種異體移植和人工植入是皮膚再生的一般方法。自體移植的來源有限，會造成不可避免的損傷和移植部位的并發(fā)癥；同種異體移植則存在免疫排斥和病毒誘導(dǎo)的風(fēng)險［2］。因此，如何開發(fā)具有高生物活性和生物安全性的人造移植物是現(xiàn)代再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中皮膚再生的關(guān)鍵問題。近年來，殼聚糖［3］，膠原蛋白［4］，聚（乳酸-羥基乙酸）［5］，聚（ε-己內(nèi)酯）［6］，和聚乳酸［7］等高分子材料被用于研制不同形式的醫(yī)用敷料，并取得了一定的修復(fù)效果。盡管如此，在創(chuàng)面修復(fù)過程中，感染是導(dǎo)致皮膚修復(fù)失敗的主要原因［6］。因此，結(jié)合原位雜化技術(shù)摻雜抗菌劑于傷口敷料中，能夠阻擋外來病菌或者避免微生物滋生，這是一種高效管理抗菌劑的策略。

聚乳酸的生物相容性好，可生物降解易加工等優(yōu)點使其廣泛用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，通過制成薄膜［8］、納米片［9］、納米顆粒［10］等不同形式用于各種醫(yī)用敷料的開發(fā)，然而其疏水性和生物惰性仍然是限制其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的主要因素。單寧酸作為一種植物來源的天然多酚，由中央葡萄糖分子和沒食子酰基組成［11］，分子中獨特的多酚結(jié)構(gòu)賦予其良好的抗氧化性和一定的抗菌活性［12］。單寧酸可以通過氫鍵作用與細(xì)菌的細(xì)胞膜上蛋白質(zhì)結(jié)合，破壞了細(xì)胞膜的完整性，從而實現(xiàn)抗菌作用［13］。據(jù)報道單寧酸可作為還原劑，能夠簡便、環(huán)保且具有成本效益低在室溫下制備銀納米顆粒（AgNP）［14］。AgNP 尺寸小、比表面積大，通過直接與細(xì)菌細(xì)胞壁接觸，便可釋放有毒金屬離子或生成活性氧（ROS）來發(fā)揮殺菌作用，因此呈現(xiàn)出對多種菌株的殺菌活性。此外，AgNP 能將藥物的不良副作用降至最低，并且不觸發(fā)微生物的耐藥性［15］。將AgNP 與聚乳酸納米纖維膜復(fù)合，有望構(gòu)建具有高抗菌性能的可吸收生物纖維膜。

鑒于此，本研究首先通過噴氣紡絲的方式，構(gòu)建具有模擬胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的納米纖維膜基底。利用氨等離子體技術(shù)在膜表面引入氨基，并通過戊二醛將單寧酸修飾到納米纖維表面，利用單寧酸的還原性成功地將納米銀修飾到纖維膜表面，有效改善了所制備生物膜的親水性能和抗菌活性。該抗菌生物膜有望作為具有生物活性的功能膜用于皮膚創(chuàng)面愈合修復(fù)。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

本文所用的主要試劑如下：聚乳酸（PLLA，［η］=4.1 dL/g，自制）；單寧酸、硝酸銀（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；二氯甲烷、乙醇及其他試劑（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶（美國Hyclone公司）；MTT 粉末、FITC 染色劑（Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司）。

1.2 納米雜化纖維膜的制備

1.2.1 聚乳酸納米纖維膜的制備

將1 g 聚乳酸溶于二氯甲烷/乙醇的混合溶劑（95:5，v/v），制得均一溶液（30 mg/mL）。利用溶液噴紡法（氣流壓力0.2 MPa，接收距離20 cm，噴嘴口徑0.5 mm）制備PLLA 納米纖維膜。所得纖維膜真空干燥60℃24 h 后備用，得干燥樣品備用。

1.2.2 納米雜化纖維膜的等離子體表面處理

將纖維膜放置于等離子體表面活性儀（Femto A，Diener electronic GmbH）的腔體內(nèi)，對纖維膜進(jìn)行表面等離子體處理（氨氣，30 s，處理功率50 W）。將最后處理后的纖維膜命名為PLLA-N纖維膜。

1.2.3 抗菌聚乳酸納米纖維膜的制備

將一定質(zhì)量PLLA-N 纖維膜（5 mm×5 mm）浸入10 mL 7.5%戊二醛溶液中，37 ℃下反應(yīng)2 h。之后加入2 mL 單寧酸溶液（13 mg/mL）進(jìn)行反應(yīng)。6 h 后，將纖維膜取出，用超純水洗滌纖維膜表面未反應(yīng)的戊二醛及單寧酸，之后分別加入10 mL 1.0 mg/mL 和2.0 mg/mL 硝酸銀溶液中，避光37 ℃下反應(yīng)6 h。隨后取出纖維膜，真空干燥24 h，將最后制備所得的纖維膜分別命名為PLLA-1.0Ag 和PLLA-2.0Ag 膜。

1.3 表征

1.3.1 X 射線光電子能譜（XPS）

使用通過X 射線光電子能譜（ESCALAB 250Xi，美國Thermo Fisher 公司）對納米纖維膜的表面元素進(jìn)行表征。

1.3.2 親水性表征

使用接觸角測量儀（JC2000D2，上海中晨數(shù)字技術(shù)設(shè)備有限公司）測定纖維膜的水接觸角以表征其親水性。

1.3.3 X 射線衍射（XRD）

使用X 射線衍射儀（D/max2550VB，日本理學(xué)電機(jī)）測定對納米雜化纖維膜進(jìn)行表征。衍射儀掃描速度為3°/min，0.02°/step，測試角度為10°～80°。

1.3.4 微觀形貌

使用掃描電子顯微鏡（SEM，S-4800N，日本日立公司）對納米膜進(jìn)行形貌表征。樣品噴金50 s，加速電壓15 kV。

1.4 體外細(xì)胞相容性評價

通過MTT 法評價纖維膜的細(xì)胞相容性：將成纖維細(xì)胞（L929）與纖維膜共培養(yǎng)（2 萬/ 孔，24孔板）1 d 和3 d 之后，每孔中加入300 μL MTT溶液（5 mg/mL），放入培養(yǎng)箱孵育4 h。到達(dá)時間后，吸去DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基，每孔加入500 μL二甲基亞砜溶液，使用酶標(biāo)儀（SPECTRA max 384，美國Molecular Devices 公司）對溶液進(jìn)行吸光度測定（檢測波長492 nm）。細(xì)胞增殖率計算公式為：

1.5 抗菌性能評價

使用大腸桿菌對納米膜進(jìn)行抗菌性評價：將納米膜（PLLA，PLLA-1.0Ag，PLLA-2.0Ag）纖維膜放置于24 孔板內(nèi)，紫外照射滅菌后，在每孔中加入大腸桿菌（1.0×106cfu/mL），37 ℃下培養(yǎng)24 h。從每孔中取出100 μL 共培養(yǎng)液均勻涂抹在瓊脂板上，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察瓊脂板上菌落情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 PLLA-N 纖維膜的X 射線光電子能譜表征結(jié)果

PLLA-N 纖維膜的XPS 譜圖（圖1）能夠準(zhǔn)確表明纖維膜表面含N 官能團(tuán)的存在，分析得到該纖維膜表面氮元素的含量為2.2%。即表明在經(jīng)過氨等離子體處理后，纖維膜表面C-N-H 和C=N-C等含N 基團(tuán)增加。

圖1 PLLA-N 纖維膜的XPS 氮元素掃描能譜圖Fig.1 XPS scanning spectra of the PLLA-N membrane

2.2 PLLA-N 纖維膜的親水性表征結(jié)果

為了評估氨等離子技術(shù)對纖維膜親水性的影響，測量得出氨等離子體處理前PLLA 膜的水接觸角為131.9°±3.4°，處理后的PLLA-N 膜的水接觸角為83.3°±8.5°，接觸角降低了36.8%，親水性大幅度提高。由于含氮的官能團(tuán)的存在提高了聚乳酸表面親水基團(tuán)的比例，通過改善材料潤濕性可以提高材料與細(xì)胞間的親和力，改善細(xì)胞黏附［16］。

2.3 PLLA-Ag 纖維膜的微觀形貌

使用掃描電鏡對PLLA-2.0Ag 樣品膜的微觀形貌進(jìn)行表征，結(jié)果如圖2 所示，可以直觀地觀察到纖維表面納米粒子的存在，其粒徑范圍在30 ～60 nm，平均粒徑（45.9±9.7） nm，這說明AgNP 在纖維膜的纖維上成功沉積。

圖2 PLLA-Ag 纖維膜掃描電鏡圖Fig.2 SEM micrographs of the PLLA-Ag nanofibrous membrane (scale bar: 3 μm)

2.4 PLLA-Ag 纖維膜的細(xì)胞相容性評價結(jié)果

使用MTT 法測量PLLA-Ag 纖維膜與L929細(xì)胞共培養(yǎng)1 d 和3 d 后的細(xì)胞存活率（如圖3）。PLLA-1.0Ag 和PLLA-2.0Ag 在1 d 后 的 細(xì) 胞 存活率分別為（103.5±5.7）% 和（100.0±6.2）%，而3 d 后的細(xì)胞成活率均大于90%，說明材料對L929 細(xì)胞增殖沒有明顯的抑制作用，證明PLLAAg 纖維膜的細(xì)胞相容性良好。

圖3 1 天和3 天后纖維膜的細(xì)胞相容性(L929 成纖維細(xì)胞，CON：PLLA-N)Fig.3 Cell viability of L929 cells cultured with nanofibrous membranes for 1 d and 3 d (CON: PLLA-N)

2.5 PLLA-Ag 纖維膜的抗菌性能評價結(jié)果

在抗菌實驗中，將大腸桿菌與PLLA、PLLA-1.0Ag 和PLLA-2.0Ag 纖維膜共培養(yǎng)24 h，觀察并記錄實驗結(jié)果。氨基作為活性位點，能夠利用戊二醛將單寧酸接枝在纖維膜表面。單寧酸帶有多個酚羥基，能夠在纖維膜表面原位還原AgNO3，生成的AgNP 顆粒賦予了納米雜化纖維膜良好的抗菌性能。纖維膜的抗菌效果如圖4 所示，從中可以看出，PLLA-Ag 纖維膜表面的AgNP 含量增加，菌落數(shù)量明顯減少，說明PLLA-2.0Ag 有明顯的抗菌效果。這是由于纖維膜表面被單寧酸所還原的納米銀含量較多所起到的抗菌作用［17］。另一方面，纖維膜表面所帶有的單寧酸也有可能對細(xì)菌有抑制作用［18］。綜上所述，PLLA-Ag 纖維膜擁有作為抗菌敷料的應(yīng)用潛力。

圖4 纖維膜的抗菌圖Fig.4 Antibacterial pictures of nanofibrous membranes

3 結(jié)論

本研究文采用噴氣紡絲、等離子體改性、接枝改性及原位沉積的方法，制備了具有抗菌功能的可吸收聚乳酸生物膜材料。探討了在不同的AgNO3濃度下所制備的納米纖維膜對L929 細(xì)胞的細(xì)胞相容性與抗菌性能。結(jié)果表明，通過噴氣紡絲技術(shù)制備得到PLLA 纖維膜，經(jīng)氨等離子體處理后成功在其表面引入氨基，氨基改善了膜的表面潤濕性提高了PLLA 纖維膜的應(yīng)用價值；利用表面帶氨基的PLLA 纖維膜，在其表面成功接枝單寧酸后，并原位還原生成納米銀顆粒，賦予了材料良好的抗菌性能。這一研究成果可以為可吸收抗菌創(chuàng)傷敷料的開發(fā)提供新的借鑒。