徐小萬(wàn)，夏碧波，吳智明，田永紅

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510640；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院園藝園林學(xué)院，廣州510225）

作物育種能否取得突破性的成就取決于關(guān)鍵性種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)利用，種質(zhì)資源成為作物雜交育種成功的重要因素［1］。依據(jù)外觀(guān)形態(tài)鑒別辣椒（Capsi?cumspp.）種質(zhì)資源的親緣關(guān)系已有大量例子，隨著生物技術(shù)的發(fā)展利用分子標(biāo)記技術(shù)，如RFLP［2］、RAPD［3，4］、ISSR［5，6］、AFLP［7］、SSR和SRAP［8］，研究者利用這些分子標(biāo)記技術(shù)開(kāi)展了辣椒種質(zhì)資源親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析，均取得了較好成績(jī)。DNA甲基化在基因表達(dá)調(diào)控和基因組防御2個(gè)方面發(fā)揮了重要作用［9］，是現(xiàn)代表觀(guān)遺傳學(xué)研究中的熱點(diǎn)和主要內(nèi)容。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展DNA甲基化的檢測(cè)方法越來(lái)越多，較簡(jiǎn)單的方法是甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（Methylation-sensitive amplified poly?morphism，MSAP），而MSAP是基于AFLP基礎(chǔ)上建立起來(lái)的技術(shù)，在水稻［10］、蔬菜［11，12］、毛竹［13］等植物DNA甲基化模式或程度上已被廣泛使用。本研究利用MSAP技術(shù)以國(guó)外引進(jìn)的30份辣椒種質(zhì)資源作為研究對(duì)象進(jìn)行辣椒基因組CCGG甲基化位點(diǎn)多態(tài)性分析，以期為辣椒種質(zhì)的分類(lèi)鑒定以及種質(zhì)資源科學(xué)利用提供表觀(guān)遺傳基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

30份辣椒種質(zhì)資源由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所茄果類(lèi)研究室提供，均引自馬來(lái)西亞，其中8份資源田間表現(xiàn)抗疫病和青枯病，編號(hào)分別為156、159、162、163、168、181、182和198。

1.2 葉片DNA的提取

在辣椒苗期于第七片或第八片真葉時(shí)采集新鮮葉片，用于辣椒基因組DNA提取，提取方法參照CTAB法［1］。

1.3 MSAP反應(yīng)體系

限制性酶切及連接反應(yīng)，用EcoRⅠ/HpaⅡ組合和EcoRⅠ/MspⅠ組合分別酶切同一辣椒基因組DNA，酶切連接一步反應(yīng)，混勻后離心數(shù)秒，37℃保溫5 h，8℃保溫4 h，4℃過(guò)夜。反應(yīng)體系：在20μL反應(yīng)體系中，加入4μL模板DNA（50 ng/μL），Adapter 1μL，10×Reaction buffer 2.5μL，2μLEcoRⅠ，2μLMspⅠ或2μLHpaⅡ，10 mmol/L ATP 2.5μL，T4連接酶1μL，最后用ddH2O補(bǔ)足體系。預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增具體參照李濤等［1］的方法。MSAP所用的接頭和擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表1。

表1 MSAP所用的接頭和擴(kuò)增引物序列

1.4 MSAP數(shù)據(jù)讀取及統(tǒng)計(jì)分析

MSAP數(shù)據(jù)讀?。?，14］，具體按以下方法執(zhí)行：①每個(gè)辣椒樣品占1個(gè)泳道，每個(gè)泳道加入的熒光分子量標(biāo)準(zhǔn)ROX-500，共25條帶；②選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物利用聚丙烯酰胺進(jìn)行凝膠電泳，而后用測(cè)序儀ABI377自動(dòng)保存膠圖；③利用GENESCAN軟件進(jìn)行分析，每2個(gè)堿基讀1次數(shù)，每個(gè)泳道共讀取216個(gè)數(shù)；④打開(kāi)保存好的膠圖，直接利用圖像信號(hào)生成分子量矩陣（Matrix），并采用BINTHERE軟件把生成的分子量矩陣轉(zhuǎn)為“0、1”二維矩陣，原則是根據(jù)記錄帶的有或無(wú)，有帶的記為“1”，而無(wú)帶的則記為“0”。根據(jù)“0、1”二維矩陣，對(duì)每個(gè)辣椒樣品統(tǒng)計(jì)4種帶型變化，Ⅰ型（1，1）HpaⅡ和MspⅠ都能切開(kāi)、Ⅱ型（1，0）、Ⅲ型（0，1）、Ⅳ型（0，0），依據(jù)帶型分析各種甲基化模式在30個(gè)國(guó)外引進(jìn)辣椒種質(zhì)材料中的變化［1，14］。

為了研究國(guó)外引進(jìn)30份辣椒種質(zhì)資源表觀(guān)遺傳多樣性，將上述二維矩陣數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為下列數(shù)據(jù)模式：第一套數(shù)據(jù)為甲基化不敏感多態(tài)矩陣（Methyla?tion-insensitive polymorphisms，MISP），將HpaⅡ和MspⅠ都能切開(kāi)的Ⅰ型（1，1）記為數(shù)字“1”，將Ⅱ型（1，0）、Ⅲ型（0，1）和Ⅳ型（0，0）都記為數(shù)字“0”；第二套數(shù)據(jù)為甲基化敏感多態(tài)矩陣（Methylation-sensi?tive polymorphisms，MSP），將Ⅱ型（1，0）和Ⅲ型（0，1）都記為數(shù)字“1”，Ⅰ型（1，1）和Ⅳ型（0，0）記為數(shù)字“0”，采用NTSYSpc-2.10e軟件進(jìn)行上述數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA甲基化模式分析

從63對(duì)引物組合中（表1）篩選出9對(duì)帶型清晰的MSAP引物，對(duì)國(guó)外引進(jìn)的30份辣椒種質(zhì)資源進(jìn)行擴(kuò)增和分析，圖1為引物對(duì)H1E2在30份辣椒種質(zhì)資源中的MSAP擴(kuò)增電泳圖譜。

由表2可知，國(guó)外引進(jìn)的30份辣椒種質(zhì)資源的甲基化模式分為以下3種類(lèi)型。Ⅰ型為內(nèi)側(cè)胞嘧啶半甲基化和5'-CCGG-3'胞嘧啶未甲基化，HpaⅡ和MspⅠ都能切開(kāi)（1，1）；Ⅱ型為5'-CCGG-3'胞嘧啶外側(cè)半甲基化，HpaⅡ能切開(kāi)，但MspⅠ切不開(kāi)（1，0）；Ⅲ型為5'-CCGG-3'內(nèi)側(cè)胞嘧啶全甲基化，HpaⅡ切不開(kāi)，但MspⅠ能切開(kāi)（0，1）。

圖1 引物對(duì)H1E2在30份辣椒種質(zhì)資源中的MSAP擴(kuò)增電泳圖譜

表2 國(guó)外引進(jìn)30份辣椒種質(zhì)資源MSAP分析的條帶類(lèi)型

由表2可知，30份辣椒種質(zhì)資源中，共統(tǒng)計(jì)到類(lèi)型Ⅰ（1，1）3 535條，30份辣椒材料類(lèi)型Ⅰ變化范圍為110（編號(hào)182材料）～197條（編號(hào)178材料），平均每份材料約145條；30份國(guó)外引進(jìn)辣椒種質(zhì)資源類(lèi)型Ⅱ（1，0）共統(tǒng)計(jì)到4 593條，平圴每份材料約188條，其中最少的條帶數(shù)是78條（編號(hào)184材料），最多條帶數(shù)為292條（編號(hào)167材料）；而類(lèi)型Ⅲ（0，1）在30份辣椒種質(zhì)資源共統(tǒng)計(jì)到6 718條，平均每份材料約224條，其變化范圍從124（編號(hào)160材料）～292（編號(hào)169材料）；30份國(guó)外引進(jìn)材料檢測(cè)到3種類(lèi)型條帶總數(shù)為16 704條，平均每份材料約557條，其變化范圍從370（編號(hào)160材料）～683（編號(hào)172材料）；甲基化條帶總數(shù)為12 367條，平均每份材料約412條，其變化范圍從215（編號(hào)184材料）～544（編號(hào)172材料）；30份材料的甲基化敏感多態(tài)性平均為73.34%，最低為55.70%（編號(hào)184材料），最高為82.69%（編號(hào)167）。

由表2可知，30份國(guó)外引進(jìn)的辣椒種質(zhì)資源中有27份種質(zhì)資源雙鏈內(nèi)甲基化率都大于單鏈外甲基化率，而編號(hào)為156、167和192的3份種質(zhì)資源的雙鏈內(nèi)甲基化率都小于單鏈外甲化率。

2.2 MSAP非加權(quán)分組平均法分析

基于Jaccard相似性矩陣，采用非加權(quán)分組平均法進(jìn)行聚類(lèi)。由圖2可知，MSP聚類(lèi)結(jié)果中，在相似性系數(shù)約為0.658處，30份國(guó)外引進(jìn)材料可分為6個(gè)類(lèi)群，第Ⅰ類(lèi)：編號(hào)156、158、160、163、178、184、

182、183、192、180、181、171、173、162、168、159、174、198、190、157、166、164、165、177和175共25個(gè)材料；第Ⅱ類(lèi)：只有編號(hào)199的材料；第Ⅲ類(lèi)：只有編號(hào)169的材料；第Ⅳ類(lèi)：只有編號(hào)191的材料；第Ⅴ類(lèi)：只有編號(hào)172的材料；第Ⅵ類(lèi)：只有編號(hào)167的材料。

圖2 采用UPGMA建立的30份辣椒種質(zhì)資源MSP聚類(lèi)分析結(jié)果

MISP聚類(lèi)分析結(jié)果（圖3）表明，在相似性系數(shù)約為0.868處，30份國(guó)外引進(jìn)辣椒材料可分為6個(gè)類(lèi)群，第Ⅰ類(lèi)：編號(hào)為156和157的2個(gè)材料；第Ⅱ類(lèi)：編號(hào)為158、159、162、163、168、180、181、182、183、192、167、173、190、174、198、199、164、165、169、166、171、172、175和177，共24個(gè)材料；第Ⅲ類(lèi)：只有編號(hào)184的材料；第Ⅳ類(lèi)：只有編號(hào)160的材料；第Ⅴ類(lèi)：只有編號(hào)191的材料；第Ⅵ類(lèi)：只有編號(hào)178的材料。

圖3 采用UPGMA建立的30份辣椒種質(zhì)資源MISP聚類(lèi)分析結(jié)果

2.3 MSAP主坐標(biāo)分析

主坐標(biāo)分析基本證實(shí)了聚類(lèi)分析的結(jié)果。在以相似性矩陣數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)的2個(gè)主坐標(biāo)分析過(guò)程中，在3個(gè)維度上均可以基本區(qū)分出絕大多數(shù)個(gè)體間的差異（圖4）。

圖4 國(guó)外引進(jìn)30份辣椒種質(zhì)資源MSP的三維主坐標(biāo)分析結(jié)果

在MSP的三維主坐標(biāo)分析（圖4）中，30份國(guó)外引進(jìn)辣椒材料可分為5個(gè)類(lèi)群，第Ⅰ類(lèi)：編號(hào)156、158、160、163、178、184、182、183、192、180、181、171、173、162、168、159、174、198、190、157、166、164、165、177、175和199共26個(gè)材料；第Ⅱ類(lèi)：只有編號(hào)167的材料；第Ⅲ類(lèi)：只有編號(hào)191的材料；第Ⅳ類(lèi)：只有編號(hào)172的材料；第Ⅴ類(lèi)：只有編號(hào)169的材料。編號(hào)199的辣椒材料在UPGMA聚類(lèi)分析中單獨(dú)分為一類(lèi)，而在MSP的三維主坐標(biāo)分析中聚在第一大類(lèi)群中。進(jìn)一步分析，MSP二維主坐標(biāo)分析與三維主坐標(biāo)分析的結(jié)果基本一致，只有編號(hào)為167和199的2個(gè)材料略有差異。

在MISP的三維主坐標(biāo)分析（圖5）中，30份國(guó)外引進(jìn)的辣椒材料可分為5個(gè)類(lèi)群，第Ⅰ類(lèi)：編號(hào)191、174、167、198、190、175、192、182、180、199、173、159、162、160、177、168、172、183、184、181、158、163、164、165、166和171，共26個(gè)材料；第Ⅱ類(lèi)：只有編號(hào)156的材料；第Ⅲ類(lèi)：只有編號(hào)157的材料；第Ⅳ類(lèi)：只有編號(hào)169的材料；第Ⅴ類(lèi)：只有編號(hào)178的材料。

圖5 國(guó)外引進(jìn)30份辣椒種質(zhì)資源MISP的三維主坐標(biāo)分析結(jié)果

3 討論

3.1 基因組DNA甲基化

高等植物基因組中胞嘧啶甲基化是較普遍的現(xiàn)象，且其DNA甲基化比例變化大約在20%～50%［15］。本研究中30份國(guó)外引進(jìn)的辣椒種質(zhì)資源的DNA甲基化比例在55.70%～82.69%，高于臍橙的4.70%～15.00%［16］、毛 竹 的16.57%～21.23%［13］、水 稻 的20.00%［17］、擬 南 芥 的24.00%～34.00%［18］、芥 藍(lán) 的47.00%［12］、甘藍(lán)的53.30%～60.70%［19］。而有學(xué)者研究表明，牡丹的DNA甲基化比例在61.80%～79.00%［20］。

綜上所述，不同物種間的基因組甲基化水平存在較大差異［1］。研究表明，植物的甲基化變異還有另一個(gè)特點(diǎn)，存在位點(diǎn)特異性，這在擬南芥［21，22］和水稻［10］上已有驗(yàn)證，從這個(gè)角度表明，植物的不同品種間具有明顯的DNA甲基化多態(tài)性。

DNA甲基化在植物中頻繁發(fā)生，物種間的甲基化模式存在較大的差異［1］，如芥藍(lán)［12］和臍橙［16］中“CCGG”序列甲基化模式以半甲基化為主，而枇杷［23］、銀杏［22］、辣椒［1］、橡膠樹(shù)［24］DNA甲基化的模式主要是以全甲基化為主。

本研究中30份國(guó)外引進(jìn)的辣椒種質(zhì)資源中有27份種質(zhì)資源雙鏈內(nèi)甲基化率都大于單鏈外甲化率，編號(hào)為156、167和192的3份種質(zhì)資源單鏈外甲化率大于雙鏈內(nèi)甲基化率，這可能與試驗(yàn)方法有關(guān)，還有待于進(jìn)一步研究。

3.2 MSAP聚類(lèi)分析與主坐標(biāo)分析

辣椒種質(zhì)資源遺傳聚類(lèi)遵守相同栽培種優(yōu)先聚為一類(lèi)的原則［1，5，25］，但是本研究MSP聚類(lèi)和MISP聚類(lèi)均比較離散，相關(guān)主坐標(biāo)分析與其聚類(lèi)分析結(jié)果基本一致。沒(méi)有將一年生辣椒聚為一個(gè)類(lèi)群，由此表明，辣椒表觀(guān)遺傳變異相對(duì)于基因組遺傳變異更加豐富。有學(xué)者對(duì)不同生態(tài)環(huán)境的紅樹(shù)林進(jìn)行MSAP研究表明，紅樹(shù)林有大量的DNA甲基化變異，而基因組變異較?。?6］；也有研究認(rèn)為不同生態(tài)性的植物可能甲基化調(diào)控機(jī)制不同，從而導(dǎo)致不同基因型植物之間的甲基化多態(tài)性不相關(guān)［1］，最后引起親緣關(guān)系比較緊密的植物也沒(méi)有歸為同一類(lèi)，這在擬南芥［18］、短芒野大麥［27］和丹參［28］的遺傳與表觀(guān)遺傳研究中也有相似的結(jié)果。由上述分析可知，在植物DNA甲基化變異相對(duì)于DNA序列變異更具有普遍性。

3.3 遺傳多樣性與表觀(guān)遺傳多態(tài)性的比較

通過(guò)對(duì)形態(tài)學(xué)性狀［29］和ISSR［6］分子標(biāo)記進(jìn)行的遺傳多樣性分析表明，這2種分析方法基本上能把一年生辣椒聚為同一類(lèi)，而DNA甲基化分析時(shí)采用MSP聚類(lèi)和MISP聚類(lèi)均不能把一年生辣椒聚為相同類(lèi)群，表觀(guān)遺傳多樣性較遺傳多樣性更具有離散性。進(jìn)一步分析表明，30份國(guó)外引進(jìn)的辣椒DNA甲基化變異較基因組序列變異更為普遍。

采用ISSR分子標(biāo)記的主坐標(biāo)分析［6］，30份國(guó)外引進(jìn)的辣椒種質(zhì)資源有兩大主體區(qū)域聚集分布；而基于MSAP標(biāo)記的MSP和MISP主坐標(biāo)分析時(shí)，30份國(guó)外引進(jìn)的辣椒種質(zhì)資源的離散程度均大于ISSR分子標(biāo)記的主坐標(biāo)分析，一年生辣椒和其他栽培種并沒(méi)有各自為主體自行分布，與聚類(lèi)分析結(jié)果相一致。由此說(shuō)明，30份國(guó)外引進(jìn)的辣椒種質(zhì)資源表觀(guān)遺傳多樣性較遺傳多樣性更為豐富。