劉瑞雪，李迎博，陳紀(jì)超

鄭州輕工業(yè)大學(xué) 材料與化學(xué)工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

0 引言

羧甲基殼聚糖(CMCS)是殼聚糖經(jīng)羧基化后形成的一種多糖[1-2]，側(cè)鏈上易電離的羧基增大了其在水中的溶解能力，且在溶解過(guò)程中不受pH值的限制.這既保留了CMCS自身良好的生物相容性，也增加了其溶解性，在高pH值條件下自身不會(huì)發(fā)生凝膠化反應(yīng)，因此被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、生物技術(shù)等領(lǐng)域[3-4].

天然高分子魔芋葡甘聚糖[5]、明膠[6]、殼聚糖(如CMCS)等常被用作基礎(chǔ)原料合成水凝膠.傳統(tǒng)的CMCS水凝膠通常采用戊二醛進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)制得[7-8]，如E.Y.Yan等[9]以戊二醛為交聯(lián)劑，制備了一種具有有效孔洞結(jié)構(gòu)的CMCS水凝膠.但由于戊二醛具有一定的毒性，且該類水凝膠強(qiáng)度較小，這在一定程度上限制了CMCS水凝膠的應(yīng)用.采用生物毒性較小的交聯(lián)劑制備水凝膠成為近年來(lái)的研究趨勢(shì).朱壽進(jìn)等[10]采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)交聯(lián)體系，制備了一種羧甲基殼聚糖自交聯(lián)水凝膠;劉水蓮等[11]通過(guò)調(diào)節(jié) EDC/NHS用量,制備了不同交聯(lián)度的CMCS水凝膠.上述文獻(xiàn)都僅研究了該類水凝膠的溶脹、生物降解、藥物緩釋等性能，而未對(duì)其力學(xué)性能、導(dǎo)電性能等進(jìn)行分析研究.

聚甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸/二氧化硅(Poly(MMA/MAA)/SiO2,PMMS)乳膠粒，是一種表面負(fù)載納米SiO2的堿溶脹型陰離子乳膠粒子微球.該乳膠?？梢栽趬A性條件下發(fā)生體積溶脹，在pH值大于pKa(乳膠粒中含有羧基基團(tuán)，其電離平衡常數(shù)pKa為7.5[12])的條件下會(huì)發(fā)生溶脹，形成物理凝膠.在更高的pH值條件下，PMMS乳膠粒的高分子鏈會(huì)解纏結(jié)，形成舒展的聚合物鏈[12-14]，具有一定的pH調(diào)節(jié)性.基于此，本文擬以PMMS、CMCS、丙烯酰胺(AAm)為原料， EDC/NHS為催化劑，采用pH調(diào)節(jié)，通過(guò)自由基聚合反應(yīng)制備CMCS-PMMS/PAAm復(fù)合水凝膠，并研究其流變性能、力學(xué)性能、溶脹性能、電導(dǎo)性能及生物相容性，以期為該類復(fù)合水凝膠在組織工程、傷口敷料、柔性電極等生物醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑：CMCS、AAm，上海麥克林公司生化科技有限公司產(chǎn)；MMA、MAA、NHS、EDC、過(guò)硫酸銨(APS)、N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺(MBA)，阿拉丁試劑上海股份有限公司產(chǎn)；NaOH， 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司產(chǎn).以上試劑均為分析純.SiO2溶膠(Bindzil CC301)，阿克蘇諾貝爾公司產(chǎn)；PMMS乳膠粒,鄭州輕工業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制；抗凝兔血，廣州鴻泉生物科技有限公司產(chǎn).

主要儀器：DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)；RTS-9型雙電測(cè)四探針測(cè)試儀、AK-1140 型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)；DZF-6030型真空干燥箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司產(chǎn)； HAKE MARSIII型哈克流變儀，美國(guó)Themo Fisher公司產(chǎn)；HY型微機(jī)控制萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)，深圳三思縱橫科技股份有限公司產(chǎn)；JSM-7001E型掃描電子顯微鏡，日本JEOL公司產(chǎn)；DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)；EFZ UV-4802H型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼科(上海)儀器有限公司產(chǎn).

1.2 PMMS乳膠粒的制備

參照課題組前期的合成方法[15-16]，以SiO2溶膠為穩(wěn)定劑、MMA和MAA為共聚單體，通過(guò)Pickering乳液聚合的方法制備得到PMMS乳膠粒.

1.3 CMCS-PMMS/PAAm復(fù)合水凝膠的制備

稱取一定量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為23%的PMMS乳膠粒，加水稀釋，攪拌均勻，使用注射器滴加微量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為32%的NaOH溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH值；然后，加入一定量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的CMCS溶液，再加入少量的EDC和NHS，攪拌30 min；最后依次加入一定量的AAm、MBA、APS，攪拌均勻，60 ℃下反應(yīng)5 h，即可制得pH 值分別為6、7、9、10的CMCS-PMMS/PAAm復(fù)合水凝膠.

1.4 表征和測(cè)試方法

內(nèi)部結(jié)構(gòu)表征：將復(fù)合水凝膠快速冷凍后，置于加熱型冷凍干燥機(jī)中真空干燥至恒重，切片，噴金，使用掃描電子顯微鏡，在25 kV的加速電壓下觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu).

流變性能測(cè)試：測(cè)試儀器為哈克流變儀；樣品規(guī)格為圓片狀，直徑為20 mm，高為4 mm；測(cè)試溫度為25 ℃；應(yīng)變掃描范圍為0.1%～1000%，固定頻率為1 Hz.

力學(xué)性能測(cè)試：測(cè)試儀器為萬(wàn)能材料試驗(yàn)機(jī)；壓縮性能樣品規(guī)格為圓柱狀，直徑為 20 mm，高度為15 mm，壓縮速度保持為5 mm/min，測(cè)試溫度為室溫；拉伸性能測(cè)試樣品為啞鈴型，長(zhǎng)度為60 mm，寬度為5 mm，厚度為3 mm，拉伸速率為20 mm/min，測(cè)試溫度為室溫.

溶脹性能測(cè)試：采用質(zhì)量分析法，將復(fù)合水凝膠樣品自然風(fēng)干后，稱質(zhì)量，記為W0；將復(fù)合水凝膠浸泡在去離子水溶液中，按照一定時(shí)間間隔稱取水凝膠質(zhì)量，記為Wd，直至溶脹平衡，溶脹率SR計(jì)算公式為

SR=(Wd-W0)/W0×100%

電導(dǎo)率測(cè)試：測(cè)試儀器為雙電測(cè)四探針測(cè)試儀；樣品規(guī)格為圓片，直徑為20 mm，高度為3 mm；每個(gè)樣品均重復(fù)3次，取平均值.

溶血性能測(cè)試：參考文獻(xiàn)[17]，將一定量離心所得新鮮抗凝兔血紅細(xì)胞加入37 ℃生理鹽水中，再加入一定量所制備的復(fù)合水凝膠，恒溫振蕩60 min，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其545 nm處的吸光度(OD).記ODa、ODb和ODc分別為實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照(沒(méi)有浸泡復(fù)合水凝膠的去離子水兔血紅細(xì)胞溶液)和陰性對(duì)照(沒(méi)有浸泡復(fù)合水凝膠的生理鹽水兔血紅細(xì)胞溶液)的吸光度，溶血率HR計(jì)算公式為

細(xì)胞活性測(cè)試：委托公司為武漢賽維爾生物科技有限公司；采用甲基噻唑基四唑(MTT)法[18]，細(xì)胞活性CV計(jì)算公式為

其中，OD1為實(shí)驗(yàn)組的吸光度,OD2為對(duì)照組的吸光度.

2 結(jié)果與分析

2.1 CMCS-PMMS/PAAm復(fù)合水凝膠的制備機(jī)理分析

在低pH值(酸性)條件下，PMMS微球內(nèi)部的羧基(—COOH)沒(méi)有發(fā)生去質(zhì)子化，微球仍以疏水性為主；隨著pH值的升高(中性和弱堿性)，PMMS內(nèi)部大量的—COOH發(fā)生去質(zhì)子化，電離產(chǎn)生—COO-基團(tuán)，微球從疏水性變?yōu)橛H水性，發(fā)生吸水溶脹，內(nèi)部相互擠壓形成物理凝膠[19]；在更高的pH值(高堿性)條件下，PMMS乳膠粒的高分子鏈在—COO-的相互排斥作用下解纏結(jié)，形成帶有—COO-基團(tuán)的高分子鏈.利用PMMS具有經(jīng)pH 誘導(dǎo)可從微粒到線狀離子鏈的結(jié)構(gòu)變化的性質(zhì)，通過(guò)簡(jiǎn)單滴加NaOH溶液改變凝膠體系的pH值，制備出具有不同性能的CMCS-PMMS /PAAm復(fù)合水凝膠.PMMS乳膠粒的pH響應(yīng)機(jī)理示意圖見(jiàn)圖1.

圖1 PMMS乳膠粒的pH響應(yīng)機(jī)理示意圖Fig.1 The schematic diagram of pH responsiveness of PMMS emulsoid particles

2.2 CMCS-PMMS/PAAm復(fù)合水凝膠的結(jié)構(gòu)分析

圖2為不同pH值條件下制備的CMCS-PMMS/PAAm復(fù)合水凝膠的SEM圖與實(shí)例圖.由圖2a)可以看出，在pH值為6和7的條件下所制備的復(fù)合水凝膠孔洞結(jié)構(gòu)內(nèi)部仍有小孔存在，整個(gè)結(jié)構(gòu)呈大孔套小孔的現(xiàn)象.隨著pH值的不斷增大，這一結(jié)構(gòu)逐漸消失，形成骨架厚實(shí)的單一孔洞結(jié)構(gòu).這可能是因?yàn)樵谳^低pH值條件下，PMMS仍為納米級(jí)別的微球結(jié)構(gòu)[5]，此時(shí)在網(wǎng)絡(luò)中雖有交聯(lián)，但由于微球結(jié)構(gòu)的存在，CMCS-PMMS網(wǎng)絡(luò)并不密集，主要以小片網(wǎng)絡(luò)的形式穿插在PAAm網(wǎng)絡(luò)中.而當(dāng)pH值為9時(shí)，PMMS開(kāi)始出現(xiàn)解纏結(jié)現(xiàn)象，成為聚合物長(zhǎng)鏈，在EDC/NHS的作用下，與CMCS的交聯(lián)更緊密，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)也更為規(guī)整，復(fù)合水凝膠孔洞的骨架也因此變得更加厚實(shí).由圖2b)可以看出，復(fù)合水凝膠的透明度隨著pH值的增大而變大，這也從側(cè)面驗(yàn)證了pH值對(duì)復(fù)合水凝膠結(jié)構(gòu)的影響，以及PMMS在凝膠體系中發(fā)生了從微球到聚合物鏈的轉(zhuǎn)變.

圖2 不同pH值條件下制備的CMCS-PMMS/PAAm復(fù)合水凝膠的SEM圖與實(shí)例圖Fig.2 SEM images and example diagrams of CMCS-PMMS/PAAm composite hydrogel prepared at different pH values

2.3 CMCS-PMMS/PAAm復(fù)合水凝膠流變性能分析

圖3為不同pH值對(duì)CMCS-PMMS/PAAm復(fù)合水凝膠流變性能的影響.由圖3a)可以看出，儲(chǔ)能模量G′整體呈先減小后增大的趨勢(shì)，當(dāng)pH值為6時(shí)，G′最大，為9200 Pa.這可能是由于CMCS-PMMS在EDC/NHS的作用下發(fā)生了交聯(lián)反應(yīng)，雖然PMMS發(fā)生了溶脹，但是微球之間沒(méi)有相互擠壓，仍留有空隙可以與CMCS進(jìn)行交聯(lián).但當(dāng)pH值與pKa(pKa=7.5[12])值相等時(shí)，PMMS發(fā)生充分的溶脹擠壓，使其與CMCS的交聯(lián)點(diǎn)減少，凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)不連續(xù)，多為游離的CMCS高分子鏈，G′出現(xiàn)下降趨勢(shì).隨著pH值繼續(xù)增大，PMMS溶脹逐漸解開(kāi)，體系中開(kāi)始出現(xiàn)共聚物的高分子鏈，在EDC/NHS的作用下，高分子鏈部分與CMCS形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，G′有所升高.另外，由圖3b)可以看出，在不同pH值條件下，復(fù)合水凝膠的損耗因子tanδ在臨界應(yīng)變前均小于0.1，這進(jìn)一步表明復(fù)合水凝膠內(nèi)部形成了有效的交聯(lián)[20].

圖3 不同pH值對(duì)CMCS-PMMS/PAAm復(fù)合水凝膠流變性能的影響Fig.3 The effect of pH value on rheological properties of CMCS-PMMS/PAAm composite hydrogels

2.4 CMCS-PMMS/PAAm復(fù)合水凝膠力學(xué)性能分析

圖4為不同pH值對(duì)CMCS-PMMS/PAAm復(fù)合水凝膠力學(xué)性能的影響.由圖4a)可以看出，當(dāng)pH值為6和7時(shí)，復(fù)合水凝膠的抗壓縮強(qiáng)度較大，但易發(fā)生屈服破裂；而當(dāng)pH值為9和10時(shí)，復(fù)合水凝膠可以承受壓縮應(yīng)變至83%的變化而未出現(xiàn)屈服破裂的現(xiàn)象(此時(shí)的壓縮變量為現(xiàn)用儀器的最大壓縮量程).由圖4b)可以看出，當(dāng)pH值從6增至7時(shí)，復(fù)合水凝膠的斷裂伸長(zhǎng)率和最大拉伸強(qiáng)度都得到明顯提升，這與壓縮性能結(jié)果基本一致；當(dāng)pH值繼續(xù)增至9或10時(shí)，其拉伸強(qiáng)度有所降低，但斷裂伸長(zhǎng)率增至178%左右，這說(shuō)明復(fù)合水凝膠的韌性隨pH值的增大變得更好.這可能是因?yàn)楫?dāng)體系pH值為6和7時(shí)，復(fù)合水凝膠中PMMS部分仍為溶脹的微球，微球體積的增大造成微球之間相互擠壓，提升了PMMS之間的物理交聯(lián)點(diǎn)密度，雖然仍有游離的CMCS分子鏈存在，但是PMMS微球溶脹后的抗壓縮強(qiáng)度在體系中起主導(dǎo)作用，因此復(fù)合水凝膠呈現(xiàn)剛而強(qiáng)的狀態(tài).這與先前研究報(bào)道[16]中，PMMS物理凝膠在pH值為6～7時(shí)機(jī)械強(qiáng)度最大的結(jié)果一致.隨著pH值的繼續(xù)增大，PMMS部分或全部解纏結(jié)變?yōu)槭嬲沟母叻肿渔湥梢栽谀z體系中起到潤(rùn)滑的作用，從而增加復(fù)合水凝膠的柔韌性.

圖4 不同pH值對(duì)CMCS-PMMS/PAAm復(fù)合水凝膠力學(xué)性能的影響Fig.4 The effect of pH value on the mechanical properties of CMCS-PMMS/PAAm composite hydrogels

基于力學(xué)性能結(jié)果，選取pH=10條件下制備的CMCS-PMMS/PAAm復(fù)合水凝膠樣品為模型，通過(guò)不間斷的循環(huán)壓縮評(píng)價(jià)抗疲勞性和形變恢復(fù)能力.圖5為CMCS-PMMS/PAAm復(fù)合水凝膠(pH=10)的循環(huán)壓縮曲線與耗散能變化趨勢(shì).由圖5可以看出，復(fù)合水凝膠經(jīng)歷8次循環(huán)壓縮至形變的80%后，除第1次循環(huán)外，其他循環(huán)壓縮曲線圖基本重合，滯后環(huán)基本一致，且在裝卸循環(huán)過(guò)程中存在明顯的滯后現(xiàn)象，這表明復(fù)合水凝膠可以有效耗散能量.盡管第1次循環(huán)壓縮耗散能較大，為1037 kJ/m3，但隨后第2次至第6次循環(huán)壓縮耗散能均值降低至860 kJ/m3，第7次和第8次循環(huán)壓縮的耗散能又有所升高，均值為900 kJ/m3.首次循環(huán)壓縮耗散能較大可能是復(fù)合水凝膠內(nèi)部有結(jié)構(gòu)缺陷的網(wǎng)絡(luò)發(fā)生了坍塌所致；在隨后的循環(huán)壓縮過(guò)程中，復(fù)合水凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)漸趨穩(wěn)定，從而耗散能變化減小，逐漸趨于平衡；而隨著循環(huán)壓縮次數(shù)的繼續(xù)增加，復(fù)合水凝膠內(nèi)部游離的具有較大塑性形變能力的PMMS分子恢復(fù)形變的能力較弱，使耗散能又有所升高.

圖5 CMCS-PMMS/PAAm復(fù)合水凝膠(pH=10)的循環(huán)壓縮曲線與耗散能變化趨勢(shì)Fig.5 Cyclic compression and dissipative energy change of CMCS-PMMS/PAAm composite hydrogels during cyclic comprising(pH=10)

2.5 CMCS-PMMS/PAAm復(fù)合水凝膠導(dǎo)電性能分析

圖6為不同pH值對(duì)CMCS-PMMS/PAAm復(fù)合水凝膠導(dǎo)電性能的影響.從圖6a)可以看出，復(fù)合水凝膠的電導(dǎo)率隨體系pH值的增大略有升高，最高可達(dá)2.98×10-4S/cm.這可能是因?yàn)閺?fù)合水凝膠中羧基的電離程度隨體系pH值的升高也有所提升，即羧酸根濃度升高，復(fù)合水凝膠內(nèi)部形成較好的離子導(dǎo)電通路，進(jìn)而使其電導(dǎo)率增加.由圖6b)可以看出，將pH=10條件下制備的復(fù)合水凝膠作為導(dǎo)體連接在一個(gè)電壓為3 V的閉合電路中，電路中的二極管可以發(fā)光，這進(jìn)一步表明該復(fù)合水凝膠具有良好的導(dǎo)電性.

圖6 不同pH值對(duì)CMCS-PMMS/PAAm復(fù)合水凝膠導(dǎo)電性能的影響Fig.6 The effect of pH value on the conductivity of composite CMCS-PMMS/PAAm hydrogel

2.6 CMCS-PMMS/PAAm復(fù)合水凝膠溶脹性能分析

溶脹能力是指水凝膠吸收純水、鹽溶液或生理鹽水的能力[21].圖7為CMCS-PMMS/PAAm復(fù)合水凝膠的溶脹性能曲線與溶脹前后抗壓縮能力對(duì)比圖.由圖7a)可以看出，pH值分別為6，7，9條件下制備的復(fù)合水凝膠在水中的的平衡溶脹率(約為600%)及達(dá)到溶脹平衡所需的時(shí)間相差不大.但pH值為10時(shí)所制備的復(fù)合水凝膠的平衡溶脹率卻高達(dá)860%.這可能是因?yàn)樵趬A性條件下復(fù)合水凝膠中未發(fā)生交聯(lián)的帶電離子基團(tuán)(COO-)增加，盡管體系中氨基處于疏水狀態(tài)，但由于電荷排斥和滲透作用，復(fù)合水凝膠的平衡溶脹率也會(huì)隨之增大.

對(duì)于大多數(shù)吸水溶脹型的水凝膠，在達(dá)到平衡溶脹后，都會(huì)變脆，并失去彈性形變能力.但筆者發(fā)現(xiàn)，CMCS-PMMS/PAAm復(fù)合水凝膠即使在吸水達(dá)到溶脹平衡后，目測(cè)未見(jiàn)破損的痕跡，仍具有良好的壓縮形變性能.由圖7b)可以看出，復(fù)合水凝膠吸水后明顯變大，用手盡力壓縮溶脹后的凝膠，表面未見(jiàn)任何破裂之處，去除指壓，復(fù)合水凝膠瞬即恢復(fù)至原來(lái)的形態(tài).由此可知， CMCS-PMMS/PAAm復(fù)合水凝膠具有應(yīng)用于水環(huán)境的潛能.

圖7 CMCS-PMMS/PAAm復(fù)合水凝膠的溶脹性能曲線與溶脹前后抗壓縮能力對(duì)比圖Fig.7 Property curves of CMCS-PMMS/PAAm composite hydrogels and comparison of anti-compression capacity before and after swelling

2.7 CMCS-PMMS/PAAm復(fù)合水凝膠生物相容性分析

在生物醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用中，考慮到合成高分子材料PAAm及小分子交聯(lián)劑MBA與生物系統(tǒng)之間的相互作用[22]，對(duì)不同pH值條件下制備的CMCS-PMMS/PAAm復(fù)合水凝膠進(jìn)行了溶血性能測(cè)試和細(xì)胞相容性研究，結(jié)果見(jiàn)圖8.由圖8可以看出，所有復(fù)合水凝膠樣品的溶血率均小于5%，細(xì)胞活性均在75%以上.溶血性能測(cè)試往往被認(rèn)為是評(píng)估材料血液相容性簡(jiǎn)單、可靠的方法.一般來(lái)說(shuō)，溶血率應(yīng)低于5%，且越低說(shuō)明材料與血液的相容性越好[17].另外，根據(jù)文獻(xiàn)[22]，當(dāng)某種材料表面細(xì)胞活性大于75%時(shí)，可認(rèn)為該材料具有良好的生物相容性.由以上結(jié)果可知，CMCS-PMMS/PAAm復(fù)合水凝膠具有良好的血液相容性和細(xì)胞相容性，有望作為生物材料應(yīng)用于生物傳感件、電子皮膚等領(lǐng)域.

圖8 不同pH值對(duì)CMCS-PMMS/PAAm復(fù)合水凝膠生物相容性的影響Fig.8 The effect of pH value on the biocompatibility of CMCS-PMMS/PAAm composite hydrogel

3 結(jié)論

本文通過(guò)調(diào)節(jié)體系pH值和自由基聚合反應(yīng)制備了一系列CMCS-PMMS/PAAm復(fù)合水凝膠，并考查了其流變性能、力學(xué)性能、導(dǎo)電性能、溶脹性能及生物相容性，得出如下結(jié)論：該復(fù)合水凝膠具有良好的流變性能、壓縮性能和穩(wěn)定的拉伸應(yīng)變能力，即使經(jīng)吸水溶脹后，仍具有良好的抗壓縮性；具有良好的導(dǎo)電性和生物相容性，pH=10時(shí)電導(dǎo)率最高，可達(dá)2.98×10-4S/cm，所有復(fù)合水凝膠樣品的溶血率均低于5%，細(xì)胞相對(duì)增殖率大于75%，均達(dá)到了國(guó)內(nèi)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)生物材料的要求[23].本文研究結(jié)果為CMCS-PMMS/PAAm復(fù)合水凝膠在溶液環(huán)境下的應(yīng)用提供了可能，也使該類復(fù)合水凝膠有望應(yīng)用于軟骨修復(fù)、傷口敷料、生物傳感器件、電子皮膚等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域.