趙世明，王美玲，律鳳霞

（牡丹江師范學院生命科學與技術學院，黑龍江 牡丹江157012）

稻瘟病是水稻栽培中的重要病害之一，中國南北稻區(qū)均有稻瘟病發(fā)生［1］，病害流行地區(qū)輕則減產(chǎn)10%～50%，嚴重罹病的稻田甚至絕收［2］。稻瘟病在水稻的各個時期及各個部位均有可能發(fā)病，尤其是棚內(nèi)育苗期、插秧后分蘗、抽穗初期更易感病［3-5］。植物病害的防治應做到以防為主治療為輔，最大限度規(guī)避化學防治，減少農(nóng)藥殘留，有利于消費者身體健康，有利于有機農(nóng)業(yè)的良性循環(huán)和健康發(fā)展［6，7］。而分離純化獲得植物病原菌純培養(yǎng)物，是了解該病原菌生物學特性和生態(tài)學習性的前提，是植物病害防控及抗病育種的基礎［8-11］。本研究從牡丹江市不同水稻栽培地采集疑似感染稻瘟病的水稻葉片，用PDA培養(yǎng)基進行病原菌純化初培養(yǎng)，通過觀察菌落黑色素產(chǎn)生及分生孢子的形態(tài)進行初篩鑒別；采用CTAB法提取菌絲DNA，以稻瘟病菌特異引物進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行測序及NCBI網(wǎng)站比對驗證，獲得純化后的病原稻瘟菌。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗材料疑似感染稻瘟病菌的水稻葉片，栽培稻田采集；DNA提取試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品；PCR試劑盒為寶生物工程有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖為Sigma公司產(chǎn)品；其他常用試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 試驗儀器雙面超凈工作臺、恒溫光照培養(yǎng)箱、全自動高溫蒸汽滅菌鍋、PCR儀，以及試管、酒精燈、燒杯、錐形瓶、培養(yǎng)皿等。

1.2 方法

1.2.1 稻瘟病病葉采集從牡丹江市6個不同水稻栽培地調(diào)查患稻瘟病的水稻植株，采集病害癥狀表現(xiàn)明顯的葉片及稻穗帶回備用，觀察并記錄葉片患病癥狀。

1.2.2 病原物菌落轉(zhuǎn)板純化培養(yǎng)超凈工作臺內(nèi)選擇病害癥狀明顯、病斑清晰的水稻病葉，0.1%氯化汞浸泡7 min后無菌水反復清洗，無菌剪刀剪取病斑病健交界組織（長約0.5 cm），均勻擺入PDA培養(yǎng)基中初培養(yǎng)，封口膜封好，恒溫培養(yǎng)箱（25℃）暗培養(yǎng)，培養(yǎng)皿倒置擺放，每天檢查病菌生長情況。

當培養(yǎng)基中病葉組織邊緣長出真菌菌落時，無菌環(huán)境下挑取菌落外緣菌絲，轉(zhuǎn)板至新PDA培養(yǎng)基中，繼續(xù)恒溫（25℃）培養(yǎng)。若原培養(yǎng)皿內(nèi)有其他菌落污染，尤其是那些不是從病組織周圍生長的菌落，需經(jīng)過多次轉(zhuǎn)板直至單一菌落生長。

1.2.3 純化的單菌落形態(tài)及分生孢子辨析初培養(yǎng)的病原菌菌落初期淺白色，后期有黑色素分泌，為稻瘟菌形態(tài)的特征標志之一。純培養(yǎng)8 d時，菌落生長布滿培養(yǎng)皿，菌落呈全黑色。無菌解剖刀刮挑菌落表面物進行顯微鏡下觀察。

1.2.4 單菌落病菌分子鑒定NCBI網(wǎng)站查詢并設計合成稻瘟病菌特異引物，菌落繼續(xù)培養(yǎng)至有較厚菌膜形成，刮取菌膜經(jīng)液氮速凍后，利用試劑盒提取菌絲DNA，以稻瘟菌特異引物進行PCR擴增，PCR反應體系：10×PCR Buffer 5.0μL，10 mmol/L dNTP混合 液2.0μL，25 mmol/L MgCl24.0μL，病 菌 菌 絲DNA 1.0μL，10 pmol/μL引物1 1.0μL，10 pmol/μL引物2 1.0μL，5 U/μLr-TaqDNA聚合酶0.6μL，ddH2O補足至總體積50.0μL，反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性40 s；58℃退火1 min，72℃延伸20 s，循環(huán)35次；72℃延伸5 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，將有特異帶的樣品送測序公司進行DNA序列測序，測序結(jié)果通過NCBI網(wǎng)站進行DNA的Blast比對。

1.2.5 純化病原菌的保存測序驗證無誤的純化菌，在無菌條件下用接種鏟取帶培養(yǎng)基的菌落小塊轉(zhuǎn)移入試管培養(yǎng)基（PDA斜面）中繼續(xù)培養(yǎng)，當病原菌絲長滿試管并呈現(xiàn)黑色后，取菌絲生長良好的試管放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 感病稻葉病癥初篩鑒定

田間采集感病稻葉的病斑多居葉脈處，梭形至長梭形，病斑外圍有淺黃色暈環(huán)，向內(nèi)漸變褐色，病斑中心淺灰白色，褐色壞死線橫貫病斑且沿縱向延伸（圖1）。

圖1 患稻瘟病的水稻葉片

2.2 PDA培養(yǎng)基內(nèi)菌落生物學特性初篩鑒定

如圖2a所示，表面消毒后的感病稻葉組織經(jīng)6 d的恒溫暗培養(yǎng)，病葉組織邊緣長出真菌菌落，經(jīng)反復轉(zhuǎn)板得到病原菌單一菌菌落；純培養(yǎng)的病原菌單菌落初期菌絲淺白色（圖2b），稻瘟菌特征之一的黑色素分泌使菌落呈灰黑色，邊緣有白色菌絲，得到疑似病原菌純培養(yǎng)物（圖2c）。

圖2 病葉組織邊緣病菌萌發(fā)及轉(zhuǎn)板后單菌落狀態(tài)

2.3 純化后培養(yǎng)物色素產(chǎn)生及分生孢子鏡下分辨

純培養(yǎng)單菌落繼續(xù)培養(yǎng)15 d時，如圖3所示，菌落長滿培養(yǎng)皿，呈全黑色。

無菌解剖刀刮挑菌落表面物進行顯微鏡下觀察其繁殖形態(tài)，如圖4所示，鏡下可見其分生孢子單生，分生孢子無色，棍棒形，通?？梢?～3個隔膜，分生孢子末部有腳胞，萌發(fā)時兩端細胞產(chǎn)生芽管，芽管頂端是褐色近圓形附著胞，初步確定為稻瘟病菌。

圖3 病菌純培養(yǎng)物黑色素特征

圖4 病菌純培養(yǎng)物分生孢子鏡下觀察

2.4 純培養(yǎng)的稻瘟病病菌分子鑒定

純化菌落繼續(xù)培養(yǎng)至有較厚菌膜形成，刮取菌膜提取菌絲DNA，以稻瘟菌特異引物進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖5所示。將電泳圖中1、2、4、5號泳道樣品送測序公司測序，其中，1號和5號樣品序列相同，測序結(jié)果在NC?BI網(wǎng)站進行Nucleotide Blast比對，與網(wǎng)站公布的稻瘟病菌分離株MZ5-1-6第6染色體全序列（CP034209.1）和稻瘟病菌70-15木質(zhì)素酶C部分mRNA（XM_003719963.1）同源性達99.23%，最終確定1號和5號純培養(yǎng)物為稻瘟病菌灰梨孢菌（Pyricu?laria grisea）。

圖5 特異引物PCR產(chǎn)物電泳

2.5 純化病原菌的保存

將Nucleotide Blast比對確認的病原菌，在無菌條件下取帶培養(yǎng)基的菌落小塊轉(zhuǎn)移入試管培養(yǎng)基（PDA斜面）中繼續(xù)培養(yǎng)，當病原菌絲長滿試管并呈現(xiàn)特有的顏色變化（黑色）（圖6）后，取菌絲生長良好的試管放入4℃冰箱保存?zhèn)溆茫ǘ唐诒４妫?/p>

圖6 鑒定后的病原菌試管保存

3 小結(jié)

水稻栽培田采集的患稻瘟病葉經(jīng)內(nèi)源寄生菌分離純化得到純培養(yǎng)物，經(jīng)菌落黑色素特征分泌及分生孢子形態(tài)鏡下鑒定，初步確定純培養(yǎng)物為稻瘟病致病菌，提取菌絲DNA進行特異引物PCR擴增后測序，測序結(jié)果經(jīng)Nucleotide Blast分子鑒定，最終獲得稻瘟病致病菌灰梨孢菌的純培養(yǎng)物，為稻瘟病防控及抗病育種提供試驗用純菌株。