鄧陳琪，聶 堯，徐 巖

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

度洛西汀(Cymbalta，欣百達，化學(xué)名為(S)-N-甲基-3-(1-萘氧基)-3-(2-噻吩)-1-丙胺) 是一種5-羥色胺和去甲腎上腺素再攝取的雙重抑制劑(SNRIs)[1]，適用于治療重度抑郁癥、強迫癥及壓力性尿失禁[2]。作為一種多功能手性藥物，度洛西汀的功效明顯優(yōu)于市面上其他抗抑郁藥的功效，具有不親和于神經(jīng)元受體和副作用少的優(yōu)點[3]。Liu等[4]發(fā)現(xiàn)僅(S)-型對映體具有藥物活性，因此合成光學(xué)純(S)-度洛西汀具有重要的價值。

1990年，禮來公司利用(2R,3S)-(+)-4-二甲氨基-1,2-二苯基-3-甲基-2-丁醇與氫化鋁鋰兩者2∶ 1的絡(luò)合物催化N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DKTP) 不對稱還原反應(yīng)，成功獲得光學(xué)純度約80%～88%的度洛西汀前體(S)-N,N-二甲基-3-羥基-3-(2-噻吩)-1-丙胺((S)-DHTP)[5]，逆向合成策略表明，單一構(gòu)型的(S)-DHTP是合成度洛西汀生產(chǎn)的優(yōu)良前體。手性中間體(S)-DHTP與1-氟萘縮合，利用2,2,2-三氯乙基氯甲酸酯和Zn進行去甲基化反應(yīng)可生成(S)-度洛西汀(圖1)。

圖1 (S)-DHTP合成度洛西汀途徑Fig.1 Route of Duloxetine synthesized from (S)-DHTP

2006年，F(xiàn)ujima等[6]整理了禮來公司從獲得(S)-DHTP到合成度洛西汀的“拆分-去消旋-循環(huán)”策略發(fā)現(xiàn)，相對于化學(xué)反應(yīng)副產(chǎn)物多、反應(yīng)步驟繁雜等問題，在溫和條件下具有精細的區(qū)域選擇性和立體選擇性的生物催化[7]是目前最綠色的合成手性藥物方法。2005年，Soni等[8]首次報道了用微生物催化合成(S)-DHTP，利用土壤中篩選出的熱帶假絲酵母CandidatropicalisPBR-2催化DKTP生成(S)-DHTP，在30 ℃、pH 7.0條件下催化 1 g/L DKTP，添加細胞250 g/L，經(jīng)48 h反應(yīng)，產(chǎn)物(S)-DHTP產(chǎn)率約84%～88%，對映體過量值(e.e.)≥99%。

自然篩選或者基因工程手段構(gòu)建重組菌株來合成度洛西汀其他前體的研究也有報道。2011年，Tang等[9]篩選出黏紅酵母RhodotorulaglutinisCY12催化30 g/LN,N-二甲基-3-氧雜-3-(2-噻吩)丙酰胺(MOTPA)反應(yīng)48 h，獲得(S)-N-甲基-3-羥基-3-(2-噻吩基)丙酰胺((S)-MHTPA)，e.e.>99.9%。2012年，Ou等[10]應(yīng)用液核固定化Candidapseudotropicalis104催化12 g/L 3-氯-1-(2-噻吩基)丙酮(CTP)，反應(yīng)10 d能夠完全轉(zhuǎn)化為(S)-3-氯-1-(2-噻吩基)-1-丙醇 ((S)-CTPO)。同時，Wada等[11]通過基因挖掘方法，將來源于Exiguobacteriumsp. F42的目的基因構(gòu)建至重組大腸桿菌中，能夠不對稱轉(zhuǎn)化3-氧雜-3-(2-噻吩)丙酸乙酯(KEES)生成(S)-3-羥基-3-(2-噻吩)丙酸乙酯((S)-HEES)。Ren等[12]構(gòu)建了重組酮還原酶ChKRED15轉(zhuǎn)化10 g/L KEES生成 (S)-HEES，e.e.>99.9%。2014年，Ou等[13]在膜反應(yīng)器上連續(xù)反應(yīng)48 h催化5 g/LN-3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-1-丙酮，轉(zhuǎn)化率達100%。目前所報道的生物催化合成度洛西汀前體催化底物濃度普遍處于較低水平且反應(yīng)周期長，全細胞催化的轉(zhuǎn)化反應(yīng)普遍存在胞內(nèi)功能酶的局限性[14]，這是因為全細胞膜結(jié)構(gòu)阻礙底物同酶的結(jié)合[15]。

羰基還原酶需要以煙酰胺輔酶因子(NADH或NADPH)作為供氫體參與氧化還原反應(yīng)，實現(xiàn)輔酶循環(huán)是羰基還原酶催化手性酮能應(yīng)用于實際生產(chǎn)的前提。在輔酶循環(huán)再生的方法中，多酶耦聯(lián)法效率較高，目前廣泛應(yīng)用葡萄糖脫氫酶(GDH)作為NAD(P)H循環(huán)再生的耦聯(lián)酶[16]。將兩個或兩個以上單獨編碼的蛋白質(zhì)連接成一段新基因獲得多功能融合蛋白，其鄰近效應(yīng)[17]通常會減少中間擴散距離，從而增加中間體在擴散逃逸前成功參與反應(yīng)的可能性，降低中間體損失量，并且兩個酶活性位點的靠近產(chǎn)生通道效應(yīng)[18]，促進中間體從一個酶更快傳輸?shù)较乱粋€酶。融合蛋白體系促進了用催化不對稱還原的羰基還原酶和輔酶再生的葡萄糖脫氫酶的兩個酶活性中心之間的輔因子轉(zhuǎn)移，促使反應(yīng)所需輔因子向活性中心聚集，提升生物催化效率[19]。Holsch等[20]利用來自Synechococcussp. PCC 7942的3-酮脂酰-還原酶(KR)催化還原反應(yīng)，來自MycobacteriumvaccaeN10的甲酸脫氫酶(FDH)實現(xiàn)輔酶循環(huán)再生，構(gòu)建出具有雙功能的融合蛋白，全細胞催化五氟苯乙酮(PFAP)不對稱還原生成對映值大于99.9%的(S)-1-(五氟苯)乙醇((S)-PFE)，且產(chǎn)物產(chǎn)率為99.97%。Sührer等[21]構(gòu)建融合酶體系KR-MycFDH不對稱還原乙酸苯甲酰乙酯(EBA)生成弗洛西汀前體(S)-乙基-3-羥基-3-苯丙酸酯((S)-HPPE)，融合酶催化的反應(yīng)產(chǎn)率比游離酶催化的反應(yīng)產(chǎn)率提高39%。孫太強等[22]利用高選擇性羰基還原酶CR2催化10 g/L DKTP，產(chǎn)物(S)-DHTP產(chǎn)率達到68%。李斌等[23]利用CR2催化1 g/L DKTP，產(chǎn)物(S)-DHTP產(chǎn)率為92.1%，e.e.>99.9%。

本文中,筆者以DKTP為底物，以柔性連接肽構(gòu)建的高選擇性羰基還原酶CR2[22]和輔酶再生的葡萄糖脫氫酶GDH所得的融合酶CR2-GDH為生物催化劑，不對稱合成手性藥物度洛西汀直接有效的手性中間體(S)-DHTP，構(gòu)建搖瓶水平上單批次重組酶體系并優(yōu)化反應(yīng)條件，進一步考察搖瓶水平的分批補料反應(yīng)，以提高底物濃度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

表達融合酶CR2-GDH的重組菌株E.coliBL21(DE3)/pET-cr2-linker-gdh由筆者所在實驗室構(gòu)建和保藏[24]。

DKTP，上海阿拉丁生化科技有限公司；DHTP和(S)-DHTP，百靈威科技有限公司；卡那霉素，生工生物工程(上海)有限公司；輔酶NADP+，上海索萊寶生物科技有限公司；色譜級正己烷、異丙醇、乙酸乙酯，阿達瑪斯公司；其他分析純試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10；固體培養(yǎng)基添加瓊脂20 g/L。

乳糖自誘導(dǎo)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，α-乳糖10 g/L，無水葡萄糖0.5 g/L，甘油5 g/L，KH2PO46.8 g/L，Na2HPO47.1 g/L，Na2SO40.71 g/L，MgSO42 mmol/L，NH4Cl 2.67 g/L；pH 7.5～8.0。

以上培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃滅菌20 min后使用。

1.2 設(shè)備與儀器

Ultimate U-3000型高效液相色譜儀(HPLC)，美國DIONEX公司；7890B型氣相色譜儀(GC-FID)，美國Agilent公司；Mini-Bead-Beater-8型低溫高壓勻漿細胞破碎機，美國冷泉港公司；UV-3102PC型分光光度儀，美國UNIC公司；Avanti J-E型冷凍高速離心機，美國Beckman Coulter公司；T&J-EnzyR 500mL*3型酶催化平行反應(yīng)器，上海迪必爾生物工程有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌體培養(yǎng)

將菌株E.coliBL21(DE3)/pET-cr2-linker-gdh劃線到含卡那霉素(50 μg/mL)的LB固體平板培養(yǎng)基上，37 ℃倒置過夜培養(yǎng)，挑取單菌落至5 mL LB培養(yǎng)基含卡那霉素(50 μg/mL)的試管中培養(yǎng)6～8 h，以2%(體積分數(shù))的接種量轉(zhuǎn)接入含卡那霉素(50 μg/mL)的700 mL乳糖自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)3 h后變溫至17 ℃誘導(dǎo)蛋白表達，誘導(dǎo)時長為60 h。

1.3.2 CR2-GDH重組酶粗酶液制備

將發(fā)酵液于轉(zhuǎn)速8 000 r/min、低溫4 ℃離心15 min收集菌體，用0.9% NaCl水溶液洗滌3次，收集菌體，用三乙醇胺磷酸緩沖(0.1 mol/L，pH 8.0)重懸(1 g濕菌體加入5 mL緩沖)，經(jīng)高壓勻漿破碎至液體澄清，12 000 r/min、0 ℃離心40 min，取上清液用0.22 μm水系濾膜過濾，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測其表達蛋白條帶大小是否與目的蛋白一致，可得粗酶液。

1.3.3 酶活力測定

200 μL酶活測定體系。三乙醇胺磷酸緩沖(0.1 mol/L，pH 8.0)，5 mmol/L底物DKTP，0.5 mmol/L NADPH，30 ℃溫浴 3 min，最后加入適量粗酶液混合均勻，檢測波長340 nm，經(jīng)細胞成像微孔板檢測儀掃描吸光度的變化情況，每組實驗設(shè)置3個平行組，取平均值。

酶活定義：1 U(酶活單位)定義為以DKTP為底物時，每分鐘將1 μmol NADPH轉(zhuǎn)化為NADP+的酶量。

蛋白質(zhì)含量測定按照Bradford法[25-26]，以牛血清蛋白為標準蛋白制作標準曲線，樣品濃度以標準曲線計算獲得。

比酶活的計算見式(1)。

比酶活=酶活/m(蛋白)

(1)

1.3.4 CR2-GDH不對稱還原DKTP反應(yīng)

15 mL反應(yīng)體系：20 g/L底物DKTP，40 g/L 無水葡萄糖，0.1 mmol/L NADP+，三乙醇胺磷酸緩沖(0.1 mol/L，pH 8.0)，7 U融合酶CR2-GDH粗酶液，在30 ℃、200 r/min條件下反應(yīng)12 h。

1.3.5 CR2-GDH不對稱轉(zhuǎn)化DKTP單批次反應(yīng)單因素條件優(yōu)化

在確定反應(yīng)過程最適pH(7.5～9.0)的基礎(chǔ)上，進而優(yōu)化反應(yīng)溫度(25～55 ℃)、底物和輔底物葡萄糖質(zhì)量比(1∶ (0.5～4))、轉(zhuǎn)速(50 ～300 r/min)，并探究底物 (10 ～40 g/L)對不對稱轉(zhuǎn)化DKTP反應(yīng)的影響。

1.3.6 CR2-GDH不對稱轉(zhuǎn)化DKTP搖瓶體系分批補料轉(zhuǎn)化反應(yīng)

15 mL反應(yīng)體系：初始底物5 g/L，無水葡萄糖10 g/L，0.1 mmol/L NADP+，三乙醇胺磷酸緩沖(0.1 mol/L，pH 8.4)，7 U融合酶CR2-GDH粗酶液，在45 ℃、150 r/min條件下反應(yīng)。每隔2 h補加5 g/L底物和10 g/L無水葡萄糖，補加5次，底物累積至30 g/L。反應(yīng)24 h，每隔2 h取樣進行產(chǎn)物HPLC光學(xué)純度測定、定量分析以及底物GC-FID定量分析。

1.3.7 CR2-GDH不對稱轉(zhuǎn)化DKTP反應(yīng)器連續(xù)過程調(diào)控反應(yīng)

100 mL反應(yīng)體系：底物30 g/L，無水葡萄糖60 g/L，0.1 mmol/L NADP+，三乙醇胺磷酸緩沖(0.1 mol/L，pH 8.4)，47 U融合酶CR2-GDH粗酶液，在150 r/min、45 ℃條件下維持反應(yīng)過程pH恒定在8.4左右，反應(yīng)12 h，每隔2 h取樣進行產(chǎn)物HPLC光學(xué)純度檢測及定量分析。

分批補料方式：初始底物5 g/L，無水葡萄糖10 g/L，每2 h補加5 g/L底物和10 g/L葡萄糖，補加7次，底物累積至40 g/L。反應(yīng)48 h，每隔2 h取樣進行產(chǎn)物HPLC光學(xué)純度測定及定量分析和底物GC-FID定量分析。

1.3.8 底物DKTP定量分析

將底物DKTP標準品進行GC-FID(氫火焰離子化檢測器)分析，確定底物的保留時間，并制作DKTP標準曲線來定量分析底物變化。將反應(yīng)液12 000 r/min離心30 min，取上清液過0.22 μm水系濾膜過濾，進行氣相色譜定量分析。

檢測條件：色譜柱為Econo Cap-Wax (30 m×250 μm×0.25 μm)，進樣口溫度230 ℃，檢測器溫度220 ℃，載氣N2流速45 mL/min，H2流速40 mL/min，空氣流速450 mL/min，進樣量0.5 μL，分流比5∶ 1。程序升溫為90 ℃保持0.5 min，50 ℃/min升溫到200 ℃，保持4 min。底物DKTP保留時間為2.77 min。

1.3.9 產(chǎn)物(S)-DHTP光學(xué)純度和產(chǎn)率分析

將產(chǎn)物(R,S)-DHTP、(S)-DHTP標準品進行HPLC分析光學(xué)純度，確定不同構(gòu)型手性醇產(chǎn)物的保留時間，并制作(S)-DHTP標準曲線來定量分析產(chǎn)物產(chǎn)率。為保證反應(yīng)輔酶再生系統(tǒng)的有效進行，同時保證反應(yīng)體系有效傳質(zhì)，本研究采用粗酶催化不對稱轉(zhuǎn)化反應(yīng)。取反應(yīng)液加兩倍體積乙酸乙酯渦旋振蕩5 min，離心去除反應(yīng)液殘余固形物，取上層有機相用0.22 μm有機系濾膜過濾后，樣品密封避光低溫保存，用上述方法進行高效液相色譜檢測，根據(jù)兩種構(gòu)型的產(chǎn)物出峰面積計算產(chǎn)物光學(xué)純度，產(chǎn)物產(chǎn)率根據(jù)產(chǎn)物(S)-DHTP和底物DKTP對應(yīng)標準曲線算出的摩爾濃度進行計算。

檢測條件：色譜柱為Chiralcel OD-H柱(250 mm×4.6 mm)，流動相為V(正己烷)∶V(異丙醇)∶V(二乙胺)=98∶ 2∶ 0.2，流速為1 mL/min，檢測波長為241 nm。(R)-DHTP的保留時間為11.593 min，(S)-DHTP保留時間為13.342 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 融合酶CR2-GDH不對稱轉(zhuǎn)化DKTP的單批次反應(yīng)體系

使用羰基還原酶(CR2)同參與輔酶原位循環(huán)的葡萄糖脫氫酶(GDH)通過柔性連接肽得到融合酶CR2-GDH，由于2個酶的活性位點鄰近，有利于反應(yīng)所需輔酶的傳遞，且粗酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)在保留細胞內(nèi)原有酶系的基礎(chǔ)上，可解除細胞壁膜對反應(yīng)傳質(zhì)的限制，有利于酶促反應(yīng)進行[27]。在搖瓶體系中進行單批次反應(yīng)，優(yōu)化融合酶CR2-GDH單批次不對稱轉(zhuǎn)化DKTP的反應(yīng)體系，進一步提高底物耐受性，提高產(chǎn)物產(chǎn)率。

2.1.1 反應(yīng)過程pH對融合酶CR2-GDH不對稱轉(zhuǎn)化DKTP的影響

李斌等[23]測定了羰基還原酶CR2在不同pH(6.0～9.0)環(huán)境中的最適pH及其酸堿耐受性，結(jié)果表明CR2在pH 8.4 (0.1 mol/L TEA)時CR2催化DKTP的活性最高，在pH 7.5～8.5范圍內(nèi)CR2可以保持90%以上活性。此外，陳星星[28]研究發(fā)現(xiàn)，在中性pH環(huán)境中葡萄糖脫氫酶(GDH)穩(wěn)定性最強，而且pH 7.0時催化葡萄糖活性最高。

為解決因葡萄糖參與輔酶再生循環(huán)、融合酶CR2-GDH催化的反應(yīng)產(chǎn)酸問題，每2 h調(diào)控pH，研究反應(yīng)過程中最佳pH，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知:轉(zhuǎn)化反應(yīng)在偏堿性(pH 8.1～9.0)條件下催化效率更佳，特別是pH為8.4時產(chǎn)物產(chǎn)率最高，產(chǎn)物(S)-DHTP光學(xué)純度高于99.9%，且在此環(huán)境下可以穩(wěn)定存在。因此，最終選擇pH 8.4作為最佳反應(yīng)pH。

圖2 pH對CR2-GDH不對稱合成(S)-DHTP的影響Fig.2 Effects of pH on CR2-GDH catalyzing asymmetric synthesis of (S)-DHTP

2.1.2 輔底物與底物比例對融合酶CR2-GDH不對稱轉(zhuǎn)化DKTP的影響

輔酶循環(huán)再生是生物不對稱還原中的關(guān)鍵問題之一。理論上需提供至少同底物DKTP等量的輔助底物葡萄糖以驅(qū)動融合酶CR2-GDH生物合成反應(yīng)進行，在反應(yīng)體系中加入過量的葡萄糖，促進CR2-GDH不對稱轉(zhuǎn)化DKTP時的輔酶再生循環(huán)系統(tǒng)有效運轉(zhuǎn)。因此，考察輔底物與底物比例對融合酶CR2-GDH不對稱轉(zhuǎn)化DKTP的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 m(葡萄糖)/m(DKTP)對CR2-GDH不對稱 合成(S)-DHTP的影響Fig.3 Effects of m(glucose)/m(DKTP) on CR2-GDH catalyzing asymmetric synthesis of (S)-DHTP

由圖3可知：在反應(yīng)體系中m(葡萄糖)/m(DKTP)<2.0時，產(chǎn)物產(chǎn)率隨著葡萄糖濃度增加而升高；當(dāng)m(葡萄糖)/m(DKTP)≥2.0時，葡萄糖濃度增加對產(chǎn)率影響逐漸減弱，產(chǎn)物產(chǎn)率達到80%以上，且光學(xué)純度高于99.9%。

2.1.3 反應(yīng)轉(zhuǎn)速對融合酶CR2-GDH不對稱轉(zhuǎn)化DKTP的影響

反應(yīng)旋轉(zhuǎn)速度影響反應(yīng)體系中底產(chǎn)物的擴散和分配，進而影響產(chǎn)物產(chǎn)率。因此，考察在不同轉(zhuǎn)速(50～300 r/min)條件下對融合酶CR2-GDH對不對稱轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 轉(zhuǎn)速對CR2-GDH不對稱合成(S)-DHTP的影響Fig.4 Effects of rotation speed on CR2-GDH catalyzing asymmetric synthesis of (S)-DHTP

由圖4可發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)速低于150 r/min時，隨著旋轉(zhuǎn)速度的增加，產(chǎn)物產(chǎn)率明顯增加，表明傳質(zhì)是限速因素；轉(zhuǎn)速高于150 r/min時，隨著反應(yīng)進行可觀察到反應(yīng)液中有絮狀固形物，嚴重影響反應(yīng)體系的傳質(zhì)作用，不利于催化反應(yīng)的進行。因此，確定最佳轉(zhuǎn)速為150 r/min，光學(xué)純度保持99.9%以上。

2.1.4 反應(yīng)溫度對融合酶CR2-GDH不對稱轉(zhuǎn)化DKTP的影響

反應(yīng)溫度對轉(zhuǎn)化反應(yīng)的速率和酶的活性有顯著影響。在前期研究中，李斌等[23]測定了不同溫度(20～80 ℃)下羰基還原酶CR2的相對酶活，溫度低于45 ℃時，CR2可以保持80%以上的活性，溫度繼續(xù)上升導(dǎo)致酶活損失，高于55 ℃時CR2完全失活。陳星星[28]研究發(fā)現(xiàn)GDH在溫度25～42 ℃范圍內(nèi)，酶活呈線性趨勢下降，溫度高于42 ℃時酶活力迅速下降。因此，考察不同反應(yīng)溫度(20～55 ℃)對不對稱轉(zhuǎn)化DKTP的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 溫度對CR2-GDH不對稱合成(S)-DHTP的影響Fig.5 Effects of temperature on CR2-GDH catalyzing asymmetric synthesis of (S)-DHTP

由圖5可知：反應(yīng)溫度從25 ℃上升至45 ℃，產(chǎn)物產(chǎn)率隨之上升至97.71%；當(dāng)溫度高于45 ℃時，產(chǎn)率急劇下降，結(jié)合對融合酶CR2-GDH的溫度穩(wěn)定性探究，在50 ℃融合蛋白失去活性，分析得出在過高的溫度下，部分酶失活嚴重，影響反應(yīng)催化效率。因此，融合酶CR2-GDH不對稱轉(zhuǎn)化DKTP的最適反應(yīng)溫度確定為45 ℃。

2.2 底物用量對融合酶CR2-GDH不對稱轉(zhuǎn)化DKTP的影響

生物催化反應(yīng)通常存在底物抑制的問題，為了實現(xiàn)更高底物濃度下的高效反應(yīng)，首先考察在不同底物用量 (10～40 g/L)下的反應(yīng)進程，以確定融合酶CR2-GDH的底物耐受性，結(jié)果如圖6所示。

圖6 底物濃度對CR2-GDH不對稱合成 (S)-DHTP的影響Fig.6 Effects of substrate concentration on CR2-GDH catalyzing asymmetric synthesis of (S)-DHTP

由圖6可知：反應(yīng)速率隨著時間延長明顯減緩，反應(yīng)前期4 h反應(yīng)劇烈，12 h反應(yīng)后產(chǎn)物無明顯增加；當(dāng)?shù)孜餅?0 g/L時，反應(yīng)進行4 h，底物基本完全轉(zhuǎn)化；當(dāng)?shù)孜餅?0 g/L時，反應(yīng)進行到8 h，產(chǎn)物積累量達到最高(15.54 g/L)；當(dāng)?shù)孜镉昧看笥?0 g/L時，前期反應(yīng)速率明顯降低且產(chǎn)物積累量極少(底物為30 g/L時產(chǎn)物產(chǎn)率僅達到21.5%)，存在明顯底物抑制現(xiàn)象，影響反應(yīng)催化效率。

2.3 融合酶CR2-GDH不對稱轉(zhuǎn)化DKTP的搖瓶分批補料轉(zhuǎn)化

當(dāng)反應(yīng)體系中底物濃度超過某一特定值時，生物催化的酶促反應(yīng)普遍受到底物對酶的毒害和抑制作用[29]。通過底物分批補給，可以有效減緩高底物濃度對酶促反應(yīng)的不利影響?？疾烊诤厦窩R2-GDH不對稱轉(zhuǎn)化DKTP的搖瓶分批補料轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 CR2-GDH不對稱合成(S)-DHTP的分批補料反應(yīng)Fig.7 Fed-batch reaction process on CR2-GDH catalyzing asymmetric synthesis of (S)-DHTP

由圖7可知：初始底物為5 g/L，每隔2 h 補加5 g/L 底物、10 g/L無水葡萄糖，最終底物累積至30 g/L，24 h后終止反應(yīng)；在30 g/L底物條件下采取分批補料策略，最終產(chǎn)物產(chǎn)率可達到92.96%，產(chǎn)物最終達到27.65 g/L，時空產(chǎn)率為2.30 g/(L·h)；與相同底物濃度下的單批次反應(yīng)(產(chǎn)物產(chǎn)率為20.9%，產(chǎn)物最終產(chǎn)量5.2 g/L)相比,產(chǎn)率提高了72.06%。

2.4 融合酶CR2-GDH不對稱轉(zhuǎn)化DKTP的反應(yīng)器體系連續(xù)調(diào)控

酶催化過程中有很多因素會影響到轉(zhuǎn)化結(jié)果，反應(yīng)器能夠?qū)崿F(xiàn)精確連續(xù)的過程調(diào)控，有利于進一步提高轉(zhuǎn)化效率，將反應(yīng)體系放大至100 mL，考察單批次不對稱轉(zhuǎn)化反應(yīng)的催化效率，結(jié)果見圖8。

圖8 反應(yīng)器放大體系CR2-GDH不對稱合成 (S)-DHTP分批補料反應(yīng)進程Fig.8 Fed-batch reaction process on CR2-GDH catalyzing asymmetric synthesis of (S)-DHTP by reactor system

由圖8可知：當(dāng)?shù)孜餅?0 g/L時，產(chǎn)物產(chǎn)率達到82.42%，時空產(chǎn)率為3.41 g/(L·h)；底物為40 g/L時,最終產(chǎn)物產(chǎn)率僅60.61%，生成產(chǎn)物光學(xué)純度(e.e.)均大于99.9%。

為了更進一步提高底物濃度下的產(chǎn)物產(chǎn)率，采取分批補料的方式，每隔2 h 補加5 g/L 底物、10 g/L 葡萄糖，最終底物累積至40 g/L，經(jīng)48 h反應(yīng)，產(chǎn)物積累至34.02 g/L,產(chǎn)物產(chǎn)率達到85.05%，時空產(chǎn)率為1.69 g/(L·h)，光學(xué)純度≥99.9%。對比前期研究中孫太強等[22]實現(xiàn)了10 mL反應(yīng)體系下催化10 g/L底物DKTP，產(chǎn)物產(chǎn)率為62%，時空產(chǎn)率為1.3 g/(L·h)，本研究實現(xiàn)了更高底物濃度和更大反應(yīng)體系的不對稱轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

3 結(jié)論

利用具有高選擇性的羰基還原酶(CR2)和葡萄糖脫氫酶(GDH)融合后的重組酶CR2-GDH作為生物催化劑，以潛手性化合物DKTP為底物，不對稱合成抗抑郁藥物度洛西汀重要前體(S)-DHTP。

1)單批次不對稱轉(zhuǎn)化確定反應(yīng)pH為8.4、輔底物葡萄糖40 g/L、0.1 mmol/L NADP+，在45 ℃、150 r/min條件下反應(yīng)12 h，催化底物20 g/L DKTP，產(chǎn)物產(chǎn)率可達到95.07%，光學(xué)純度(e.e.)≥99.9%。

2)采取分批補料方式，反應(yīng)12 h，在搖瓶體系中將底物提高至30 g/L，產(chǎn)物產(chǎn)率達到92.96%，最終產(chǎn)物累積至27.65 g/L。

3)利用反應(yīng)器放大反應(yīng)體系，結(jié)合精確連續(xù)過程控制和分批補料策略，實現(xiàn)底物為40 g/L的不對稱連續(xù)轉(zhuǎn)化反應(yīng)，產(chǎn)率達到85.05%，產(chǎn)物積累至34.02 g/L。