李臻，張曉英，楊國(guó)棟

（1.川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，四川 南充 637000）

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是一種可引起全身炎癥反應(yīng)綜合征、膿毒癥、多器官功能障礙綜合征、膽石癥等而危及生命的疾病，膽道疾病、酒精、高脂飲食等是AP的常見病因[1-2]。 近年來(lái)，隨著飲食結(jié)構(gòu)的變化，高脂血癥性急性胰腺炎（hyperlipidemia acute pancreatitis，HLP）的發(fā)病率明顯上升，據(jù)統(tǒng)計(jì)，12%～38%的高脂血癥患者發(fā)生AP[3]。目前，HLP的主要治療方法是血液凈化、降血脂等以達(dá)到降低血清甘油三酯水平，防止全身炎癥反應(yīng)，雖然以上治療可以降低血清甘油三酯，但目前尚無(wú)治療HLP的正式策略[4]。因此，需要開發(fā)更有效的治療HLP的方法。

腸道微生物區(qū)系多樣性和結(jié)構(gòu)的變化與代謝和炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，包括糖尿病、肥胖癥和動(dòng)脈粥樣硬化等[5]。研究表明AP大鼠的腸道微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，并在門水平上糖化細(xì)菌門和軟壁菌門的豐度降低[6]。Nishiyama等[7]證明慢性胰腺炎患者腸道內(nèi)關(guān)鍵有益菌的豐度增加，其中包括黏液阿克曼氏菌和羅伊氏乳桿菌。然而，與HLP患者腸道微生物區(qū)系變化相關(guān)的研究仍然有限。相關(guān)報(bào)道指出全身和腸道過(guò)度釋放炎性細(xì)胞因子會(huì)導(dǎo)致AP的發(fā)生，p38MAPK信號(hào)通路的激活參與了炎癥的調(diào)節(jié)，抑制p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可作為降低中性粒細(xì)胞炎癥的選擇性干預(yù)措施[8]，p38MAPK抑制劑SB203580已被證明可以減輕AP患者腸黏膜屏障的損傷[9]。然而，p38MAPK信號(hào)通路在HLP腸道炎癥和微生物區(qū)系失調(diào)中的作用仍不清楚。故本研究觀察p 38 MAPK抑制劑SB203580對(duì)HLP腸道微生物區(qū)系失調(diào)及炎癥的影響，為HLP的治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性SD 大鼠24 只，體質(zhì)量250～300 g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，使用許可證號(hào)[SYXK（川）2019-189]，生產(chǎn)許可證號(hào)[SCXK（川）2020-030]。大鼠在控制溫度（23±1）℃和相對(duì)濕度65%～70% 的情況下，按12 h 的光/ 暗周期飼養(yǎng)，所有大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，將大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為3 組，假手術(shù)組、模型組、p38MAPK 抑制劑（SB203580）組。

1.1.2 主要試劑與儀器p38MAPK 抑制劑（SB203580）（ 批號(hào)：124-20-9）購(gòu)自上海吉至生化科技有限公司（Mr=145.25）；D- 乳酸（D-lactate，貨號(hào)：ZC-36102）、二胺氧化酶（DAO，ZC-36566）、白介素1β（IL -1β， 貨號(hào)：ZC-36391）、腫瘤壞死因子α（TNF-α，貨號(hào)：ZC-37624）、白介素6（IL-6， 貨號(hào)：ZC-36404）ELISA 試劑盒購(gòu)自上海茁彩生物科技有限公司；p38MAPK（批號(hào)：8690）、p-p38MAPK（批號(hào)：4511）相關(guān)抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology（CST）公司（中國(guó)）；蛋白定量試劑盒（BCA 法）購(gòu)自R&D 公司（美國(guó)）；正置熒光顯微鏡（型號(hào)：DM3000）購(gòu)自德國(guó)Leica 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高脂血癥性AP 大鼠模型建立模型組、SB203580 組：大鼠給予高脂飼料（77%普通飼料+ 20% 豬油+3% 膽固醇）喂養(yǎng)4 周后，2% 戊巴比妥鈉（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒、固定、備皮、鋪消毒洞巾，取劍突下腹部正中切口入腹，長(zhǎng)約2～3 cm，尋找十二指腸及胰膽管，確認(rèn)后使用血管夾阻斷肝門膽管，頭皮針經(jīng)乳頭對(duì)側(cè)十二指腸壁穿刺進(jìn)入十二指腸腔，經(jīng)十二指腸乳頭逆行入胰膽管，深度約5 mm，使用血管夾將頭皮針固定于十二指腸乳頭，使用微量泵恒速將5%?；悄懰徕c（1 mg/kg）注入膽胰管內(nèi)，結(jié)束后仍保持壓力8 min，去除血管夾及穿刺針，觀察到出現(xiàn)胰腺水腫伴出血后縫合腹壁，術(shù)后皮下注射0.9%生理鹽水5 mL 補(bǔ)充血量。假手術(shù)組：大鼠予以普通飼料喂養(yǎng)4 周后，術(shù)中僅輕輕翻動(dòng)十二指腸和胰腺，不注射?；悄懰徕c，在確保腹腔中沒(méi)有活動(dòng)性出血后，關(guān)閉腹腔。SB203580 組大鼠造模前1 h 腹腔注射SB203580（5 mg/kg），假手術(shù)組、模型組大鼠注射等量生理鹽水。

1.2.2 樣本采集各組大鼠分別于造模后12 h 腹主動(dòng)脈采血，采集每組大鼠新鮮糞便樣本（10±5）g，置于密閉的無(wú)菌便盒中，迅速放入-80 ℃冰箱內(nèi)保存，每組樣本數(shù)≥6 用于腸道微生物檢測(cè)。后處死大鼠，分別取遠(yuǎn)端回腸和胰腺組織，用4% 多聚甲醛固定。

1.2.3 胰腺和回腸組織病理學(xué)觀察將固定的胰腺和遠(yuǎn)端回腸組織經(jīng)全自動(dòng)脫水機(jī)脫水，包埋，切片，放入蘇木精中染色約10 min，自來(lái)水沖洗使切片顏色變藍(lán)，1% 鹽酸酒精分化數(shù)秒鐘，使細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，1% 氨水中數(shù)秒，至返藍(lán)，1% 伊紅染色3 min 左右，脫水，透明，中性樹膠封存，鏡檢觀察組織病理變化，以Chiu 等[10]腸組織損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)和Schmidtt[11]胰腺組織評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織病理評(píng)分。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)采用ELISA 試劑盒檢測(cè)血漿D- 乳酸、DAO 含量及腸道組織中IL-1β、TNF-α 和IL-6 的水平。

1.2.5 Western blot 分析用RIPA 裂解液提取回腸組織總蛋白，BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定總蛋白水平。然后用8%～12% SDS-PAGE 分離蛋白質(zhì)樣品，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，用含有5% 脫脂牛奶的TBS/T 緩沖液封閉聚偏氟乙烯膜，然后與抗p38MAPK 或p-p38MAPK 抗 體（1:1000）4 ℃孵育過(guò)夜，然后與過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體或抗鼠免疫球蛋白G（IgG）抗體在37 ℃孵育1 h。取出聚偏氟乙烯膜，化學(xué)發(fā)光法獲得膠片后進(jìn)行圖像采集，目標(biāo)條帶A值采用Quantity One 凝膠圖像軟件分析，以目標(biāo)條帶與β-actin 條帶A值的比值作為相應(yīng)蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)。

1.2.6 腸道微生物區(qū)系分析對(duì)樣本進(jìn)行16S rDNA 基因測(cè)序，參照糞便基因DNA 磁珠法提取試劑盒說(shuō)明，采用磁珠法提取糞便樣本DNA，抽提所得DNA 采用Qubit 2.0 和2% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)檢，將質(zhì)檢合格的基因組DNA 純化后進(jìn)行兩輪PCR 擴(kuò)增，構(gòu)建樣本測(cè)序文庫(kù)，Qubit?2.0熒光劑檢測(cè)樣本濃度，Agilent 2100 檢測(cè)文庫(kù)的大小，然后按照MiSeq 測(cè)序試劑說(shuō)明書，進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，鑒定腸道菌群組成以及表達(dá)峰度，數(shù)據(jù)采用QIIME 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

OUT序列和α/β多樣性分析通過(guò)QIIME分析軟件實(shí)現(xiàn)，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，且均符合正態(tài)分布，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠胰腺和回腸組織病理變化及評(píng)分

假手術(shù)組：胰腺和回腸組織未見明顯增生、壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組：胰腺組織部分胰島內(nèi)細(xì)胞變性壞死，見細(xì)胞崩解，胞核溶解消失，間質(zhì)內(nèi)和血管周圍較多炎細(xì)胞浸潤(rùn)；回腸組織腸絨毛頂部上皮細(xì)胞變性壞死，見細(xì)胞崩解，胞質(zhì)淡染，固有層毛細(xì)血管暴露，細(xì)胞成分增多，毛細(xì)血管充血。SB 2035 80 組：胰腺組織薄層纖維組織被膜較為完整，葉間隙略微增寬，部分胰島內(nèi)少量細(xì)胞變性壞死，腺泡上皮細(xì)胞少量變性壞死，間質(zhì)內(nèi)和血管周圍少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；回腸組織黏膜層、黏膜下層、肌層及外膜結(jié)構(gòu)較完整，黏膜固有層內(nèi)管狀腸腺結(jié)構(gòu)較清晰，局部炎細(xì)胞聚集增多，以淋巴細(xì)胞為主，肌層和漿膜層未見明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和增生（圖1A）。組織病理評(píng)分結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組胰腺、回腸組織病理評(píng)分明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，SB203580組胰腺、回腸組織病理評(píng)分明顯降低（P＜0.01）（圖1B）。

圖1 各組大鼠胰腺和回腸組織病理變化及評(píng)分 A：胰腺與回腸組織病理變化（HE×400）；B：胰腺與回腸組織病理學(xué)評(píng)分 Figure 1 Pathological changes and scores of pancreas and ileum tissues of rats in each group (HE×400) A: Pathological changes of the pancreas and ileum tissue; B: Pathological scores for pancreas and ileum tissue damage

2.2 各組大鼠腸屏障功能及細(xì)胞因子變化

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血漿D-乳酸、DAO及回腸組織IL-1β、TNF-α、IL-6含量明顯升高（均P＜0.05）；與模型組比較，SB203580組大鼠血漿DAO及回腸組織IL-1β、TNF-α、IL-6含量明顯降低（均P＜0.05），血漿D-乳酸含量降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2）。

圖2 各組大鼠腸屏障功能及細(xì)胞因子變化Figure 2 Changes in intestinal barrier function and cytokine levels of rats in each group

2.3 各組大鼠回腸組織p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠回腸組織p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)明顯升高（均P＜0.01）；與模型組比較，SB203580組大鼠回腸組織p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)明顯降低（均P＜0.05）（圖3）。

圖3 各組大鼠回腸組織p38MAPK、p-p38MAPK 蛋白表達(dá)Figure 3 The expressions of p38MAPK and p-p38MAPK protein in the ileum tissue of rats in each group

2.4 各組大鼠腸道微生物區(qū)系分析

16SrDNA擴(kuò)增序列測(cè)定，產(chǎn)生了1843 01個(gè)有效序列。由α多樣性指數(shù)可知各組間Chao1指數(shù)、Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)均沒(méi)有明顯差異，治療干預(yù)對(duì)菌群的豐富度及均勻度沒(méi)有明顯影響（圖4 A）。β 多樣性顯示各組間無(wú)明顯交疊趨勢(shì)，存在聚類現(xiàn)象，SB 2035 80 組和模型組的樣本分布存在差異（圖4 B）。在門水平上，在假手術(shù)組中，糞便樣本中菌群門水平最豐富的是厚壁菌門（Firmicuts）和擬桿菌門（Bacteroidetes）；與假手術(shù)組比較，模型組糞便微生物區(qū)系組成有明顯的變化，以厚壁菌門（Firmicuts）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為主，擬桿菌門（Bacteroidetes）比例明顯升高（P ＜0.05）；與模型組相比，SB 2035 80 組擬桿菌門（Bacteroidetes）比例下降，厚壁菌門（Firmicuts）豐度增加（P ＜0.05）（圖4 C）。在屬的水平上，糞便成分的個(gè)體差異增強(qiáng)，假手術(shù)組、模型組和SB 2035 80 組以乳酸桿菌（Lactobacillus）和阿克曼氏菌（Akkermansia）為主， 其比例在3 組間具有可比性。 乳酸桿菌（Lacto bacillus）豐度在模型組增加，而在SB 2035 80 組降低，模型組阿克曼氏菌（Akkermansia）豐度降低，SB203580組可增加阿克曼氏菌（Akkermansia）豐度（圖4D）。

圖4 各組大鼠腸道微生物區(qū)系分析 A：各組α 多樣性指數(shù)；B：β 多樣性；C：門水平優(yōu)勢(shì)菌群屬；D：屬水平優(yōu)勢(shì)菌群屬Figure 4 Analysis of gut microflora in each group of rats A: The α-diversity index of each group; B: The β-diversity; C: The dominant flora at phylum level; D: The dominant flora at genus level

3 討 論

HLP與較高的發(fā)病率和病死率有關(guān)，可導(dǎo)致胰腺和胰外器官壞死、繼發(fā)感染和多系統(tǒng)器官衰竭[12-13]。根據(jù)研究[14]報(bào)道，盡管HLP相關(guān)病死率在過(guò)去10年中有所下降，但它仍然是一種破壞性疾病，病死率從不到10%到高達(dá)85%不等。此外，由于對(duì)HLP的發(fā)病機(jī)制和多種因果關(guān)系的了解有限，HLP有效的治療方式較少[15]。故本研究探討了p38MAPK抑制劑SB203580對(duì)HLP腸道微生物區(qū)系失調(diào)及炎癥的影響，以期為HLP的治療提供理論支撐。

研究[16-17]報(bào)道炎癥在HLP的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)HLP大鼠回腸組織中炎性細(xì)胞因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）含量明顯增加，胰腺和回腸組織病理?yè)p傷及組織病理評(píng)分明顯增加，組織病理學(xué)檢查結(jié)果與炎性細(xì)胞因子表達(dá)結(jié)果一致。絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)[18]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)主要的MAPK家族，包括p38MAPK、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2）和c-Jun 氨基末端蛋白激酶（JNK）。其中，p38MAPK影響胰腺炎的嚴(yán)重程度，在急性胰腺炎的發(fā)展過(guò)程中，p38MAPK信號(hào)通路參與了NF-κB活化的調(diào)節(jié)，NF-κB在炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[19-20]。此外，p38MAPK的激活導(dǎo)致p38 MAPK下游蛋白激酶MK2 的磷酸化，從而觸發(fā)NF-κB的表達(dá)，增加炎癥反應(yīng)[21]。幾項(xiàng)研究表明，p38MAPK抑制劑SB203580降低了雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎中p38MAPK的活性，并減弱了胰腺中的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞因子的釋放[22-23]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)p38MAPK抑制劑SB203580能明顯降低HLP大鼠回腸組織IL-1β、TNF-α、IL-6含量，提示SB203580處理可明顯降低HLP大鼠炎癥反應(yīng)及病理?yè)p傷。

人類腸道微生物區(qū)系是一個(gè)多樣化的微生物群落，據(jù)估計(jì)，其包含1000多種不同的細(xì)菌，以及共生真菌和病毒[24-25]。估計(jì)人體腸道中的微生物總數(shù)約為100萬(wàn)億，是構(gòu)成人體細(xì)胞數(shù)量的10 倍，而集體微生物基因組即微生物組，包含的基因大約是整個(gè)人類基因組的100倍[26]。微生物群極大地增強(qiáng)了宿主的代謝能力，并對(duì)維持腸道內(nèi)環(huán)境平衡做出了積極貢獻(xiàn)[27]。而關(guān)于腸道微生物區(qū)系的變化及其影響，目前仍知之甚少。Chen等[6]采用糞便16S rDNA基因測(cè)序方法研究急性胰腺炎大鼠腸道微生態(tài)的變化，發(fā)現(xiàn)急性胰腺炎大鼠腸道微生物區(qū)系多樣性降低，尤其是在門水平上糖化細(xì)菌門和軟壁菌門的豐度降低。目前研究在腸道中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌門以厚壁菌門（Firmicuts）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為主，其他如放線菌門（Actino bacteria）、變形菌門（Proteobacteria）等占有一定比例[28]。在本研究中，模型組以厚壁菌門（Firmicuts）和擬桿菌門（Bacteroide tes）為主，擬桿菌門（Bacteroidetes）比例明顯升高。Tan等[29]招募了108名參與者，發(fā)現(xiàn)腸道微生物區(qū)系改變的急性胰腺炎患者的多器官衰竭和感染并發(fā)癥的發(fā)生率明顯高于腸道微生物區(qū)系未改變的患者，急性胰腺炎患者腸球菌（Enterococcus）豐度增加，雙歧桿菌（Bifidobacterium）豐度減少。Hamada等[30]對(duì)1 型自身免疫性胰腺炎和慢性胰腺炎患者的腸道菌群進(jìn)行了綜合分析比較，發(fā)現(xiàn)慢性胰腺炎患者腸道菌群中卵形擬桿菌（Bacteroides ovatus）、澳大利亞鏈球菌（Streptococcus australis）、戈登鏈球菌（Streptococcus gordonii）、乳酸發(fā)酵梭菌（Clostridium lactati fermentans）含量較高。然而，抗炎治療對(duì)急性胰腺炎患者腸道菌群的影響仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)與模型組相比，SB203580組擬桿菌門（Bacteroi detes）比例下降，厚壁菌門（Firmicuts）豐度增加，增加阿克曼氏菌（Akkermansia）豐度，表明SB203580組具有更高的細(xì)菌多樣性和豐富度，SB203580處理可明顯降低對(duì)腸道微生物區(qū)系的損傷，誘導(dǎo)更正常的腸道微生物區(qū)系組成。

綜上所述，HLP大鼠炎癥加重，腸屏障受損，腸道菌群失調(diào)；p38MAPK抑制劑SB203580可降低腸道炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)微生物區(qū)系失調(diào)，SB203580具有治療HLP的潛力。