劉航，盧文卿，包博文，鄭雪瑩，李冬陽，王多，車曉芳

中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，沈陽110001

胃癌是臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在我國其發(fā)病率居各類惡性腫瘤的第3位。大多數(shù)胃癌患者在初診時已屬中晚期，目前的治療手段雖能在一定程度上改善患者預后，但其5 年生存率仍然較低?，F(xiàn)有的分子預后模型和只針對單一病理類型或臨床分期進行地預后評估，并未綜合考慮相關分子家族在胃癌中的整體功能和臨床應用，具有一定局限性。因此，從分子家族功能角度出發(fā)，篩選合適的分子標志物，并將其納入胃癌預后預測模型，對準確評估胃癌患者預后具有重要意義。凝血酶原（TSP）家族是一類具有Ⅱ、Ⅲ型重復序列且羧基末端區(qū)域高度同源的凝血酶原蛋白，共有TSP1、TSP2、TSP3、TSP4、TSP5五個家族成員。TSP家族主要存在于細胞外基質中，可通過與不同的細胞受體結合而參與血管生成。TSP家族能夠參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，但其在胃癌中作用的研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)，TSP2 和TSP5 是胃癌發(fā)生的危險因素［1-2］，而TSP4 則是胃癌發(fā)生的保護因素［3］，這表明TSP家族成員在胃癌中的作用不盡相同。2020年3月—6月，本研究利用人類腫瘤相關的基因表達匯編（GEO）數(shù)據(jù)庫中胃癌數(shù)據(jù)集，篩選出TSP家族中影響胃癌預后的獨立危險因素并構建預測胃癌預后的風險評分（RS）模型，旨在為胃癌預后預測提供科學依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 資料提取 登錄GEO數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm. nih. gov/geo），從GEO 數(shù)據(jù)庫中下載胃癌樣本量最大的GSE62254 數(shù)據(jù)集，獲取胃癌樣本轉錄組測序表達數(shù)據(jù)和性別、年齡、Lauren分型、臨床分期、總生存期等臨床資料。在排除生存資料缺失樣本后，最終納入胃癌患者283例。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)集分組與RS 計算 以283 例胃癌患者TSP1～TSP5 mRNA 相對表達量的中位數(shù)為臨界值，將患者分為TSP高表達者與TSP低表達者。利用Cox比例風險回歸模型篩選影響胃癌預后的獨立危險因素（X）并計算其對應的偏回歸系數(shù)（β）。采用加權法構建RS 公 式，即RS=β1×exp X1+β2×exp X2+…+βn×exp Xn。根據(jù)RS的中位數(shù)進行二分類，低于RS中位數(shù)的樣本為低RS者、高于RS中位數(shù)的樣本為高RS者。

1.2.2 RS 效能評估 基于RS 和患者生存狀態(tài)，繪制不同RS下的受試者工作特征（ROC）曲線，并計算相應的曲線下面積（AUC）。根據(jù)AUC 評估不同RS預測胃癌患者預后的準確性，篩選評價效能最佳的RS模型。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。生存分析采用Cox 比例風險回歸模型、Kaplan-Meier 法。利用R3.3 軟件中的pROC 包和nsROC 包（http：//www. r-project. org/）繪制ROC 曲線，并通過DeLong 檢驗進行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 基于TSP 家族的胃癌預后風險評估模型RS1建立與驗證 單因素Cox回歸分析顯示，TSP1、TSP3和TSP5 可能與胃癌患者預后有關（P 均＜0.05）；多因素Cox 回歸分析顯示，TSP3、TSP5 是影響胃癌患者預后的獨立危險因素（P均＜0.05）。見表1。基于TSP3、TSP5 mRNA 表達和Cox 回歸分析，計算其對應的β，構建RS1，即RS1=β1×exp TSP3+β2×exp TSP5（β 為偏回歸系數(shù)，exp TSP 為TSP mRNA 相對表達量）。經(jīng)計算，RS1 的中位數(shù)為5.945 68，以此為臨界值將患者分為高RS1 者與低RS1 者，高RS1 者生存期明顯低于低RS1 者（P＜0.05），RS1 預測胃癌患者預后的AUC為0.663。見圖1、2。

2.2 RS1與胃癌患者臨床病理特征的關系 見表2。

2.3 基于RS1 的胃癌預后風險評估模型RS2 建立與驗證 為進一步提高預后評估模型的準確性，建立基于RS1 的胃癌預后風險評估模型RS2。單因素Cox回歸分析顯示，T分期、N分期、M分期、Lauren分型和RS1 可能與胃癌患者預后有關（P均＜0.05）。多因素Cox 回歸分析顯示，T 分期、N 分期、M 分期和RS1 是影響胃癌患者預后的獨立危險因素（P均＜0.05）。見表3。基于T 分期、N 分期、M 分期和RS1的賦值以及Cox 回歸分析中相對應的β，構建RS2，即RS2=β1X1+β2X2+β3X3+β4X4（β為偏回歸系數(shù)，X為預后獨立危險因素的賦值）。經(jīng)計算，RS2 的中位數(shù)為6.604 39，以此為臨界值將患者分為高RS2者與低RS2者，高RS2者生存期明顯低于低RS2者（P＜0.01），RS2預測胃癌患者預后的AUC為0.795。見圖3、4。

2.4 基于TSP 家族的RS 評分與傳統(tǒng)基于臨床病理特征的預后模型預測效能比較 為了比較基于TSP家族的RS 評分與傳統(tǒng)基于臨床病理特征預后模型的優(yōu)劣，本研究構建了僅基于T 分期、N 分期、M 分期的RS3，即RS3=β1X1+β2X2+β3X3（β為偏回歸系數(shù)，X 為T 分期、N 分期、M 分期的賦值）。經(jīng)計算，RS3的中位數(shù)為2.7，以此為臨界值將患者分為高RS3者與低RS3 者。RS3 預測胃癌患者預后的AUC為0.767。DeLong檢驗發(fā)現(xiàn)，RS2預測胃癌患者預后的AUC明顯高于RS1、RS3（P均＜0.05）。見圖5、6。

表1 TSP1～TSP5 mRNA表達影響胃癌患者預后的單因素和多因素Cox回歸分析結果

圖1 高RS1者與低RS1者的生存曲線

圖2 RS1預測胃癌患者預后的ROC曲線

表2 RS1與胃癌患者臨床病理特征的關系（例）

3 討論

由于胃癌發(fā)病隱匿，大多數(shù)患者初診時已屬中晚期，錯過了根治性手術的最佳時機，5 年生存率較低?，F(xiàn)有的分子預后模型和只針對單一病理類型或臨床分期進行地預后評估，并未綜合考慮相關分子家族在胃癌中的整體功能和臨床應用，具有一定局限性。如ZHOU 等［4］建立了由TSP5、SHH、NF1、AP4B1、MATN3、CCL8 組成的對Ⅲ期和Ⅳ期根治性手術聯(lián)合放化療胃癌患者預后評估模型，但該模型并不適用于所有胃癌患者。因此，建立有效的預后評估模型對判斷胃癌患者預后具有重要意義。

表3 影響胃癌患者預后的單因素和多因素Cox回歸分析結果

圖3 高RS2者與低RS2者的生存曲線

圖4 RS2預測胃癌患者預后的ROC曲線

圖5 RS3預測胃癌患者預后的ROC曲線

圖6 RS1、RS2、RS3預測胃癌患者預后的ROC曲線

TSP 家族是一類存在于細胞外基質的血小板反應蛋白，可參與血管生成、炎癥反應、免疫應答等生物學過程［5］。越來越多研究表明，TSP家族成員與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。有研究報道，沉默TSP1可促進結直腸癌細胞增殖、侵襲和遷移［6］，提示TSP1 可作為結直腸癌進展的抑制因子。宮頸癌組織TSP2 低表達可提示患者預后不良［7］，而在胰腺癌、肺癌和黑色素瘤組織中TSP2 高表達，并且其表達越高，患者預后越差［8-9］。TSP3在骨肉瘤和慢性粒細胞性白血病中高表達，且其高表達與患者預后不良有關，但在肺癌中TSP3 則作為保護因素。TSP5被證實在腸癌、乳腺癌、肝癌和前列腺癌組織中高表達，并且其高表達與患者預后不良有關。以上研究證實，TSP 家族各成員在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮的作用不同。目前，TSP2、TSP4、TSP5已被證實與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關。有學者利用全基因組表達譜分析發(fā)現(xiàn)，TSP2、TSP5在胃癌組織中表達上調(diào)，且其表達上調(diào)與患者預后不良有關［1-2］。HUANG 等［3］研究發(fā)現(xiàn)，TSP4 低表達與胃癌患者總生存期短密切相關；他們還發(fā)現(xiàn)，成纖維細胞生長因子受體2可通過PI3K-AKT-mTOR 信號通路下調(diào)TSP4 表達，從而促進胃癌細胞增殖、侵襲和遷移。但目前尚無綜合評估TSP家族對胃癌預后影響的報道。

本研究綜合分析了TSP家族在胃癌預后中的作用，結果發(fā)現(xiàn)TSP3、TSP5 是影響胃癌患者預后的獨立危險因素。目前，關于TSP3的作用機制尚不完全清楚。有研究報道，TSP3 在心肌中可通過抑制整合素的功能，增加疾病誘導的失代償和肌膜去穩(wěn)定化，而整合素在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中可參與上皮間質轉化、血管生成以及細胞增殖和遷移等［10］。在骨肉瘤組織中TSP3高表達，其高表達能夠促進腫瘤血管生成，并且與患者預后不良有關［11］。在慢性粒細胞白血病相關細胞系中發(fā)現(xiàn)，TSP3 表達上調(diào)，且其表達上調(diào)與腫瘤惡性程度增加有關；但在肺癌細胞中，TSP3 則被認為是細胞侵襲的一種負調(diào)控因子［12-13］。TSP5 能夠編碼軟骨低聚基質蛋白，這是一種非膠原細胞外基質蛋白，該蛋白缺乏可導致骨骼發(fā)育缺陷。有研究報道，TSP5 可與轉化生長因子β1（TGF-β1）結合，且與TSP5 結合的TGF-β1生物活性明顯增強［14］。有研究證實，腫瘤相關成纖維細胞來源的TSP5旁分泌可促進肝癌細胞上皮間質轉化［15］；TSP5 能夠通過促進Notch3及其配體Jagged1的相互作用，導致乳腺癌腫瘤干細胞增殖［16］；在結腸癌中，TSP5 可通過激活PI3K-AKT-mTOR-p70S6K 信號通路，使腫瘤細胞增殖能力增強［17］。這些研究結果為進一步探究TSP3、TSP5在胃癌中的作用提供了新的方向。

本研究成功建立了基于TSP家族的胃癌預后評估模型RS1，并基于RS1 和臨床病理特征建立了胃癌預后評估模型RS2，并構建了傳統(tǒng)基于臨床病理特征的胃癌預后評估模型RS3，結果發(fā)現(xiàn)，與RS1、RS3比較，RS2預測胃癌患者預后的效能更高。

綜上所述，本研究成功構建了基于TSP家族的胃癌預后評估模型，為胃癌預后預測提供了科學依據(jù)。但本研究納入的TSP3、TSP5在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的具體分子機制尚不明確，仍需進一步探索。