楊 齊，黃斌良，吳華德，江朝明

(廣西多得樂生物科技有限公司，廣西南寧 530000)

0 引言

右旋糖酐是一種大分子聚合物，主要由D-葡萄糖分子通過α-1,6-糖苷鍵連接形成的主鏈，以及α-1,2-糖苷鍵和α-1,4-糖苷鍵形成的側(cè)鏈構(gòu)成[1]。因其安全無毒、生物相容性好、來源豐富等特性，右旋糖酐已被廣泛應(yīng)用在食品、醫(yī)藥等多個(gè)領(lǐng)域[2,3]。天然的右旋糖酐分子量相對較高，必須經(jīng)酸水解或酶水解形成小分子量右旋糖酐后才能加以應(yīng)用。但是酸法生產(chǎn)的右旋糖酐含有氯離子，并且所得產(chǎn)物分子量不統(tǒng)一，不能滿足臨床需求，而酶法反應(yīng)條件溫和，所得產(chǎn)物分子量范圍比較狹窄，并且能大大減少污染[4]。

右旋糖酐酶(E.C.3.2.1.11)是一種誘導(dǎo)酶，能夠?qū)Ｒ恍运庥倚囚械摩?1,6-糖苷鍵[5,6]。生產(chǎn)右旋糖酐酶的微生物有很多，從一開始，真菌和細(xì)菌就被確定為能夠水解葡聚糖的主要酶源，特別是真菌。來源于細(xì)菌的右旋糖酐酶相對較少，并且其酶活力相對較低，但是卻具有良好的熱穩(wěn)定性[7,8]。真菌來源的右旋糖酐酶大多穩(wěn)定性好，酶活力較高，具有很高的研究價(jià)值和商業(yè)價(jià)值[9-13]。

Plackett-Burman (PB)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可以從大量變量中篩選主要因素，響應(yīng)面法是一種有效的實(shí)驗(yàn)工具，通過它可以確定多變量系統(tǒng)中的最優(yōu)條件。因此，為了有利于工業(yè)化生產(chǎn)，本研究擬篩選能夠高產(chǎn)右旋糖酐酶的真菌菌株，并利用響應(yīng)面法對其發(fā)酵生產(chǎn)右旋糖酐酶的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以期得到最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基，為其深入研究及工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

右旋糖酐T70、T500、T2000及藍(lán)色葡聚糖購自上海麥克林生化有限公司，常用化學(xué)試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，蛋白胨購自Sigma公司。

1.2 菌株篩選

平板篩選培養(yǎng)基(g/L)：右旋糖酐9，藍(lán)色葡聚糖1，硝酸鈉3，磷酸氫二鉀1，硫酸鎂0.5，硫酸錳0.01，氯化鉀 0.5，瓊脂粉 15-20，pH值為5.5-6.0。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：右旋糖酐10，蛋白胨3，磷酸氫二鉀1，硫酸鎂 0.5，pH值為5.5-6.0。

取5 g土樣，加入50 mL 滅菌ddH2O，振蕩30 min后靜置沉淀，取上清分別稀釋1×103-1×107倍后，取100 μL涂布到平板篩選培養(yǎng)基上，28℃靜止培養(yǎng)5-7 d。挑選產(chǎn)生透明圈的菌株，轉(zhuǎn)接到搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)5-7 d后，檢測右旋糖酐酶活力[14]。

1.3 菌株鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

在PDA平板上接種菌株，28℃靜止培養(yǎng)，觀察并記錄菌落形態(tài)及顏色。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定

收集發(fā)酵液中菌絲體，提取基因組DNA。以基因組DNA為模板，以ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)為引物,通過PCR擴(kuò)增ITS rDNA序列。所得產(chǎn)物送至華大基因公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫已有的ITS rDNA序列進(jìn)行Blast比對，并利用MEGA的Neighbor-Joining軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Boot-strap分析重復(fù)設(shè)置為1 000。

1.4 右旋糖酐酶的活力測定

取1 mL適當(dāng)稀釋的酶液，加入4 mL 3%的右旋糖酐T70 (0.02 mol/L的醋酸緩沖液配制，指定pH值)，在指定溫度下反應(yīng)10 min后，利用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法檢測還原糖量[15]。

一個(gè)酶活力單位(U)定義為每分鐘釋放1 μmol的還原糖所需的酶量。

1.5 培養(yǎng)基優(yōu)化

1.5.1 單因素實(shí)驗(yàn)

分別用葡萄糖、蔗糖、果糖、檸檬酸、玉米淀粉、糊精取代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源。接種篩選出的菌株于各培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)7 d后檢測右旋糖酐酶活力，探索發(fā)酵產(chǎn)酶所需最佳碳源。

分別用酵母粉、尿素、硝酸鈉、硫酸銨等取代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源。接種篩選出的菌株于各培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)7 d后檢測右旋糖酐酶活力，探索發(fā)酵產(chǎn)酶所需最佳氮源。

在最佳碳源和最佳氮源組成的培養(yǎng)基中，分別添加不同的無機(jī)鹽：硫酸鎂、氯化鉀、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸錳、硫酸亞鐵、氯化鈣等。接種篩選出的菌株于各培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)7 d后檢測右旋糖酐酶活力，檢測無機(jī)鹽對篩選出的菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，以未添加無機(jī)鹽的培養(yǎng)基作為對照。

1.5.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

1.5.2.1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取6個(gè)因素進(jìn)行PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)因素取兩個(gè)水平：低水平“-1”和高水平“+1”。

1.5.2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

結(jié)合PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果選出的顯著因素，設(shè)計(jì)它們的變化方向和步長進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，使各因素的取值更臨近最佳值區(qū)域，為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)做好準(zhǔn)備。

1.5.2.3 Box-Benhnken Design (BBD)實(shí)驗(yàn)

在最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定的實(shí)驗(yàn)因素中心點(diǎn)基礎(chǔ)上，根據(jù)BBD中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3因素3水平共15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

從土壤中篩選得到一株右旋糖酐酶產(chǎn)生菌株DJ72，該菌株能夠在篩選平板培養(yǎng)基上形成明顯透明圈，接種到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，所產(chǎn)右旋糖酐酶活力達(dá)98 U/mL。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將菌株在PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，菌落生長整齊，顯白色或淡黃色，呈絨毛狀(圖1a)，在顯微鏡下觀察，菌絲有隔、分枝。小分生孢子呈紡錘狀或卵圓形，大分生孢子呈梭形或月牙形(圖1b)

圖1 菌株DJ72的形態(tài)學(xué)特征

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

提取菌株DJ72的總DNA并作為模板，應(yīng)用通用引物ITS1和ITS4作為引物，克隆得到其ITS rDNA序列，經(jīng)測序獲得一條 521 bp的核苷酸序列，同源性比對分析表明，其與腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)菌株的同源性最高，達(dá)100%(圖2)。

圖2 菌株DJ72的系統(tǒng)進(jìn)化分析

根據(jù)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，菌株DJ72為腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)。將DJ72保藏在中國微生物菌種保藏中心，保藏編號為CGMCC No.14542。

2.3 培養(yǎng)基單因素優(yōu)化

2.3.1 碳源對DJ72發(fā)酵生產(chǎn)右旋糖酐酶的影響

用不同的碳源取代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的右旋糖酐T500，經(jīng)搖瓶震蕩發(fā)酵7 d后檢測右旋糖酐酶活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，右旋糖酐相比其他碳源更有利于右旋糖酐酶的發(fā)酵，其中以分子量更大的右旋糖酐T2000為碳源所產(chǎn)酶活力更高(圖3)。

圖3 碳源對DJ72發(fā)酵生產(chǎn)右旋糖酐酶的影響

2.3.2 氮源對DJ72發(fā)酵生產(chǎn)右旋糖酐酶的影響

用不同的氮源取代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源，經(jīng)搖瓶震蕩發(fā)酵7 d后檢測右旋糖酐酶活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蛋白胨與尿素的組合最利于DJ72發(fā)酵生產(chǎn)右旋糖酐酶(圖4)。

圖4 氮源對DJ72發(fā)酵生產(chǎn)右旋糖酐酶的影響

2.3.3 無機(jī)鹽對DJ72發(fā)酵生產(chǎn)右旋糖酐酶的影響

在最佳碳源和氮源的基礎(chǔ)上添加不同的無機(jī)鹽，經(jīng)搖瓶震蕩發(fā)酵7 d后檢測右旋糖酐酶活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，硫酸鎂、磷酸氫二鉀和硫酸亞鐵有利于DJ72發(fā)酵生產(chǎn)右旋糖酐酶(圖5)。

圖5 無機(jī)鹽對DJ72發(fā)酵生產(chǎn)右旋糖酐酶的影響

2.4 培養(yǎng)基響應(yīng)面優(yōu)化

2.4.1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取6個(gè)因素進(jìn)行考察，采用試驗(yàn)次數(shù)N=12的 PB進(jìn)行設(shè)計(jì)。6個(gè)因素分別為右旋糖酐T2000、尿素、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵，分別對應(yīng)表1中A、B、D、E、G和H列。每個(gè)因素取兩個(gè)水平：低水平“-1”和高水平“+1”。另設(shè)兩個(gè)虛擬列，考察實(shí)驗(yàn)誤差，分別為C和F列。具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析見表1和表2。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)值Table 1 Plackett-Burman experiment design and response values

從表2可以看出，在PB設(shè)計(jì)的兩個(gè)水平范圍內(nèi)，尿素、蛋白胨和右旋糖酐對酶活力具有顯著影響，影響力大小為尿素>蛋白胨>右旋糖酐。因此，對這3種因素開展更進(jìn)一步研究。為節(jié)約成本，今后實(shí)驗(yàn)中其余成分取最低值。

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)因素水平和效應(yīng)分析Table 2 Factor levels and effect analysis in Plackett-Burman experiments

2.4.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

由PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取尿素、蛋白胨以及右旋糖酐等3個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，根據(jù)這3個(gè)因素的效應(yīng)大小比較，設(shè)定它們的變化方向和步長，結(jié)果見表3。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，最佳發(fā)酵條件可能在實(shí)驗(yàn)3附近，因此以實(shí)驗(yàn)3的條件為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of the steepest climbing experiment

2.4.3 Box-Benhnken Design (BBD)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在PB實(shí)驗(yàn)及最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，對右旋糖酐、蛋白胨及尿素3個(gè)變量對右旋糖酐酶發(fā)酵結(jié)果的影響進(jìn)行考察，采用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4。

表4 Box-Benhnken 實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table 4 Box-Benhnken experiment design and results

通過 Design Expert 軟件對表4中實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到二次多元回歸方程：Y=227.33+0.50A+5.13B+4.63C-14.75AB-16.25AC-14.00BC-16.42A2-16.17B2-16.17C2，其中Y為右旋糖酐酶活力。進(jìn)一步對該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表5。

表5 方差分析結(jié)果Table 5 Analysis of variance for the quadratic model

續(xù)表5Continued table 5

各因素之間交互作用及其對右旋糖酶活力影響如圖6所示，在3個(gè)因素的取值范圍內(nèi)，右旋糖酐酶活力均存在最大值。從圖6a可知，蛋白胨與右旋糖酐交互作用明顯，在一定范圍內(nèi)隨著蛋白胨和右旋糖酐取值不斷增大，右旋糖酐酶活力不斷增大，然后開始降低。從圖6b可知，尿素與右旋糖酐交互作用明顯，過高或過低的取值都會使酶活力降低。從圖6c可知，尿素與蛋白胨對右旋糖酐酶活力影響極為顯著，表現(xiàn)為陡峭的曲面。

圖6 各因素交互作用圖

根據(jù)回歸模型預(yù)測右旋糖酐酶活力最大為228 U/mL，此時(shí)右旋糖酐T2000用量為11.88 g/L，蛋白胨用量為7.15 g/L，尿素用量為3.14 g/L。根據(jù)預(yù)測結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，平行3次所得右旋糖酐酶活力分別為227，227，229 U/mL，平均值為227.66 U/mL，與預(yù)測結(jié)果基本一致。

因此，經(jīng)過優(yōu)化，確定腐皮鐮刀菌DJ72發(fā)酵生產(chǎn)右旋糖酐酶的最佳配方為右旋糖酐T2000 11.88 g/L，蛋白胨7.15 g/L，尿素 3.14 g/L，磷酸氫二鉀1.50 g/L，硫酸鎂0.20 g/L，硫酸亞鐵0.05 g/L。

3 討論

提高右旋糖酐酶發(fā)酵產(chǎn)量的方法有很多，如Li等[16]采用補(bǔ)料分批發(fā)酵和兩步發(fā)酵法提高了右旋糖酐酶的活力，分別為159.50和187 U/mL。吳敏等[17]通過基因工程的方法將右旋糖酐酶酶活力提高到240 U/mL。其中，響應(yīng)面法是運(yùn)用較多并且行之有效的培養(yǎng)基優(yōu)化方法，如曹研研等[18]通過響應(yīng)面法優(yōu)化棘孢青霉菌的發(fā)酵條件，將右旋糖酐酶酶活力提高了88%。楊帆等[19]通過響應(yīng)面法優(yōu)化圓弧青霉發(fā)酵右旋糖酐酶的發(fā)酵培養(yǎng)基，將酶活力提高1.7倍。本研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化腐皮鐮刀菌DJ72發(fā)酵產(chǎn)右旋糖酐酶的培養(yǎng)基成分，與初始發(fā)酵培養(yǎng)基相比，右旋糖酐酶活力從98 U/mL提升至228 U/mL，酶活力提升1.3倍。

國際上有關(guān)右旋糖酐酶生產(chǎn)菌株的報(bào)道已有很多，但是有關(guān)腐皮鐮刀菌生產(chǎn)右旋糖酐酶的報(bào)道較少，迄今為止僅見到Maksimov等[20]發(fā)表的一篇相關(guān)文章，類似的報(bào)道國內(nèi)尚未見到。本研究是國內(nèi)首次有關(guān)腐皮鐮刀菌生產(chǎn)右旋糖酐酶的報(bào)道，該工作一方面擴(kuò)充了國內(nèi)有關(guān)右旋糖酶來源菌株的范圍，另一方面也為研究人員深入研究右旋糖酐酶提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。