趙艷丹，趙艷潔，李小陽，宋麗華

（1.錦州紫金藥業(yè)有限公司，遼寧 錦州121001；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九六八醫(yī)院，遼寧 錦州121001）

柴胡（Bupleurum chinense）為傘形科植物柴胡或狹葉柴胡的干燥根。柴胡始記于《神農(nóng)本草經(jīng)》，《傷寒論》為最早運用柴胡的醫(yī)學類著作。柴胡具有解熱、保肝、抗菌、抗腫瘤等作用［1，2］?！吨腥A人民共和國藥典》以柴胡皂苷a和柴胡皂苷d為指標控制成分，柴胡皂苷a和柴胡皂苷d是抗炎、抗病毒主要活性成分［3，4］。

響應面法是通過試驗數(shù)據(jù)建立數(shù)學模型，篩選最優(yōu)條件的統(tǒng)計分析方法。傳統(tǒng)的單因素分析不考慮各因素之間的影響，響應面法可以評估各影響因素的相互作用，建立連續(xù)表面模型，預測結(jié)果與試驗結(jié)果接近，在研究中得到廣泛的應用［5，6］。響應面法優(yōu)化提取工藝，可以評價各因素與響應值間的關系，使準確度提高，指導性強［7］。

目前，提取柴胡皂苷的方法主要有乙醇提?。?］，其提取效率高，但也存在溶劑殘留問題。中藥防病治病是中華民族幾千年來寶貴的傳承，多采用水煎法進行服用。本研究以中醫(yī)理論為指導，采用傳統(tǒng)水提工藝提取柴胡皂苷，以響應面法研究優(yōu)化提取的因素，以便更好地發(fā)揮藥效。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

樣品和試劑：柴胡藥材，來自山西省長治市，符合《中華人民共和國藥典》的標準。柴胡皂苷a對照品（批號110777-200507，純度為93.2%）、柴胡皂苷d對照品（批號110778-200505，純度為97.3%）均購自中國食品藥品檢定研究所。乙腈、甲醇為色譜純，氨水、正丁醇為分析純。

L-2130型高效液相色譜儀、L-2455DAD型檢測器（日本日立公司）。

1.2 方法

1.2.1 柴胡皂苷標準曲線的繪制精密稱取柴胡皂苷a對照品與柴胡皂苷d對照品，加甲醇制成含柴胡皂苷a 1.93 mg/mL、柴胡皂苷d 2.43 mg/mL的溶液。再分別稀釋得到含0.077、0.193、0.386、0.772、1.930 mg/mL柴 胡 皂 苷a，含0.097、0.243、0.486、0.972、2.430 mg/mL柴胡皂苷d的混合標準品溶液，以對照品的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.2 供試品溶液的制備取柴胡粉末10 g，加水80 mL，減壓加熱提取2次，每次1 h，過濾，合并濾液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，放冷。在-80℃冷凍干燥，制得柴胡皂苷提取物。取上述柴胡皂苷提取物，加水20 mL溶解，用飽和正丁醇60 mL萃取3次，再用5%氨水50 mL洗2次，分取飽和正丁醇并蒸干［9］，用甲醇10 mL溶解殘渣，過濾，得到柴胡皂苷供試品。

色譜條件：Hypersil BDS C18色譜柱（250 mm×46 mm，5μm）；以乙腈為流動相A，水為流動相B，進行梯度洗脫，洗脫程序為0～50 min（25%～90%A），50～55 min（90%A），55～60 min（90%～25%A）；流速為1.0 mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為210 nm［10］。

1.2.3 柴胡皂苷類成分的單因素試驗以柴胡皂苷類成分提取含量為指標，考察提取次數(shù)對柴胡皂苷類成分提取含量的影響，進行單因素分析，每組試驗重復3次，取其平均值。

準確稱取10 g柴胡粉末，放入燒瓶中，在提取溫度80℃、液料比8∶1（mL∶g，下同），減壓加熱回流提取60 min的條件下，考察提取次數(shù)（1、2、3、4、5次）對柴胡皂苷類成分提取含量的影響。

1.2.4 響應面法優(yōu)化柴胡提取工藝在單因素試驗的基礎上，應用Design-Expert 8.05軟件，采用CCD（Central composite design）設計試驗［11，12］。選擇主要的3個影響因素：提取時間（A）、提取溫度（B）、液料比（C）為自變量，柴胡皂苷類成分提取含量為因變量，每個因素設計5個水平，分別用-α、-1、0、1、α（α=1.682）表示，因素水平設計見表1。

表1 CCD設計影響因素和水平

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗重復3次，采用Origin 75軟件作圖，采用Design Expert 8.05軟件進行CCD響應面試驗設計及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 柴胡皂苷標準曲線

柴胡皂苷a濃度與峰面積擬合的回歸方程為Y=7 963.4X+59 797，R2=0.999 8；柴胡皂苷d濃度與峰面積擬合的回歸方程為Y=8 137.1X-150.59，R2=0.999 7。柴胡皂苷a的質(zhì)量濃度在0.077～1.930 mg/mL，柴胡皂苷d的質(zhì)量濃度在0.097～2.43 mg/mL范圍有良好的線性關系。

2.2 單因素試驗結(jié)果

由圖1可知，提取2次比提取1次柴胡皂苷類成分提取含量增加明顯，提取第3、4、5次后柴胡皂苷類成分提取含量變化不大，從節(jié)約能源和縮短試驗周期角度考慮，最終確定提取次數(shù)為2次。提取次數(shù)為非連續(xù)變量，未將提取次數(shù)作為后續(xù)優(yōu)化因素。

圖1 提取次數(shù)對柴胡皂苷類成分提取含量的影響

2.3 星點設計-響應面法優(yōu)化提取工藝

2.3.1 模型擬合將數(shù)據(jù)用Design Expert 8.05軟件進行響應面法分析，以柴胡皂苷類成分提取含量為響應值，分別對各影響因素進行多元線性回歸和二項式方程擬合，試驗結(jié)果見表2。對其數(shù)據(jù)進行分析后發(fā)現(xiàn)，用二階多項式回歸較優(yōu)，得到柴胡皂苷類成分提取含量（Y）為響應值，3個參數(shù)（A、B、C）為自變量的二次回歸方程模型為Y=-2.361+0.020A+0.057B+0.316C-1.25×105AB+6.25×105AC-6.25×105BC-1.569×104A2-3.511×104B2-0.019C2（r2=0.970 6，P＜0.01）。

表2 CCD試驗設計方案及結(jié)果

2.3.2 方差分析和顯著性檢驗采用Design Expert 8.05軟件對表2的試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果如表3所示。

圖2 提取時間與提取溫度對柴胡皂苷類成分提取含量影響的響應曲面和等高線

表3 的回歸方差分析結(jié)果表明，響應面的回歸模型F=36.72，P＜0.000 1，說明該模型極顯著。模型的失擬項F=4.13，P=0.073＞0.05，對柴胡皂苷類成分提取含量影響不顯著，說明該模型回歸方程不失擬，試驗誤差小，能充分反映實際情況，可用作模型分析。從表3還可以看出，因素一次項A和二次項A2、B2、C2對試驗結(jié)果的影響顯著（P＜0.05），交互項AB、AC、BC對試驗結(jié)果的影響不顯著（P＞0.05）。各因素對柴胡皂苷類成分提取含量影響程度依次為提取時間＞液料比＞提取溫度。

表3 CCD方差分析結(jié)果

2.2.3 響應面分析與優(yōu)化根據(jù)回歸方程繪制響應曲面和等高線，分析提取時間、提取溫度、液料比等因素及其交互作用對柴胡皂苷類成分提取含量的影響，結(jié)果分別見圖2、圖3、圖4。

圖3 提取時間與液料比對柴胡皂苷類成分提取含量影響的響應曲面和等高線

圖4 提取溫度與液料比對柴胡皂苷類成分提取含量影響的響應曲面和等高線

通過響應面坡度的陡峭程度、等高線橢圓形狀可以反映出2個因素交互作用的強度。坡度平緩說明因素間交互作用弱。當條件改變時，對響應值影響不大。相反，坡面陡峭說明因素間交互作用強，當條件改變時，響應值變化大。等高線為橢圓形表示交互作用顯著，接近圓形表示交互作用不顯著。因此，由圖2、圖3和圖4可知，提取時間和溫度、提取溫度和液料比、提取時間和液料比的交互作用都不顯著，與上述方差分析和顯著性分析相符。

2.3.4 驗證試驗對優(yōu)化后的回歸方程進行分析，在各試驗因素水平范圍內(nèi)水提取柴胡皂苷類成分的最佳參數(shù)為提取時間63.33 min、提取溫度78.99℃、液料比8.12∶1.00，在此最佳工藝條件下柴胡皂苷類成分的最大提取含量為1.81 mg/g。

為了驗證回歸模型的有效性，考慮試驗的可行性、便捷性和可操作性，對預測的工藝參數(shù)進行微調(diào)，選擇提取時間60 min、提取溫度80℃、液料比8∶1，提取2次的條件下進行驗證試驗，柴胡皂苷類成分提取含量分別為1.80、1.79、1.82 mg/g，實際平均提取含量為1.80 mg/g，與預測值1.81 mg/g偏差較小。結(jié)果表明該模型合理，有效地對水提取柴胡工藝進行了優(yōu)化。

3 小結(jié)與討論

肖功勝等［13］采用單因素試驗篩選主因素和水平，以正交試驗篩選柴胡有效成分提取最佳工藝。Zhao等［14］研究了超聲波輔助提取柴胡中柴胡皂苷的方法，考察了時間、溫度、超聲功率、粒徑、溶劑固體比和溶劑濃度等因素對目標組分收率的影響，結(jié)果表明，超聲波輔助提取的提取速度比傳統(tǒng)的熱提取快6倍。衛(wèi)昊等［15］研究采用HPLC法測定秦嶺柴胡及其不同溶劑提取部位中柴胡皂苷a和b的方法，結(jié)果表明，柴胡皂苷a在2.160～28.875μg/mL內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)為0.999 9，平均回收率為98.31%，RSD為1.04%；柴胡皂苷b在0.144～1.800 μg/mL內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)為0.999 9，平均回收率為97.00%，RSD為1.12%。本研究以中醫(yī)理論為指導，以柴胡皂苷類成分提取含量為衡量指標，對提取次數(shù)進行了單因素考察，確定了提取次數(shù)為2次，同時明確了各影響因素的試驗范圍。采用傳統(tǒng)水提工藝，以響應面法研究優(yōu)化提取的因素，以便更好地發(fā)揮藥效。

采用CCD響應面分析法進行柴胡皂苷提取工藝的優(yōu)化，對試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，P＜0.000 1，表明模型具有顯著性。得到最佳工藝條件，提取時間60 min、提取溫度80℃、液料比8∶1，提取2次。在此優(yōu)化條件下柴胡皂苷類成分的實際提取含量為1.80 mg/g，與理論預測值1.81 mg/g較為接近。驗證試驗表明，試驗建立的模型有較好的預測性，采用CCD試驗設計-響應面法優(yōu)化柴胡皂苷類成分的提取工藝可行。整個工藝流程操作方便，研究結(jié)果為柴胡皂苷類成分的進一步應用提供參考。