范婧怡，王健

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，鄭州450003

胰腺癌是一種惡性程度很高的惡性腫瘤，患者預(yù)后極差，即使經(jīng)積極治療，患者5年總體生存率仍低于10%［1］。導(dǎo)管腺癌是胰腺癌最常見的病理類型，占80%～90%。胰腺導(dǎo)管腺癌早期診斷較為困難，患者就診時(shí)多處于中晚期，治療效果不理想［2］。目前，胰腺導(dǎo)管腺癌的病因和發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。因此，深入探索胰腺導(dǎo)管腺癌發(fā)病的分子機(jī)制，對尋找腫瘤早期診斷的分子標(biāo)志物具有重要臨床價(jià)值。微小RNA（miRNA）是一類無蛋白編碼功能的RNA 分子，可通過其發(fā)夾結(jié)構(gòu)，調(diào)控下游基因表達(dá)，從而參與多種生物學(xué)過程。大量研究表明，miRNA在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)失調(diào)，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和凋亡［3-4］。miR-196b 基因定位于人染色體7p15.2，能夠參與下游靶基因的表達(dá)調(diào)控，如雷帕霉素靶蛋白，進(jìn)而參與個(gè)體生長發(fā)育、脂肪細(xì)胞分化等生物學(xué)過程［5］。有研究報(bào)道，在腫瘤組織中miR-196b 表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)上調(diào)能夠通過促進(jìn)Fas 等原癌基因表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力［6］。轉(zhuǎn)化生長因子β 受體1（TGFβR1）基因定位于人染色體9q22.33，其編碼的TGFβR1蛋白與TGFβ 結(jié)合后活化，從而激活下游信號(hào)通路，繼而促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移。有研究報(bào)道，在人類腫瘤組織中TGFβR1 異常高表達(dá)［7］。此外，有學(xué)者報(bào)道TGFβR1 基因是miR-196b 新的作用靶點(diǎn)，miR-196b能在轉(zhuǎn)錄后水平促進(jìn)TGFβR1 基因表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展［8］。但目前鮮見胰腺導(dǎo)管腺癌組織miR-196b、TGFβR1 表達(dá)變化的報(bào)道。本研究觀察了胰腺導(dǎo)管腺癌組織miR-196b、TGFβR1 表達(dá)變化，并探討其表達(dá)變化與患者臨床病理特征的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017 年4 月—2020 年1 月鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院收治的胰腺導(dǎo)管腺癌患者88例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)后組織病理學(xué)檢查，符合胰腺導(dǎo)管腺癌診斷；②首次診斷；③接受胰腺癌根治性手術(shù)或姑息性手術(shù)治療；④病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并急慢性胰腺炎者；②合并其他器官惡性腫瘤者；③合并心、肺、腎等重要臟器功能衰竭者。其中，男51 例、女37 例，年齡41～73（53.65 ± 6.8）歲；腫瘤直徑：≤2 cm 47 例，＞2 cm 41 例；腫瘤位置：胰頭部55 例，胰體尾部33 例；病理類型：腺癌59 例，腺鱗癌29 例；組織分化程度：高分化28 例，中低分化60 例；臨床分期［9］：Ⅰ期35 例，Ⅱ、Ⅲ期53 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者或其家屬知情同意并簽屬知情同意書。

1.2 miR-196b、TGFβR1 表達(dá)檢測 取手術(shù)切除的胰腺癌組織和癌旁正常組織各約100 mg，液氮下充分研磨，采用TRIzol 法提取組織總RNA，經(jīng)NanoDrop 2000 超微量分光光度計(jì)檢測，提取的總RNA 濃度和純度合格。然后將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件：25 ℃15 min，40 ℃2 h。以cDNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。miR-196b 上游引物5"-TAC?CATCCTAGACCAGCGTGAC-3"、下游引物5"-ACCT?GGCGGCACTCCTTA-3"，U6 上游引物5′-GCGCCTC?GAGATGCCTTG-3"、下游引物3"-CTGGAGCGTGC?GTGGA-5"；TGFβR1上游引物5"-ACGGCGTTACAGT?GTTTCTG-3"、下游引物 5"-GCACATACAAACG?GCCTATCTC-3"，GAPDH 上游引物5"-TTAGCACG?CATCGCATAATG-3"、下游引物5"-TGGCAATACCTTT?GTTGTCATC-3"。PCR 反應(yīng)體系共20 μL：模板cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，2×SYBR Green Master Mix 10 μL，雙蒸水8 μL；反應(yīng)條件：94 ℃3 min，94 ℃20 s、60 ℃30 s、70 ℃10 s 共40 個(gè)循環(huán)。所有操作在ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上完成。采用2-ΔΔCT法計(jì)算miR-196b、TGFβR1相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson 線性相關(guān)分析法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌組織與癌旁正常組織miR-196b、TGFβR1 表達(dá)比較 胰腺癌組織與癌旁正常組織miR-196b相對表達(dá)量分別為3.422±0.331、1.772±0.213，TGFβR1 相對表達(dá)量分別為2.145 ± 0.317、0.927 ± 0.114。胰腺癌組織miR-196b、TGFβR1 相對表達(dá)量均高于癌旁正常組織（t分別為39.324、33.917，P均＜0.05）。

2.2 胰腺癌組織miR-196b、TGFβR1 表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

表1 胰腺癌組織miR-196b、TGFβR1表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 胰腺癌組織miR-196b 表達(dá)與TGFβR1 表達(dá)的關(guān)系 Pearson 線性相關(guān)分析顯示，胰腺癌組織miR-196b相對表達(dá)量與TGFβR1相對表達(dá)量呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.610，P＜0.05）。

3 討論

胰腺導(dǎo)管腺癌是一種惡性程度非常高的消化系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病率和死亡率近年來呈明顯上升趨勢［10］。目前，外科手術(shù)仍然是胰腺導(dǎo)管腺癌最有效的治療手段，但其起病隱匿，進(jìn)展迅速，多數(shù)患者首診時(shí)即已錯(cuò)過了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)。即使能夠接受外科手術(shù)，術(shù)后也易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后較差［11］。目前，胰腺導(dǎo)管腺癌的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，普遍認(rèn)為是一個(gè)多基因參與、多階段發(fā)展的復(fù)雜生物學(xué)過程，涉及原癌基因活化、抑癌基因功能缺失。深入探索胰腺導(dǎo)管腺癌發(fā)病的分子機(jī)制，將有助于胰腺導(dǎo)管腺癌的早期診斷和靶向治療。

miRNA 位于基因間區(qū)或內(nèi)含子區(qū)域，在核內(nèi)由RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄后進(jìn)一步被切割產(chǎn)生具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體miRNA，經(jīng)Dicer 酶降解后成為成熟miRNA，加入到RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物中，通過與靶基因mRNA 結(jié)合，從而調(diào)控靶基因mRNA 降解或阻遏其轉(zhuǎn)錄后翻譯。miRNA 表達(dá)失調(diào)能夠影響腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。miR-196b是miRNA 家族成員之一，基因定位于人染色體7p15.2，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控其下游基因的表達(dá)，繼而參與機(jī)體的生長、發(fā)育等生物學(xué)過程。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-196b 在肝癌、胃癌等惡性腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)上調(diào)能夠通過激活A(yù)KT 信號(hào)通路，促進(jìn)下游血管內(nèi)皮生長因子等癌基因的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤惡性進(jìn)展［12］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織miR-196b 表達(dá)上調(diào)，提示miR-196b 可能作為一種促癌基因參與胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)生、發(fā)展。但目前miR-196b 在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中表達(dá)上調(diào)的機(jī)制尚不明確，可能與其上游調(diào)控分子長鏈非編碼RNA（lncRNA）有關(guān)。有學(xué)者報(bào)道，lncRNA HOXA10 能夠結(jié)合miR-196b 基因的啟動(dòng)子區(qū)，抑制miR-196b 表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞惡變后，lncRNA HOXA10基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化，導(dǎo)致lncRNA HOXA10表達(dá)降低、miR-196b表達(dá)升高，從而促進(jìn)其下游癌基因的表達(dá)，繼而導(dǎo)致腫瘤惡性進(jìn)展［13］。本研究結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織miR-196 表達(dá)與腫瘤組織分化程度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，表明miR-196b 表達(dá)上調(diào)能夠促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌進(jìn)展，其機(jī)制可能與miR-196b 能夠促進(jìn)其下游靶基因（如GATA6）表達(dá)有關(guān)。GATA6是miR-196b的直接作用靶點(diǎn)，可抑制細(xì)胞的增殖和遷移能力，而miR-196b高表達(dá)能夠降低GATA6 mRNA 的穩(wěn)定性，從而抑制GATA6的抑癌作用［14］。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中存在多條信號(hào)傳導(dǎo)通路過度活化現(xiàn)象，其中TGFβ 信號(hào)傳導(dǎo)通路激活在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。TGFβR1 是TGFβ 信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵受體之一，位于細(xì)胞表面，在與腫瘤微環(huán)境中的TGFβ 結(jié)合后，通過經(jīng)典和非經(jīng)典激活途徑，促進(jìn)SMAD 等轉(zhuǎn)錄因子活化，從而影響其下游靶基因的表達(dá)。在生理狀態(tài)下，TGFβR1 能夠參與細(xì)胞正常的增殖和遷移等生物學(xué)過程，但在腫瘤發(fā)生時(shí)TGFβR1激活，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織TGFβR1表達(dá)升高，提示TGFβR1可能參與胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)生、發(fā)展，其原因與調(diào)控TGFβR1表達(dá)的基因異常有關(guān)。有研究報(bào)道，腫瘤發(fā)生時(shí)具有靶向抑制TGFβR1 表達(dá)功能的miR-142-3p 表達(dá)降低，進(jìn)而引起TGFβ 下游通路的過度活化［15］。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織TGFβR1 表達(dá)與腫瘤組織分化程度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示TGFβR1能夠參與胰腺導(dǎo)管腺癌進(jìn)展，其機(jī)制與TGFβR1 能夠參與調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。有研究報(bào)道，TGFβR1 活化能夠促進(jìn)Snail1、Twist 等轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，導(dǎo)致上皮標(biāo)志物E-鈣黏素表達(dá)降低，而間充質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白表達(dá)升高，引起細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤易發(fā)生局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［16］。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織miR-196b 表達(dá)與TGFβR1 表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。目前miR-196b 與TGFβR1 在胰腺導(dǎo)管腺癌中相互作用的機(jī)制尚不清楚，可能與miR-196b 能夠增強(qiáng)TGFβR1 表達(dá)有關(guān)。有研究表明，miR-10b、miR-346 等多種miRNA 能夠與靶基因的5′端非編碼區(qū)結(jié)合，并通過與翻譯調(diào)控元件相互作用，從而激活靶基因的表達(dá)［17］。此外，有研究還發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中TGFβ 表達(dá)升高，并通過結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的TGFβR1，誘導(dǎo)miR-196b 表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤惡性轉(zhuǎn)化［18］。

綜上所述，胰腺導(dǎo)管腺癌組織miR-196b、TGFβR1 表達(dá)上調(diào)，二者可能協(xié)同參與胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)生、發(fā)展。