李 煜，陳順有

（廈門大學附屬福州第二醫(yī)院，福建 福州350007）

由于創(chuàng)傷、關節(jié)炎或病灶切除后修復骨或軟骨組織缺損的需要，納米纖維支架逐漸成為重要的生物組織工程之一。納米纖維支架具有優(yōu)良的三維網(wǎng)格狀結構，能為骨髓間充質干細胞（MSCs）提供穩(wěn)定的幾何結構環(huán)境［1-5］。聚乳酸（PLLA）制備的納米纖維支架具有較好的生物相容性及低毒性等優(yōu)點，但其仍存在親水性能差、降解速率慢等缺點，所以將親水性片段植入PLLA支架中，為植入的細胞提供生物信號成為納米纖維支架研發(fā)的關鍵［6］。隨著近些年復合材料的發(fā)展，將中藥及其有效成分引入納米纖維材料中成為生物組織工程的新趨勢。中藥淫羊藿具有祛風除濕、補腎壯骨的功效，淫羊藿苷作為淫羊藿莖葉的主要有效成分，具有良好的緩控釋性能及生物降解性，且能夠促進MSCs增殖分化［7］。本研究擬通過熱致相分離技術（TIPS）制備聚乳酸支架（PLLA支架）、賴氨酸／聚乳酸復合支架（Lys／PLLA支架）及淫羊藿苷-賴氨酸／聚乳酸復合納米纖維支架（ICA-Lys／PLLA支架），觀察3種支架的結構并分析其理化性能和生物相容性能，分析3種支架在成骨及骨修復中作用的差異，為PLLA支架的改性提供依據(jù)，探討ICA-Lys／PLLA支架在骨組織工程中的應用潛力。

1 材料及方法

1.1 材料PLLA（江蘇優(yōu)利科技有限公司）；1，4-二氧六環(huán)、賴氨酸（國藥集團化學試劑有限公司）；無水乙醇（天津市大茂化學試劑廠）；淫羊藿苷（中國藥品生物制品檢定所）；人軟骨細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司）；胎牛血清FBS（美國Gibco公司）；DMEM低糖培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；CCK8試劑（上海碧云天生物技術有限公司）。

1.2 儀器 真空干燥機（上海一恒科學儀器有限公司）；JEM-1200EX掃描電鏡（日本電子公司）；SL200B型接觸角測試儀（美國科諾工業(yè)有限公司）；MTS Synergie 200機械測試儀（美國MTS系統(tǒng)公司）；SW-CJ-1FD超凈工作臺（蘇州安泰儀器設備有限公司）；HERA cell CO2培養(yǎng)箱（德國Kendro Laboratory Products）；ELX808酶標儀（美國Bio-Tek公司）。

1.3 材料制備

1.3.1 支架制備 ①稱取1.8 g PLLA及16.38 g 1，4-二氧六環(huán)溶液于燒杯中，將燒杯放入60℃水浴鍋中攪拌溶解均勻至無氣泡，制成溶劑A；②純水為PLLA支架的溶劑B；稱取0.3 g賴氨酸置于10 mL燒杯中，加入一定量的純水至2 g制成Lys／PLLA支架的溶劑B；將淫羊藿苷溶于10 mL無水乙醇中制成濃度為10-8mol／L的淫羊藿苷溶液，與濃度為15%的賴氨酸溶液混合均勻制成ICA-Lys／PLLA支架的溶劑B；③待溶劑A內無PLLA固體殘留后按各組支架分別稱取1.82 g的溶劑B于溶劑A中，于60℃水浴鍋中攪拌30 min，得到溶劑C（w／w＝90／10）；④將溶劑C倒入10 mL小燒杯中約1 cm高，放入-40℃冰箱中冷凝相分離。約24 h后取出燒杯，放入4℃生物箱中用4℃超輕水（DDW）進行溶劑交換至不再有油狀物存在，即抽提完成（交換液每6～8 h更換1次，總時長共3～4 d）。最后將燒杯置于-40℃的冰箱中冷凍6 h后，放入-80℃冷凍干燥機中干燥2～3 d抽干水分，得到的支架放入自封袋中以待測試。［8］

1.3.2 浸提液制備 取1.5 g支架用75%乙醇浸泡2 h，純水反復沖洗，紫外燈照射1 h滅菌后剪碎，放入13.5 mL的DMEM培養(yǎng)基于37℃的恒溫振蕩箱中浸泡72 h。過濾，加入1.5 mL FBS，配成含10%FBS的DMEM PLLA支架浸提培養(yǎng)基、DMEM Lys／PLLA支架浸提培養(yǎng)基及DMEM ICA-Lys／PLLA支架浸提培養(yǎng)基，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 結構觀察及理化性能分析

1.4.1 掃描電子顯微鏡 用刀片將支架切成2 mm×2 mm的樣品，利用掃描電子顯微鏡觀察3種支架的多孔形貌及孔徑。

1.4.2 接觸角測試 利用接觸角測試儀器測試支架的水接觸角，分析親水性。

1.4.3 機械性能分析 使用機械測試儀測量支架的壓縮模量。所有支架均為圓形圓盤（直徑16 mm，厚度2 mm），每種支架測試6個樣本。

1.4.4 細胞毒性及增殖率分析 軟骨細胞按1×106～1×107／L接種于96孔板中，每組6孔，待細胞貼壁24 h后吸掉原培養(yǎng)基，分別加入PLLA、Lys／PLLA和ICA-Lys／PLLA支架浸提培養(yǎng)基，以完全培養(yǎng)基作為對照。各組于48 h后將原培養(yǎng)基吸出，再次加入100μL的新PLLA浸提培養(yǎng)基、Lys／PLLA支架浸提培養(yǎng)基、ICA-Lys／PLLA浸提培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基，以消除培養(yǎng)過程中優(yōu)于培養(yǎng)基蒸發(fā)帶來的誤差。向每孔中加入10μL的CCK8，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后酶標儀測定OD值，通過計算細胞存活率分析細胞毒性。測定波長450 nm，參考波長630 nm。同法在第1、3、5、7天時測量OD值，依據(jù)OD值繪制3種支架的細胞增殖曲線。

1.5 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)均至少進行3次獨立實驗，計量資料采用（±s）表示，采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析，組間比較采用獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1 掃描電子顯微鏡分析 與PLLA支架相比，Lys／PLLA支架及ICA-Lys／PLLA支架均有相對均勻的納米纖維結構，這種三維纖維結構有利于細胞在支架表面黏附、生長及增殖。ICA-Lys／PLLA支架的納米纖維結構未出現(xiàn)改變，且表面有淫羊藿苷顆粒附著。見圖1。

圖1 3種支架電鏡圖（×20 000）

2.2 接觸角測試 改性后的PLLA支架的水接觸角較PLLA支架均有所下降，水接觸角的大小明顯降低，而通過加入淫羊藿苷，其水接觸角進一步下降，見圖2。分析原因可能是賴氨酸作為氨解劑引進了更多的親水基團，淫羊藿苷中的有效成分增強對水的吸附，大大改進了PLLA支架的親水性，從而降低了水接觸角。

圖2 3種支架水接觸角的比較

2.3 機械性能分析 圖3可見，與PLLA支架相比，Lys／PLLA支架和ICA-Lys／PLLA支架的機械性能均明顯下降，但Lys／PLLA支架與ICA-Lys／PLLA支架間的抗壓強度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）?？紤]可能是因為Lys／PLLA支架與ICA-Lys／PLLA支架具有更好的纖維結構和提供更多空間，導致抗壓力減小。同時賴氨酸和淫羊藿苷的引入使得大分子鏈的PLLA變短，聚合力下降，最終導致抗壓性能降低。

2.4 細胞毒性及增殖率測定 從表1可見，3種支架提取液培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞存活率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明PLLA支架對細胞毒性很小。與Lys／PLLA支架相比，ICA-Lys／PLLA支架的細胞存活率相對較低，考慮原因為淫羊藿苷對細胞仍存在一定的毒性，但在濃度為10-8mol／L時制備的ICA-Lys／PLLA支架毒性較小，可安全用于細胞學研究［9］。圖4可見，3種支架整體上趨勢基本相同，OD值的大小與細胞數(shù)量成正比，隨時間增加而呈上升趨勢。Lys／PLLA支架的OD值優(yōu)于PLLA支架（P＜0.05），說明引進賴氨酸后的支架更有利于細胞的黏附和增殖。ICA-Lys／PLLA支架的生長曲線位于所有曲線頂部，高于PLLA支架及Lys／PLLA支架（P＜0.05），說明在實驗測定的時間內，淫羊藿苷的引入能夠促進軟骨細胞的增殖。

圖3 3種支架抗壓強度比較

表1 3種支架細胞存活率比較（±s）%

表1 3種支架細胞存活率比較（±s）%

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圖4 3種支架上細胞增殖曲線圖

3 討 論

納米纖維支架是組織工程的關鍵之一，旨在通過促進骨生成、骨傳導和整合來刺激骨的再生能力［2-3］。支架的三維孔隙結構和表面形態(tài)影響著支架上正在發(fā)育的組織質量。由于PLLA具有良好的生物相容性、降解性、無毒性、可加工性和優(yōu)異的機械性能，已被美國食品和藥物管理局（FDA）批準用于臨床，并在心血管、骨及軟骨再生等組織再生材料中得到了廣泛的研究及應用［4-5，10］。PLLA納米纖維支架具有生物可降解性以及細胞外基質（ECM）的特征，能夠增強MSCs的黏附、成骨分化、增殖及遷移，從而促進礦化骨形成［11-12］。但其作為組織再生工程支架材料仍存在局限性。首先PLLA作為一種相對疏水材料在組織中降解速度較慢，易導致炎癥反應等。其次，其生物相容性仍不能滿足生物組織再生的要求，因此需要通過引入更多的親水片段對PLLA支架進行改性。研究指出PLLA支架通過改性具有良好的生物相容性和組織相容性，能夠促進成骨細胞和間充質細胞系的增殖，促進體內功能骨的形成［13-14］。本研究通過將氨基酸引入到PLLA支架中，改善PLLA支架的網(wǎng)格狀纖維結構，提高支架的親水性。許多研究均發(fā)現(xiàn)通過使用賴氨酸改性聚乳酸支架的細胞黏附效果優(yōu)于PLLA支架，指出賴氨酸改性后的支架具有較好的生物相容性［15-17］。本研究發(fā)現(xiàn)以賴氨酸作為氨解劑制備的納米纖維支架具有良好的三維網(wǎng)格纖維結構，同時賴氨酸作為堿性氨基酸能夠為成骨細胞的生長提供有力的環(huán)境，為細胞提供黏附和增殖位點。

隨著近些年復合材料的發(fā)展，將中藥及其有效成分引入納米纖維材料中成為生物組織工程的新趨勢，主要中藥及其成分包括骨碎補提取物柚皮苷、淫羊藿提取物淫羊藿苷、自然銅、葛根素、牛膝提取物等［18-20］。淫羊藿苷是淫羊藿莖葉的主要活性成分，具有性能穩(wěn)定、耐60Co輻照滅菌、易儲存等特點［7］。已有多項研究指出淫羊藿苷制備的支架具有良好的緩控釋性能及生物降解性，同時有抑制破骨細胞生成及骨吸收的作用，最終促進骨缺損的修復［21-24］。

本研究在構建Lys／PLLA支架的基礎上進一步構建ICA-Lys／PLLA支架材料。良好的材料需要構建出模擬ECM特性的三維結構支架，并向植入支架內的細胞提供生物信號，以達到維持細胞黏附、生長及分化等目的［6］。在本研究中，從理化性能上看，淫羊藿苷被PLLA包裹或散在分布于材料的間隙中，電鏡掃描示改性后的支架形成了與天然ECM相似的宏觀層面的管狀幾何結構和納米尺度的纖維結構。ICA-Lys／PLLA支架的纖維結構未發(fā)生變化，具有適合細胞接種、分布、功能和組織再生結構的高孔隙。與Lys／PLLA支架相比，ICA-Lys／PLLA支架的機械性能未發(fā)生明顯改變，但與PLLA支架相比，改性后的2組支架的抗壓強度均降低。改性后的PLLA支架引進了更多的如-COOH、-OH、-NH2的親水性基團，增加了親水性能，ICA-Lys／PLLA支架的親水性能更優(yōu)于Lys／PLLA支架。生物性能分析可見ICA-Lys／PLLA支架具有低毒性、良好的生物相容性和成骨誘導性，更利于細胞黏附、增殖和分布，既改善了PLLA支架的親水性，又充分利用淫羊藿苷成骨誘導性和穩(wěn)定性，將淫羊藿苷促進MSCs增殖分化的作用從二維模式提升到三維立體支架中，在組織工程中具有潛在的應用價值。但仍存在一定局限性，首先與PLLA支架相比，ICA-Lys／PLLA支架未能形成足夠的機械性能來支持組織再生，這在后期實驗中需進一步引入其他材料，在不影響親水性、生物相容性等前提下增強其抗壓強度。其次，本實驗僅進行了細胞層面的生物相容性分析，在體內是否能具有更好的生物相容性及生物降解性需要進一步研究。

結果表明，與PLLA支架及Lys／PLLA支架相比，ICA-Lys／PLLA復合納米纖維支架具有良好的生物相容性，具有更好的支持骨和軟骨發(fā)育的作用，能為細胞黏附和增殖提供更好的位點，是骨或軟骨缺損再生的良好候選支架，在組織工程中具有潛在的應用價值。