呂夢(mèng)，王健

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，鄭州450003

胰腺癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。近年來(lái)，隨著我國(guó)居民生活方式轉(zhuǎn)變和生活質(zhì)量提高，胰腺癌的發(fā)病率明顯上升。胰腺癌起病隱匿，早期診斷困難，能夠早期診斷并接受根治性手術(shù)者僅占5%～15%，多數(shù)患者確診時(shí)已屬中晚期，治療效果不理想，預(yù)后極差［1］。因此，早期篩查、診斷進(jìn)而早期治療對(duì)延長(zhǎng)胰腺癌患者生存時(shí)間具有重要意義。有研究表明，糖類抗原（CA）和長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用［2］。CA19-9是一種存在于血液循環(huán)的胃腸道腫瘤相關(guān)抗原，并且不受妊娠、吸煙、年齡等因素影響，是迄今發(fā)現(xiàn)的對(duì)胰腺癌敏感度最高的腫瘤標(biāo)志物［3］。但鑒于腫瘤標(biāo)志物單項(xiàng)檢測(cè)具有一定局限性，在臨床上往往聯(lián)合檢測(cè)多種腫瘤標(biāo)志物，以提高診斷準(zhǔn)確率。HOXA 末端轉(zhuǎn)錄本反義RNA（HOTTIP）屬于lncRNA家族成員之一，其作為分子向?qū)Э商禺愋赃B接并募集混合系白血病復(fù)合體/WD 重復(fù)蛋白5，激活并轉(zhuǎn)錄HOXA 基因，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)過程。有研究報(bào)道，lncRNA HOTTIP 與多種消化系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［4］。但目前鮮有血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平聯(lián)合診斷胰腺癌的報(bào)道。為此，本研究探討了血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平對(duì)胰腺癌的診斷價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2019 年1 月—2020 年1 月鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院收治的胰腺癌患者79 例（胰腺癌組）。所有患者符合《胰腺癌綜合診治中國(guó)專家共識(shí)（2014 年版）》［5］中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)術(shù)后組織病理學(xué)檢查證實(shí)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合胰腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；②TNM 分期［6］Ⅰ～Ⅲ期；③年齡≥18 歲；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他良惡性腫瘤者；②合并自身免疫性疾病者；③合并心血管疾病者；④合并急慢性感染者；⑤合并血液系統(tǒng)疾病者。其中，男54例、女25例，年齡46～82（61.58±4.65）歲，BMI 19～29（25.32 ± 2.15）kg/m2，有吸煙史30 例，有飲酒史15 例。同期選擇鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院收治的胰腺炎患者63 例（胰腺炎組），男43 例、女20例，年 齡43～85（61.28 ± 3.74）歲，BMI 18～28（24.97 ± 2.23）kg/m2，有吸煙史6 例，有飲酒史17例。同期另選在鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院體檢健康的志愿者50例（對(duì)照組），男34例、女16例，年齡40～80（60.27±4.36）歲，BMI 18～28（24.87±2.18）kg/m2，有吸煙史3 例，有飲酒史9 例。三組性別、年齡、BMI、吸煙史、飲酒史等臨床資料具有可比性。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批文號(hào)：2018-10-08F），所有研究對(duì)象知情同意并簽屬知情同意書。

1.2 血漿CA19-9 檢測(cè) 所有研究對(duì)象入組后，采集清晨空腹肘靜脈血5 mL，3 000 r/min離心10 min、離心半徑8 cm，留取上層血漿，置于-80 ℃冰箱保存。采用ELISA 法檢測(cè)血漿CA19-9。所有操作嚴(yán)格按ELISA試劑盒說明進(jìn)行。

1.3 血漿lncRNA HOTTIP 檢測(cè) 所有研究對(duì)象入組后，采集清晨空腹肘靜脈血5 mL，EDTA-K2抗凝，3 000 r/min 離心10 min、離心半徑10 cm，留取上層血漿，置于-80 ℃冰箱保存。待標(biāo)本成批后，按總RNA 提取試劑盒說明提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)鑒定，提取的總RNA 純度和濃度合格，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按去除基因組DNA 試劑盒說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 為模板，按實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒說明進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。引物序列：lncRNA HOTTIP 上游引物5"-AGTGTGTCATAGAGCTTCCT?GTTTCATCTCCCAGT-3"，下游引物5"-TGGAAC?CAGGCCCCAGGGAATCTTTCAGCTGCATT-3"；GAP?DH 上游引物5"-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3"，下游引物5"-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3"。按實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒說明配制反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：95 ℃5 min，95 ℃30 s、60 ℃30 s、72 ℃30 s共45個(gè)循環(huán)。由ABI 7500 系統(tǒng)軟件SDS 自動(dòng)獲取閾值循環(huán)數(shù)（CT）。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算lncRNA HOTTIP相對(duì)表達(dá)量。

1.4 資料收集與分析 收集胰腺癌患者性別、年齡、BMI、吸煙史、飲酒史、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期等臨床資料，分析血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP水平與患者臨床病理特征的關(guān)系。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析法。采用受試者工作特征（ROC）曲線評(píng)估血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平對(duì)胰腺癌的診斷價(jià)值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平比較見表1。

表1 三組血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP水平比較（ ±s）

表1 三組血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP水平比較（ ±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與胰腺炎組比較，#P＜0.05。

組別n對(duì)照組胰腺炎組胰腺癌組lncRNA HOTTIP相對(duì)表達(dá)量0.54±0.05 0.57±0.17 1.31±0.29*#50 63 79 CA19-9（U/mL）23.36± 7.83 26.78± 8.47 490.26±147.78*#

2.2 血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平與胰腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 見表2。

表2 血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP水平與胰腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 胰腺癌患者血漿CA19-9 水平與血漿lncRNA HOTTIP 水平的關(guān)系 Pearson 相關(guān)分析顯示，胰腺癌患者血漿CA19-9 水平與血漿lncRNA HOTTIP 水平呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.570，P＜0.05）。

2.4 血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平診斷胰腺癌的效能分析 繪制血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP水平單獨(dú)或聯(lián)合診斷胰腺癌的ROC 曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血漿CA19-9 水平診斷胰腺癌的曲線下面積（AUC）為0.799（95%CI：0.707～0.872），其最佳截?cái)嘀禐?12.59 U/mL，此時(shí)其診斷胰腺癌的敏感度為77.28%、特異度為64.67%；血漿lncRNA HOTTIP水平診斷胰腺癌的AUC為0.859（95%CI：0.775～0.920），其最佳截?cái)嘀禐?.75，此時(shí)其診斷胰腺癌的敏感度為68.08%、特異度為82.15%；血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平聯(lián)合診斷胰腺癌的AUC為0.920（95%CI：0.848～0.965），其診斷胰腺癌的敏感度為88.54%、特異度為91.06%。血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平聯(lián)合時(shí)診斷胰腺癌的AUC高于血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP水平單獨(dú)時(shí)（Z分別為3.010、2.174，P均＜0.05）。見圖1。

圖1 血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP水平診斷胰腺癌的ROC曲線

3 討論

據(jù)全球疾病負(fù)擔(dān)研究報(bào)道，2017 年我國(guó)胰腺癌的發(fā)病率和病死率分別為5.92/10 萬(wàn)、6.02/10 萬(wàn)，較1990 年分別增長(zhǎng)了180.45%、184.80%［7］，已成為威脅我國(guó)居民健康的一大殺手。有研究認(rèn)為，早期診斷和根治性手術(shù)治療是影響胰腺癌患者預(yù)后的重要因素［8］。組織病理學(xué)檢查是目前診斷胰腺癌的金標(biāo)準(zhǔn)。但胰腺位于腹膜后，位置較深并且毗鄰血管，周圍結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以獲取病變組織。超聲、MRI、CT等影像學(xué)檢查是診斷胰腺癌的常用方法，但由于胰腺位置和周圍結(jié)構(gòu)的原因，缺乏足夠的敏感度和特異度，特別是直徑＜2 cm 的病變組織，診斷準(zhǔn)確率較低。腫瘤標(biāo)志物是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生并釋放入血液的多肽、激素、蛋白抗原等物質(zhì)，正常人體內(nèi)含量極低。近年來(lái)，隨著生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，許多腫瘤標(biāo)志物研究取得了較大進(jìn)展，有效地彌補(bǔ)了影像學(xué)診斷滯后的缺點(diǎn)。

CA19-9 是一種存在于血液循環(huán)的胃腸道腫瘤相關(guān)抗原，與Lewis 血型成分有關(guān)，非腫瘤細(xì)胞特有，也存在于結(jié)腸、胃、胰腺等正常組織細(xì)胞中。生理狀態(tài)下，人體內(nèi)CA19-9 含量極低，僅在某些惡性腫瘤發(fā)生時(shí)明顯升高，是迄今發(fā)現(xiàn)的對(duì)胰腺癌診斷敏感度最高的腫瘤標(biāo)志物［9］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組血漿CA19-9 水平明顯高于胰腺炎組和對(duì)照組，而胰腺炎組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示胰腺癌患者血漿CA19-9水平明顯升高，并且不受急慢性胰腺炎癥的影響。本研究結(jié)果顯示，血漿CA19-9 水平與胰腺癌腫瘤直徑、TNM 分期有關(guān)，隨著胰腺癌腫瘤體積增大和TNM 分期升高，血漿CA19-9 水平逐漸升高，提示血漿CA19-9 水平能夠反映胰腺癌病情程度。隨著胰腺癌病情加重，細(xì)胞變性壞死增多，組織破壞嚴(yán)重，導(dǎo)致大量的CA19-9釋放進(jìn)入血液循環(huán)。同時(shí)，胰腺癌細(xì)胞破壞可引起胰管梗阻，導(dǎo)致胰島纖維化，降低或延遲胰島素分泌進(jìn)而引起糖代謝紊亂，在高糖狀態(tài)下，葡萄糖與Lewis血型物質(zhì)寡糖基序發(fā)生非酶促反應(yīng)，連接Lewis血型物質(zhì)還原端和非還原端，從而引起血液CA19-9水平升高［10］。DOLSCHEID-POMMERICH 等［11］研究報(bào)道，在健康志愿者、非腫瘤性疾病及惡性腫瘤患者血清中均檢測(cè)到CA19-9，但相比惡性腫瘤患者，健康志愿者和非腫瘤性疾病患者血清CA19-9 水平處于低水平或一過性升高，提示血清CA19-9水平升高與惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)。但也有研究報(bào)道，胰腺癌患者腫瘤直徑和TNM 分期與血清CA19-9 水平無(wú)關(guān)［12］，可能與入選病例的Lewis 血型抗原為陰性有關(guān)。這從側(cè)面反映不能單純以血漿CA19-9 水平來(lái)判斷腫瘤大小和臨床分期。因此，在臨床上需要聯(lián)合其他腫瘤標(biāo)志物以提高診斷效能，彌補(bǔ)單項(xiàng)檢測(cè)的不足。

lncRNA 為一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過200 nt 的非編碼RNA 分子。隨著基因測(cè)序、基因芯片等技術(shù)的不斷發(fā)展，目前已發(fā)現(xiàn)約3 萬(wàn)種lncRNA。研究表明，lncRNA 能夠在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)蛋白編碼基因的表達(dá)，可作為癌基因或抑癌基因的調(diào)控因子，參與調(diào)節(jié)腫瘤的生物學(xué)行為［13］。lncRNA HOTTIP是一種定位于HOXA 基因5′末端的lncRNA。有研究認(rèn)為，lncRNA HOTTIP具備原癌基因特征，可促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的增殖［14］。LI 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌細(xì)胞lncRNA HOTTIP 高表達(dá)，其高表達(dá)能夠促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展；通過siRNA干擾下調(diào)胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞lncRNA HOTTIP表達(dá)后，胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞的增殖、侵襲等能力明顯降低，對(duì)化療藥物的敏感度明顯升高。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組血漿lncRNA HOT?TIP 水平明顯高于胰腺炎組和對(duì)照組，而胰腺炎組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示胰腺癌患者血漿lncRNA HOTTIP 水平明顯升高，并且不受急慢性胰腺炎癥的影響。lncRNA HOTTIP可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-137，從而抑制miR-137 的抑癌作用，激活磷脂酰肌醇3-激酶信號(hào)通路，磷脂酰肌醇3-激酶信號(hào)通路被激活則會(huì)磷酸化信號(hào)通路中的雷帕霉素靶蛋白和蛋白激酶B，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)正常細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和凋亡抵抗，導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［16］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血漿lncRNA HOTTIP 水平與胰腺癌腫瘤直徑和TNM 分期有關(guān)，這可能與lncRNA HOTTIP 的凋亡抑制作用有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA HOTTIP 能夠通過抑制促凋亡基因Bcl-2相關(guān)X 蛋白表達(dá)，進(jìn)而激活β 連環(huán)蛋白細(xì)胞信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞程序性死亡過程，引起腫瘤細(xì)胞過度增殖和凋亡抑制，最終導(dǎo)致腫瘤惡性進(jìn)展［17］。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者血漿CA19-9水平與血漿lncRNA HOTTIP 水平呈正相關(guān)關(guān)系，這可能與lncRNA HOTTIP 能夠調(diào)控CA19-9 水平有關(guān)。研究表明，lncRNA HOTTIP能夠通過負(fù)性調(diào)控miRNA表達(dá)，導(dǎo)致CA19-9 水平升高［18］。本研究ROC 曲線分析顯示，血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平單獨(dú)檢測(cè)時(shí)對(duì)胰腺癌的診斷均具有一定價(jià)值，但二者聯(lián)合時(shí)診斷胰腺癌的AUC 明顯高于二者單獨(dú)時(shí)，提示血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平聯(lián)合檢測(cè)能夠提高胰腺癌的診斷效能。

綜上所述，胰腺癌患者血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平升高，二者水平升高與胰腺癌病情進(jìn)展密切相關(guān)；血漿CA19-9、lncRNA HOTTIP 水平對(duì)胰腺癌的診斷均具有一定價(jià)值，二者聯(lián)合時(shí)診斷價(jià)值更高。但由于本研究樣本量有限且存在選擇偏倚，其結(jié)論還需多中心、大樣本量研究進(jìn)一步證實(shí)。