張劉平，許政文，張興，何躍

遂寧市中心醫(yī)院，四川遂寧629000

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)其發(fā)病率和病死率均居惡性腫瘤前列。近年隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)飛速發(fā)展，人民生活方式轉(zhuǎn)變，結(jié)腸癌的發(fā)病率不斷上升［1］。外科手術(shù)仍然是當(dāng)前結(jié)腸癌最重要的治療手段，但術(shù)后面臨較高的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)［2］。目前，臨床對(duì)結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移評(píng)估主要依據(jù)臨床隨訪或影像學(xué)證據(jù)，缺少評(píng)估術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物。微小RNA（miRNA）是一類擁有基因調(diào)控功能的RNA，是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心調(diào)控因子，能夠調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過(guò)程［3］。miR-335-5p是miRNA家族成員之一。有研究報(bào)道，miR-335-5p在胰腺癌、卵巢癌等惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)下調(diào)能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移［4-5］。癌胚抗原（CEA）和糖類抗原19-9（CA19-9）是臨床常用的腫瘤診斷生物標(biāo)志物，在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，但對(duì)診斷結(jié)腸癌的特異性不強(qiáng)［6-8］。本研究觀察了結(jié)腸癌患者血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平變化，并探討三者對(duì)結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017 年5 月—2019 年5 月遂寧市中心醫(yī)院收治的結(jié)腸癌患者89 例（觀察組）。所有患者經(jīng)術(shù)后組織病理學(xué)檢查明確診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合結(jié)腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；②首次診斷；③接受腹腔鏡手術(shù)，術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療；④臨床病理資料和隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位惡性腫瘤者；②合并心、肝、腎等重要臟器功能不全者；③發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；④預(yù)計(jì)生存期不足3 個(gè)月者。其中，男48 例、女41 例，年齡53～69（62.03 ±4.82）歲；腫瘤直徑：≥3 cm 46 例，＜3 cm 43 例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期38 例，Ⅲ、Ⅳ期51 例；浸潤(rùn)深度：未侵及漿膜層43例，侵及漿膜層46例；組織分化程度：低中分化53例，高分化36例。同期選擇遂寧市中心醫(yī)院收治的結(jié)腸良性病變患者61例（對(duì)照組），均接受腹腔鏡手術(shù)切除病變組織，并經(jīng)術(shù)后組織病理學(xué)檢查排除惡性腫瘤。同時(shí)，排除合并其他部位惡性腫瘤者，合并心、肝、腎等重要臟器功能不全者，合并急慢性感染、免疫性疾病、精神障礙性疾病者。其中，男39 例、女22 例，年齡51～70（62.09 ± 4.17）歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)遂寧市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象或其家屬知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 血清miR-335-5p 檢測(cè) 采集所有研究對(duì)象術(shù)前外周靜脈血3 mL，注入干燥的試管內(nèi)，室溫靜置30 min，3 000 r/min 離心10 min、離心半徑10 cm，留取上層血清，-80 ℃冰箱保存。采用TRIzol法提取血清中的總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0。按照M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說(shuō)明，將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后按PCR 擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明進(jìn)行擴(kuò)增。所有引物序列由上海基康生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。miR-335-5p 上游引物5"-ACGCT?CAGTTTAATGCTAATCGTGA-3"，下游引物5"-ATTCCATGTTGTCCACTGTCTGTG-3"；U6 上游引物5"-AGAGAAGATTAGCATGGACCCTG-3"，下游引物5"-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3"。PCR反應(yīng)體系：2×SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ12.5 μL，dNTP 1.6 μL，Taq DNA 聚合酶1 μL，上下游引物各1 μL，DEPC 水補(bǔ)足至25 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸10 s 共40 個(gè)循環(huán)。所有操作在CFX96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀上完成。以U6 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算miR-335-5p 相對(duì)表達(dá)量。

1.3 血清CEA、CA19-9 檢測(cè) 采集所有研究對(duì)象術(shù)前外周靜脈血3 mL，注入干燥的試管內(nèi)，室溫靜置30 min，3 000 r/min 離心10 min、離心半徑10 cm，留取上層血清，-80 ℃冰箱保存。采用COBAS 6000電化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀檢測(cè)血清CEA、CA19-9，試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。所有操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.4 隨訪 結(jié)腸癌患者腹腔鏡術(shù)后定期行腸鏡、腹部CT 或B 超、胸部X 線等檢查，每6 個(gè)月一次，評(píng)估結(jié)腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況。結(jié)腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)腸癌術(shù)后出現(xiàn)新的結(jié)腸癌病灶或出現(xiàn)盆腔轉(zhuǎn)移灶，伴或不伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶。隨訪截至2020 年5 月，以出現(xiàn)結(jié)腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移為終點(diǎn)事件。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，結(jié)果比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier 法。危險(xiǎn)因素分析采用Cox 回歸模型。采用受試者工作特征（ROC）曲線評(píng)估血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平對(duì)結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平比較 見(jiàn)表1。

表1 兩組血清miR-335-5p、CEA、CA19-9水平比較（±s）

表1 兩組血清miR-335-5p、CEA、CA19-9水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別觀察組對(duì)照組CA19-9（kU/L）38.49±6.59*26.16±5.13 n 89 61 miR-335-5p 0.91±0.33*2.25±0.69 CEA（ng/mL）6.53±2.06*2.95±0.71

2.2 血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平與結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 結(jié)腸癌患者腹腔鏡術(shù)后隨訪12～36 個(gè)月、中位隨訪時(shí)間19 個(gè)月，無(wú)失訪病例。截至末次隨訪，89 例結(jié)腸癌患者腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移40 例。分別以血清miR-335-5p、CEA、CA19-9水平的均數(shù)為臨界值，將患者分為miR-335-5p低水平者46 例與miR-335-5p 高水平者43 例、CEA低水平者40 例與CEA 高水平者49 例、CA19-9 低水平者42 例與CA19-9 高水平者47 例。miR-335-5p、CEA、CA19-9 低水平者腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率分別為58.70%（27/46）、30.00%（12/40）、30.95%（13/42），miR-335-5p、CEA、CA19-9 高水平者分別為30.23%（13/43）、57.14%（28/49）、57.45%（27/47）。miR-335-5p 低水平者腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高于miR-335-5p 高水平者，而CEA、CA19-9 低水平者腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率低于CEA、CA19-9 高水平者（χ2分別為8.618、6.521、6.100，P均＜0.05）。

2.3 影響結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素分析 影響結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的單因素分析結(jié)果見(jiàn)表2。以結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移（0=否，1=是）為因變量，以TNM分期（0=Ⅰ、Ⅱ期，1=Ⅲ、Ⅳ期）、浸潤(rùn)深度（0=未侵及漿膜層，1=侵及漿膜層）、組織分化程度（0=高分化，1=低中分化）、miR-335-5p（連續(xù)變量）、CEA（連續(xù)變量）、CA19-9（連續(xù)變量）為自變量，納入Cox 回歸模型，結(jié)果顯示，TNM分期、miR-335-5p、CEA、CA19-9 是影響結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素（P均＜0.05）。見(jiàn)表3。

表2 影響結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的單因素分析結(jié)果

2.4 血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平對(duì)結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值 繪制血清miR-335-5p、CEA、CA19-9水平單獨(dú)和聯(lián)合預(yù)測(cè)結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的ROC 曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清miR-335-5p水平預(yù)測(cè)結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的曲線下面積（AUC）為0.876（95%CI：0.799～0.953），其cut off 值為1.03，此時(shí)其預(yù)測(cè)結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的靈敏度為82.50%、特異度為79.59%；血清CEA 水平預(yù)測(cè)結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的AUC為0.797（95%CI：0.706～0.898），其cut off 值為5.32 ng/mL，此時(shí)其預(yù)測(cè)結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的靈敏度為77.50%、特異度為71.43%；血清CA19-9 水平預(yù)測(cè)結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的AUC為0.722（95%CI：0.614～0.831），其cut off 值為30.18 kU/L，此時(shí)其預(yù)測(cè)結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的靈敏度為67.50%、特異度為63.27%；血清miR-335-5p、CEA、CA19-9水平聯(lián)合預(yù)測(cè)結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的AUC為0.959（95%CI：0.915～1.000），其預(yù)測(cè)結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的靈敏度為95.00%、特異度為97.96%。血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平聯(lián)合預(yù)測(cè)結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的AUC明顯高于血清miR-335-5p、CEA、CA19-9水 平 單 獨(dú)（Z分 別 為2.014、2.435、2.768，P均＜0.05）。見(jiàn)圖1。

表3 影響結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的Cox回歸分析結(jié)果

圖1 血清miR-335-5p、CEA、CA19-9水平預(yù)測(cè)結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的ROC曲線

3 討論

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具有高度侵襲性和轉(zhuǎn)移性，是全世界惡性腫瘤死亡的主要原因。結(jié)腸癌早期無(wú)典型癥狀，大多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過(guò)了根治性手術(shù)的最佳時(shí)機(jī)［9］。外科手術(shù)是結(jié)腸癌最主要的治療手段，但術(shù)后面臨較高的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)［2］。目前，臨床對(duì)結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移評(píng)估主要依據(jù)臨床隨訪或影像學(xué)證據(jù)，缺少評(píng)估術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物。因此，探索結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物標(biāo)志物對(duì)準(zhǔn)確判斷患者預(yù)后具有重要意義。

CEA 是首先從結(jié)腸癌和胚胎組織中提取的一種具有人類胚胎抗原特性的酸性糖蛋白，存在于內(nèi)胚層細(xì)胞分化而來(lái)的癌細(xì)胞表面。結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤患者血清CEA 水平明顯升高，可作為一種廣譜腫瘤標(biāo)志物，用于惡性腫瘤的診斷、鑒別診斷、病情監(jiān)測(cè)或療效評(píng)估等。CA19-9 是一種低聚糖類腫瘤相關(guān)的糖類抗原，由胰腺、膽管、胃、結(jié)腸、子宮內(nèi)膜等組織合成，正常情況下血清中的含量很少，但在良惡性腫瘤患者血清中的含量明顯升高，可作為腫瘤診斷和鑒別診斷的生物標(biāo)志物。雖然CEA、CA19-9被推薦為結(jié)直腸癌預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物，但二者的特異度不強(qiáng)［7-8］。miR-335-5p 是miRNA家族成員之一，其表達(dá)失調(diào)與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。AN等［10］研究認(rèn)為，miR-335-5p可通過(guò)抑制下游癌基因十字形結(jié)構(gòu)域蛋白2C表達(dá)，從而抑制胰腺癌進(jìn)展。LIU 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-335-5p表達(dá)可抑制重組人BCL2樣2蛋白表達(dá)，增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的化療敏感性。DU等［12］研究報(bào)道，miR-335-5p 可與Rho 相關(guān)的卷曲蛋白激酶1（ROCK1）3′端非編碼區(qū)直接結(jié)合，進(jìn)而抑制ROCK1 表達(dá)，阻止轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1介導(dǎo)的肺癌細(xì)胞侵襲和遷移。此外，miR-335-5p 還可靶向B7 同源體3（B7-H3）抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移［13］，而miR-335-5p 表達(dá)缺失可上調(diào)B7-H3表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力，從而引起腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［14］。miR-335-5p表達(dá)受競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性分化拮抗非蛋白編碼RNA（DAN?CR）調(diào)控，DANCR 能夠通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-335-5p而調(diào)控ROCK1表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等［15-17］。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組血清miR-335-5p 水平低于對(duì)照組，而血清CEA、CA19-9 水平高于對(duì)照組；以血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平的均數(shù)為臨界值，將患者分為miR-335-5p、CEA、CA19-9 低水平者與高水平者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-335-5p 低水平者腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高于miR-335-5p 高水平者，而CEA、CA19-9 低水平者腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率低于CEA、CA19-9 高水平者。提示血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平可能與結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究單因素分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移可能還與TNM 分期、浸潤(rùn)深度和組織分化程度有關(guān)；Cox 回歸分析發(fā)現(xiàn)，TNM 分期、miR-335-5p、CEA、CA19-9是影響結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素。進(jìn)一步表明血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平均與結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究ROC曲線分析顯示，血清CEA、CA19-9水平預(yù)測(cè)結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的AUC 分別為0.797、0.722，其預(yù)測(cè)靈敏度分別為77.50%、67.50%，特異度分別為71.43%、63.27%，證實(shí)血清CEA、CA19-9 水平對(duì)結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移均具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，但二者的靈敏度和特異度不理想；miR-335-5p 預(yù)測(cè)結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的AUC 為0.876，其預(yù)測(cè)靈敏度為82.50%、特異度為79.59%，說(shuō)明miR-335-5p可作為預(yù)測(cè)結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物；血清miR-335-5p、CEA、CA19-9 水平聯(lián)合預(yù)測(cè)結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的AUC 為0.959，其預(yù)測(cè)靈敏度為95.00%、特異度為97.96%。三者聯(lián)合預(yù)測(cè)結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的效能明顯高于三者單獨(dú)，提示多種生物標(biāo)志物聯(lián)合對(duì)結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值更高。

綜上所述，結(jié)腸癌患者血清miR-335-5p 水平降低，而血清CEA、CA19-9 水平升高，三者水平變化與結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。miR-335-5p、CEA、CA19-9 可作為預(yù)測(cè)結(jié)腸癌腹腔鏡術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的血清生物學(xué)指標(biāo)。