嚴(yán)曉文，張 博，楊利民，陳 石，王秋泉

(廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，譜學(xué)分析與儀器教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361005)

化學(xué)元素周期表中的穩(wěn)定同位素普遍存在于生命體中[1]，或?yàn)樯匦柙?，或?yàn)樯\(yùn)行過程的輔助因子，或?yàn)楫a(chǎn)生異常行為或疾病的罪魁禍?zhǔn)?為了適應(yīng)賴以生存的環(huán)境變遷，生命體吸收利用有益元素或鈍化有害元素[2-8]以延續(xù)生命進(jìn)程.以有害元素汞(Hg)為例，為抵御Hg的侵害,動(dòng)植物都進(jìn)化了各自的抵御機(jī)制.在發(fā)展元素分析方法的基礎(chǔ)上[9-12]，我們發(fā)現(xiàn)與其他有害元素相比，Hg的毒性主要體現(xiàn)在與含巰基(—SH)分子的相互作用[13-15]，形成—Hg—S—準(zhǔn)共價(jià)鍵(鍵長(zhǎng)0.251 nm，鍵能217 kJ/mol，穩(wěn)定常數(shù)在1035～1044數(shù)量級(jí))，干擾正常生理活動(dòng)甚至致命.從研究角度看，設(shè)計(jì)合成尺寸不同的Hg標(biāo)簽，可對(duì)生物大分子所含的自由—SH和二硫鍵—S—S—進(jìn)行精準(zhǔn)測(cè)定[16]，并探測(cè)自由—SH所在生物分子的活性域位點(diǎn)[17]，深化對(duì)Hg的毒性機(jī)制和生物本身固有的抵御Hg侵害途徑的認(rèn)識(shí)，為相關(guān)治療藥物的設(shè)計(jì)和研發(fā)提供新思路.此外，Hg的這一特性啟示我們可以利用Hg來標(biāo)記生物分子，經(jīng)原子光譜或電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)對(duì)Hg的測(cè)定實(shí)現(xiàn)對(duì)生物分子的定量分析[18-20].在原子光譜分析技術(shù)的發(fā)展過程中，人們逐漸意識(shí)到ICP不僅可作為原子發(fā)射光譜的光源，還可為已處于激發(fā)態(tài)的原子提供更多能量，使其進(jìn)一步離子化，用MS讀出同位素離子信號(hào)，從而誕生了具有更高靈敏度、更寬線性范圍和同位素檢測(cè)能力的ICP-MS (圖1)[21].遺憾的是，Hg在ICP中的離子化效率只有不到40%，限制了其檢測(cè)靈敏度的提高；而且Hg的毒性嚴(yán)重制約了其廣泛使用的可能性.要使原本以元素分析為主要目標(biāo)的ICP-MS發(fā)展成為生物分子的分析工具，充分發(fā)揮ICP-MS的靈敏準(zhǔn)確且可提供同位素信息的優(yōu)勢(shì)，將難檢測(cè)的、含量極低的關(guān)鍵生物分子的絕對(duì)定量轉(zhuǎn)變?yōu)樵氐腎CP-MS分析，必須要有新的思路和策略(圖2)[22-25].

圖1 ICP-MS的原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of ICP-MS

利用抗原和抗體間的免疫識(shí)別能力，通過測(cè)定標(biāo)記在抗體上的金屬元素可以實(shí)現(xiàn)抗原分子的分析[26-28].在關(guān)注生物分子的組成、結(jié)構(gòu)和構(gòu)象時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)生物大分子中很多特定的官能團(tuán)，特別是蛋白質(zhì)分子的氨基酸殘基和翻譯后的修飾基團(tuán)，可以直接進(jìn)行化學(xué)修飾，用以明確化學(xué)計(jì)量比的共價(jià)標(biāo)記[23,29]；而且生物在不斷的進(jìn)化過程中所發(fā)展的自身代謝機(jī)制和伴隨的蛋白質(zhì)機(jī)器網(wǎng)絡(luò)，為在生物大分子中組裝帶有可后修飾基團(tuán)的關(guān)鍵分子模塊提供了可能性[30]；此外，對(duì)于集成了眾多生物分子的細(xì)胞，可以針對(duì)其自身所集成的生物分子進(jìn)行化學(xué)選擇性或生物特異性元素標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分析[31]；利用核酸的堿基互配原理和聚合酶鏈反應(yīng)信號(hào)放大策略實(shí)現(xiàn)單病毒水平的計(jì)數(shù)[32]；元素編碼標(biāo)記的病毒納米衣殼蛋白顆粒又可作為生物分子或細(xì)胞分析的信號(hào)倍增器[33]，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞表面生物分子的定量檢測(cè).

圖2 從原子到分子、細(xì)胞的ICP-MS分析方法學(xué)Fig.2 Analytical methodology using ICP-MS from atoms to molecules and cells

1 蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物分子分析方法學(xué)

1.1 化學(xué)選擇性標(biāo)記策略

基因組學(xué)的研究表明，人類基因編碼的蛋白質(zhì)分子中約96%都含有至少1個(gè)半胱氨酸，其巰基可被如前所述的Hg標(biāo)簽所標(biāo)記[18-20]，也可與馬來酰亞胺(maleimide, MAL)以1∶1的化學(xué)計(jì)量比選擇性反應(yīng).我們選擇含有MAL基團(tuán)的大環(huán)分子MAL-DOTA(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-trisacetic acid-10-maleimidoethylacetamide)，其中MAL作為反應(yīng)基團(tuán)，DOTA可配位裝載生物背景極低、在ICP-MS中離子化效率極高的非放射性鑭系元素(lanthanides,Ln: La,Ce,Pr,Nd,Sm,Eu,Gd,Tb,Dy,Ho,Er,Tm,Yb,Lu)，獲得MAL-DOTA-Ln元素標(biāo)簽(圖3).以Eu標(biāo)簽為例，與高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)聯(lián)用，通過形態(tài)非特異性同位素稀釋(species-unspecific isotope dilution,SUID) ICP-MS對(duì)Eu的測(cè)定來實(shí)現(xiàn)完整蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物分子的絕對(duì)定量分析(圖4)[34].

圖3 MAL-DOTA-Eu標(biāo)記的巰基結(jié)構(gòu)Fig.3 Structure of MAL-DOTA-Eu labeled —SH

圖4 胰島素A鏈、胰島素B鏈、核糖核酸酶A和 溶菌酶的151Eu和153Eu 色譜圖(a) 及由其轉(zhuǎn)變而來的Eu質(zhì)量流圖(b)[34]Fig.4 151Eu and 153Eu isotope chromatograms of the A chain of insulin,B chain of insulin,ribonuclease A, and lysozyme (a) and Eu mass flow chromatogram translated from them (b)[34]

1.2 生物特異性標(biāo)記和選擇性釋放策略

化學(xué)選擇性元素標(biāo)記是針對(duì)生物分子中某一可化學(xué)修飾的基團(tuán)(如—SH)展開的，而ICP-MS元素分析檢測(cè)的是所標(biāo)記的原子.如果針對(duì)所有目標(biāo)生物分子的相同基團(tuán)標(biāo)記同一種元素，生物分子則應(yīng)以“時(shí)間分辨”的方式依次進(jìn)入ICP-MS中進(jìn)行檢測(cè)，這時(shí)基線分離就非常必要了.雖然各種各樣的分離技術(shù)和新型色譜固定相材料已有長(zhǎng)足的發(fā)展[35-43]，但是要想分離復(fù)雜樣品(如蛋白質(zhì)組樣品)中的所有組分并間隔排列地送到ICP-MS中，目前尚有難度.因此，為降低分離難度，針對(duì)目標(biāo)生物分子靶向進(jìn)行元素標(biāo)記是一個(gè)可行的途徑.我們基于蛋白酶活性抑制原理，發(fā)展了針對(duì)絲氨酸蛋白酶家族(serine proteases,SPs)成員的絕對(duì)定量分析方法.首先對(duì)廣泛采用的4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟抑制劑分子中的磺酰氟基團(tuán)(—SF)進(jìn)行炔基(alkyne,ALK)化修飾獲得SF-ALK，并通過點(diǎn)擊化學(xué)(click chemistry,CC)反應(yīng)將N3-DOTA-Eu與SF-ALK鏈接，獲得靶向SPs的活性抑制Eu標(biāo)簽分子(SF-DOTA-Eu)(圖5)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞和組織中胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶的定量檢測(cè)(圖6)[44].運(yùn)用類似的策略，設(shè)計(jì)制備一個(gè)針對(duì)人類P450酶家族中CYP3A4具有選擇性活性抑制的雙功能己基化17α-炔雌二醇-DOTA-Eu探針，實(shí)現(xiàn)了CYP3A4的選擇性定量和活性評(píng)價(jià)(圖7)[45]；針對(duì)組織蛋白酶活性位點(diǎn)上的半胱氨酸設(shè)計(jì)環(huán)氧開環(huán)抑制劑分子-Eu探針“標(biāo)尺”，不僅可以對(duì)細(xì)胞溶酶體中組織蛋白酶的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，而且實(shí)現(xiàn)了溶酶體的pH檢測(cè)(圖8)[46].將化學(xué)選擇性捕獲標(biāo)記和生物酶選擇性釋放策略相結(jié)合可極大地提高分析方法的選擇性.針對(duì)蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化(pY)的選擇性分析，我們將雙鎵配合物(Ga-complex)經(jīng)一個(gè)光刻裂解基團(tuán)鏈接組裝到Fe3O4@SiO2—COOH磁性納米顆粒表面，Ga捕獲所有含磷酸基團(tuán)的生物分子，再利用酪氨酸磷酸酶PTP-1B選擇性釋放Ga-pY，最后由HPLC/71Ga-SUID-ICP-MS實(shí)現(xiàn)pY的定量分析(圖9)[47].

圖7 P450酶家族中CYP3A4的選擇性定量和活性評(píng)價(jià)[45]Fig.7 Selective quantification and activity evaluation of CYP3A4 in P450 enzyme family[45]

1.3 生物特異性免標(biāo)記策略

(a)環(huán)氧琥珀酰-LYK-ALK對(duì)組織蛋白酶活性域中Cys25的不可逆共價(jià)標(biāo)記,以及L和Y與活性域中氨基酸的 相互作用放大圖；(b)153Eu-SUID-ICP-MS檢測(cè)pH依賴的組織蛋白酶活性.圖8 環(huán)氧琥珀?；?LYK-ALK活性抑制和N3-DOTA-Eu的點(diǎn)擊標(biāo)記[46]Fig.8 Epoxysuccinyl-LYK-alkyne inhibitory and clickable N3-DOTA-Eu tagging[46]

圖9 集標(biāo)記、富集和紫外光-釋放磷酸化或含磷酸基團(tuán)分子/離子功能于一體的光可裂解磁性Ga-標(biāo)簽， 以及酪氨酸磷酸酶PTP-1B輔助下pY的HPLC/71Ga-SUID-ICP-MS選擇性定量[47]Fig.9 Photocleavable magnetic nanoparticles-based Ga-tag for tagging,enrichment,and UV-release of phosphorylated and phosphate-bearing molecules/ions and pY selective quantification using HPLC/71Ga-SUID-ICP-MS under the assistance of a protein tyrosine-specific phosphatase PTP-1B[47]

蛋白酶分子具有特異性切斷其底物多肽序列的特性.我們針對(duì)目標(biāo)蛋白酶設(shè)計(jì)了兩端分別編碼DOTA-Ln MS報(bào)告基團(tuán)和分離“抓手”彩色納米顆粒的多肽底物；當(dāng)樣品中存在目標(biāo)蛋白酶分子時(shí)，就會(huì)專一性切斷底物多肽同時(shí)釋放DOTA-Ln，繼而通過ICP-MS定量分析Ln，實(shí)現(xiàn)蛋白酶分子的定量和活性評(píng)價(jià)(圖10)[48].這種生物專一性的蛋白酶分子分析平臺(tái)的構(gòu)建實(shí)現(xiàn)了蛋白酶分子的免標(biāo)記定量分析，充分發(fā)揮了ICP-MS同時(shí)多元素分析的特性，克服了光分析方法存在的光學(xué)信號(hào)穩(wěn)定性不足和光譜重疊干擾的缺點(diǎn).在這一ICP-MS分析平臺(tái)上可以開展很多針對(duì)蛋白酶的研究工作，如酶抑制劑藥物的高通量篩選等.

(a)Ln編碼的蛋白酶特異性納米探針的設(shè)計(jì)合成，其中 Bpy.2,2′-聯(lián)吡啶,EDC.乙基-N′-[3-(二甲氨基)丙基] 碳二亞胺鹽酸鹽,NHS.N-羥基丁二酰亞胺；

以上針對(duì)蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物分子所發(fā)展的化學(xué)選擇性和生物特異性元素標(biāo)記策略使得ICP-MS不僅充分發(fā)揮其元素分析的特長(zhǎng)，而且使其應(yīng)用拓展至生物分子分析領(lǐng)域.相比于電噴霧離子化/基質(zhì)輔助激光解離電離質(zhì)譜(electrospray ionization/matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry,ESI/MALDI-MS)等軟電離源MS，ICP-MS具有更高的靈敏度和更寬的線性范圍，使用簡(jiǎn)單的單一富集同位素標(biāo)準(zhǔn)即可實(shí)現(xiàn)多種生物分子的絕對(duì)定量分析.需要指出的是，所發(fā)展的分析方法學(xué)不僅限于我們研究中所涉及的生物分子，也適用于其他重要的蛋白質(zhì)標(biāo)志分子的分析.

2 病毒、細(xì)菌和細(xì)胞分析

區(qū)別于上文的生物分子分析，細(xì)胞集成了多種生物分子.病毒、細(xì)菌和細(xì)胞直接分析獲取的結(jié)果是不同生物分子協(xié)同作用的綜合反映，為生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診斷提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù).

2.1 核酸介導(dǎo)的病毒分析

病毒的結(jié)構(gòu)相比于哺乳動(dòng)物細(xì)胞相對(duì)簡(jiǎn)單，其中核酸(DNA/RNA)常用于病毒分析.利用核酸的堿基互配選擇性，我們針對(duì)人類免疫缺陷病毒、甲肝和乙肝病毒的核酸保守序列設(shè)計(jì)單鏈捕獲DNA(ss-Cap-DNA)并修飾在磁性納米顆粒上；編碼有Ln的報(bào)告DNA[ss-Rep-DNA-DOTA-Ln(Eu,Tb,Ho)]，經(jīng)DNA滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle replication,RCA)信號(hào)放大，通過Eu、Tb和Ho的ICP-MS定量實(shí)現(xiàn)了百余個(gè)病毒拷貝的檢測(cè)，為病毒的高靈敏準(zhǔn)確計(jì)數(shù)提供了一個(gè)新方法(圖11)[32].

圖11 DNA介導(dǎo)的病毒ICP-MS分析[32]Fig.11 DNA-mediated analysis of viruses using ICP-MS[32]

2.2 非天然氨基酸代謝和CC介導(dǎo)的單細(xì)菌分析

細(xì)菌區(qū)別于其他生命體的一個(gè)特點(diǎn)是其含有支撐細(xì)胞壁的肽聚糖(peptidoglycan,PG)結(jié)構(gòu).PG可以看作是一個(gè)完整的高分子，由D-Ala交聯(lián)L-Ala-γ-D-Glu-L-Lys/m-DAP-D-Ala-D-Ala(Ala.丙氨酸；Glu.谷氨酸；L-Lys.革蘭氏陽(yáng)性菌；m-DAP.革蘭氏陰性菌)形成.生物學(xué)研究表明，細(xì)菌可利用自身的蛋白質(zhì)機(jī)器將非天然的D-Ala代謝組裝到PG中.我們利用細(xì)菌的這一特性，采用炔基化的二肽ALK-D-Ala-D-Ala為底物，代謝組裝ALK-D-Ala到細(xì)菌細(xì)胞壁中，通過生物正交的CC反應(yīng)將N3-DOTA-Eu標(biāo)記在細(xì)菌細(xì)胞壁上，實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌的元素標(biāo)記.由于有至少105的ALK-D-Ala代謝到細(xì)菌細(xì)胞壁中以及定量的CC反應(yīng)效率，相對(duì)于單個(gè)細(xì)菌，通過對(duì)Eu的ICP-MS檢測(cè)可以實(shí)現(xiàn)5個(gè)數(shù)量級(jí)的信號(hào)放大；利用標(biāo)記有不同Ln的細(xì)菌多克隆抗體，又可以對(duì)所定量的細(xì)菌種類進(jìn)行識(shí)別鑒定.這一方法學(xué)的發(fā)展為細(xì)菌分析開辟了一條新途徑，可以實(shí)現(xiàn)多種細(xì)菌的同時(shí)定性和定量分析(圖12)[49].

(a)ALK-D-Ala-D-Ala二肽代謝組裝N3-DOTA-Eu標(biāo)記和La、Pr、Nd、Sm及Gd編碼的細(xì)菌多克隆抗體識(shí)別， 以大腸桿菌(Escherichia coli)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，李斯特菌(Listeria monocytogenes)， 痢疾志賀菌(Shigella dysenteriae)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)為例；(b)151/153Eu、139La、141Pr、142Nd、152Sm和160Gd單細(xì)菌ICP-MS分析.圖12 非天然氨基酸代謝和CC介導(dǎo)的單細(xì)菌ICP-MS分析[49]Fig.12 Unnatural amino acid metabolism and CC mediated single bacterial ICP-MS analysis[49]

2.3 單細(xì)胞分析平臺(tái)和信號(hào)倍增策略

細(xì)胞群體分析在一定程度上體現(xiàn)了細(xì)胞的平均行為，并不能反映細(xì)胞間的差異.作為生命基本單元的細(xì)胞集成了多種生物分子，這些生物分子的協(xié)同作用決定了細(xì)胞的正常生理特性和病變征兆.單細(xì)胞分析不僅可以探明細(xì)胞間的行為差異，而且可為理解細(xì)胞間差異的生物學(xué)來源和精準(zhǔn)的疾病診斷提供確切依據(jù).除了發(fā)展針對(duì)細(xì)胞表面生物分子靶向標(biāo)記策略外，對(duì)于真正意義上的單細(xì)胞分析還需要解決兩個(gè)必須面對(duì)的問題：1) 單細(xì)胞的分選和有序排列，2) 提高檢測(cè)靈敏度以滿足單細(xì)胞分析的要求.為此，我們?cè)O(shè)計(jì)制作了無(wú)油(NH4HCO3)微流控芯片操控細(xì)胞有序排列(可調(diào)控通量為400～25 000 min-1)，設(shè)計(jì)制作了直接注入式細(xì)胞進(jìn)樣接口提高細(xì)胞的傳輸(100%)和檢測(cè)效率(大于70%)，僅僅采用可熱分解的NH4HCO3溶液來調(diào)控細(xì)胞間的間隔時(shí)間，一方面降低油-水液滴包裹細(xì)胞方法對(duì)后續(xù)MS檢測(cè)的干擾,另一方面與MS的檢測(cè)速度相匹配(圖13)[50].提高檢測(cè)靈敏度對(duì)單細(xì)胞分析尤為重要.利用噬菌體MS2衣殼蛋白可修飾氨基酸殘基的特點(diǎn)，我們發(fā)展了可控修飾元素報(bào)告標(biāo)簽和靶向基團(tuán)的策略，獲得了具有明確Ln原子個(gè)數(shù)的MS2納米顆粒，作為ICP-MS檢測(cè)的信號(hào)倍增器，靈敏度提高的數(shù)倍與Ln的個(gè)數(shù)相當(dāng).在具體針對(duì)KB細(xì)胞分析時(shí)，MS2衣殼蛋白上可以修飾1 000個(gè)Eu，相比于單純使用DOTA-Ln配合物分子，靈敏度提高了3個(gè)數(shù)量級(jí)(圖14)[33].單細(xì)胞操控分析平臺(tái)的搭建和病毒樣納米顆粒信號(hào)倍增策略的發(fā)展，為基于ICP-MS的單細(xì)胞分析研究的進(jìn)一步展開提供了硬件和方法學(xué)保證.

圖13 無(wú)油微流控分選-直接注入式單細(xì)胞ICP-MS分析平臺(tái)[50]Fig.13 Direct infusion ICP-MS of lined-up single-cell using an oil-free passive microfluidic system[50]

圖14 元素標(biāo)記的病毒樣納米顆粒與細(xì)胞 分析信號(hào)倍增策略[33]Fig.14 Element-tagged viruslike nanoparticle and signal multiplication strategy for cell analysis[33]

3 總結(jié)與展望

從原子到分子和細(xì)胞分析方法學(xué)經(jīng)過近20年的不斷發(fā)展，使原本以元素分析為目的的原子光譜和ICP-MS拓展至分子乃至細(xì)胞、細(xì)菌和病毒的檢測(cè).更為重要的是，ICP-MS和所構(gòu)建的元素標(biāo)簽工具箱可幫助我們探知尚未了解的生命現(xiàn)象和背后的機(jī)制，理解生命過程.一方面，目前所知的金屬和類金屬元素在細(xì)胞中的分布和含量信息幾乎都是基于細(xì)胞群體分析方法獲得的，單細(xì)胞ICP-MS分析可以使我們?cè)趩渭?xì)胞層面上進(jìn)一步理解關(guān)鍵內(nèi)源金屬和類金屬的生理/病理作用，推動(dòng)金屬組學(xué)研究的發(fā)展；另一方面，所發(fā)展的化學(xué)選擇性和生物特異性元素標(biāo)記策略可以使我們涉獵以往難以想象的單細(xì)胞中超痕量生物分子的檢測(cè)，充分發(fā)揮ICP-MS直接分析完整細(xì)胞的優(yōu)勢(shì).可以預(yù)見，隨著基于ICP-MS生物分析方法的不斷發(fā)展，生命元素和分子的功能和細(xì)胞的行為將被進(jìn)一步了解以促進(jìn)新藥物的設(shè)計(jì)和研發(fā)，疾病的診斷與治療將更加精準(zhǔn)，健康的維護(hù)將得到進(jìn)一步提升.

致謝：感謝黃本立先生的教誨！感謝曾經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室工作和學(xué)習(xí)過的同仁和學(xué)生們的辛勤工作！