白 雪，李運(yùn)杰，孟冬冬，魏欣蕾，路福平，游 淳

(1. 天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2. 中國(guó)科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308)

含有磷?；D(zhuǎn)移酶的鹵代酸脫鹵酶(HAD)家族是酶類(lèi)中已知的最大超家族之一，包括Mg2+依賴的磷酸酯酶、P型ATP水解酶、磷酸酶、磷酸化葡萄糖異構(gòu)酶等[1-3]。HAD磷酸酶的三維結(jié)構(gòu)由α/β-水解酶核心結(jié)構(gòu)域和覆蓋于其上的帽子結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，核心結(jié)構(gòu)域在家族中都保持著嚴(yán)格的序列保守性和結(jié)構(gòu)保守性，帽子結(jié)構(gòu)域的N端部分具有高度可變性，在參與形成活性位點(diǎn)的空腔時(shí)，會(huì)影響底物特異性[4-7]。因此，磷酸酶具有廣泛的底物譜。

HAD磷酸酶廣泛存在于微生物中，參與維持細(xì)胞的初級(jí)代謝和次級(jí)代謝等生理調(diào)控功能。目前，有大量磷酸酶的催化活性已得到功能注釋?zhuān)纾簛?lái)自大腸桿菌(E.coli)中的3-脫氧-D-甘露糖醛酸8-磷酸磷酸酶(YrbI)[8]、海藻糖6-磷酸磷酸酶(OtsB)[9]；來(lái)自詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)的磷酸絲氨酸磷酸酶(SerB)[10]；來(lái)自嗜酸熱原體(Thermoplasmaacidophilum)的磷酸甘油酸磷酸酶[11]；來(lái)自多形擬桿菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)的無(wú)機(jī)焦磷酸酶[12]等。由于HAD磷酸酶所催化的脫磷反應(yīng)是不可逆的，這些磷酸酶常常被作為催化反應(yīng)的最后一步整合在體外多酶體系中，推動(dòng)整個(gè)體系向著生成產(chǎn)物的方向進(jìn)行,從而得到較高的產(chǎn)品得率。因此，在理論上，基于磷酸酶的體外多酶體系能夠?qū)崿F(xiàn)產(chǎn)物的高得率。例如：從大腸桿菌中獲得的果糖-1-磷酸磷酸酶(YqaB)用于生產(chǎn)D-山梨糖和D-阿洛酮糖[13]或L-果糖和L-塔格糖[14]等稀有糖；來(lái)自海棲熱袍菌(Thermotogamaritima)的嗜熱肌醇單磷酸酶(IMP)被引入體外合成體系，實(shí)現(xiàn)了20 t規(guī)模的肌醇生產(chǎn)[15]。嗜熱酶具有更高的魯棒性,整個(gè)反應(yīng)體系更穩(wěn)定,不易染菌，因此應(yīng)該選擇熱穩(wěn)定性高的酶構(gòu)建體外多酶體系。除此之外，高的反應(yīng)溫度能夠降低反應(yīng)液黏度、提高體系傳質(zhì)速度，從而提高整個(gè)反應(yīng)體系的反應(yīng)速度。鑒于多數(shù)磷酸酶具有底物多樣性，尋找底物特異性高的磷酸酶，挖掘嗜熱菌來(lái)源的耐熱磷酸酶，將其用于生物制造平臺(tái)，具有重要的研究意義。

本研究中，筆者從最適生長(zhǎng)溫度為55 ℃的解纖維素?zé)崴峋?Acidothermuscellulolyticus)基因組中，通過(guò)基因組數(shù)據(jù)挖掘的方法檢索到一個(gè)HAD超家族的磷酸酶基因，并將其命名為AcPase,將該磷酸酶基因在E.coliRosetta (DE3)中進(jìn)行異源表達(dá)，并對(duì)其底物特異性等酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征;隨后，將其整合入體外多酶體系中并對(duì)該體系降解纖維素生產(chǎn)葡萄糖的功能進(jìn)行研究，以期為纖維素降解提供一條不依賴于纖維素酶的分解路線。

1 材料與方法

1.1 材料菌株與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

菌株EscherichiacoliRosetta (DE3)保藏于中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所體外合成生物學(xué)中心。所用的磷酸酶基因AcPase由安徽通用生物系統(tǒng)有限公司合成并克隆至載體pET20b(+)。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

氨芐霉素和氯霉素，生工生物工程(上海)有限公司；Sepharose His TrapHP，美國(guó)Bio-Rad公司；MOPS和Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒，Sigma公司；葡萄糖氧化酶法測(cè)定試劑盒，北京普利萊基因技術(shù)有限公司。其他試劑均為市售國(guó)產(chǎn)分析純。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,NaCl 10 g/L；pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 重組菌E.coliRosetta (DE3)/pET20b(+)-AcPase的構(gòu)建

根據(jù)蛋白的功能預(yù)測(cè)，從NCBI上查獲GenBank序列號(hào)為ABK51875.1的磷酸酶基因序列?；蛴砂不胀ㄓ蒙锵到y(tǒng)有限公司按照E.coli密碼子的偏好性進(jìn)行基因序列優(yōu)化并合成，亞克隆于pET20b(+)載體中，選擇酶切位點(diǎn)為NdeⅠ/XhoⅠ，C端帶有6×His Tag標(biāo)簽，獲得質(zhì)粒pET20b(+)-AcPase。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliRosetta(DE3)感受態(tài)中，選取氨芐青霉素和氯霉素雙抗性平板上的陽(yáng)性菌落。

1.2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取重組菌單菌落，接種于含100 mg/L氨芐青霉素和33 mg/L氯霉素的LB培養(yǎng)基中，在37 ℃、250 r/min條件下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。以體積分?jǐn)?shù)1%的接種量轉(zhuǎn)接于裝有200 mL含100 mg/L氨芐青霉素和33 mg/L氯霉素的LB培養(yǎng)基中(1 L三角瓶)，于37 ℃、250 r/min搖床中培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6～0.8時(shí)，降低培養(yǎng)溫度至16 ℃，加入終濃度為0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，16 ℃、250 r/min誘導(dǎo)16～20 h表達(dá)蛋白。發(fā)酵結(jié)束后離心收集菌體，用0.9% NaCl溶液洗滌菌體2次，再用含有50 mmol/L NaCl的50 mmol/L 3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)緩沖液(pH 7.0)重懸菌體。在冰上超聲破碎，菌體破碎液于4 ℃離心機(jī)中12 000 r/min離心10 min，得到重組酶的粗酶液。

1.2.3 重組蛋白的純化

采用鎳柱親和層析法純化附有組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白，步驟如下:His Trap HP樹(shù)脂柱用結(jié)合緩沖液A(50 mmol/L MOPS、50 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑，pH 7.0)平衡；粗酶液流經(jīng)樹(shù)脂柱后，利用緩沖液A洗去雜蛋白；用洗脫緩沖液B(50 mmol/L MOPS、50 mmol/L NaCl、500 mmol/L 咪唑，pH 7.0)梯度洗脫目的蛋白。收集含有目的蛋白的流出液，經(jīng)超濾離心管(104)濃縮并去除咪唑。通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白的分子量和純度。采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。

1.2.4 磷酸酶活力測(cè)定及酶的底物譜測(cè)定

在0.3 mL反應(yīng)體系中，將60 μg的AcPase與含5 mmol/L MgCl2的0.1 mol/L MOPS緩沖液(pH 6.0)混合，50 ℃預(yù)熱2 min，分別加入同樣預(yù)熱的終濃度10 mmol/L的D-葡萄糖-1-磷酸(G1P)、D-葡萄糖-6-磷酸(G6P)、果糖-6-磷酸(F6P)、果糖-1,6-二磷酸(FDP)、D-葡糖胺-6-磷酸(GlcN6P)、D-塔格糖-6-磷酸(T6P)、D-阿洛酮糖-6-磷酸(P6P)、D-甘露糖-6-磷酸(M6P)和1 mmol/L的對(duì)硝基苯磷酸二鈉(pNPP)進(jìn)行反應(yīng)，冰浴終止反應(yīng)。

采用無(wú)機(jī)磷酸測(cè)定法[16]檢測(cè)生成的磷酸含量。酶活定義：在一定的條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化產(chǎn)生1 μmol磷酸所需的酶量為一個(gè)酶活單位U。

以pNPP為底物時(shí)，添加終濃度0.75 mol/L的硼酸鈉終止反應(yīng)，產(chǎn)生的產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚(pNP)通過(guò)405 nm下的吸光度進(jìn)行測(cè)定。酶活定義:在一定的條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化產(chǎn)生1 μmol pNP所需的酶量為一個(gè)酶活單位U。

1.3 重組酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

1.3.1 重組酶的最適反應(yīng)溫度及其穩(wěn)定性

將重組酶與含10 mmol/L G6P、5 mmol/L MgCl2的0.1 mol/L MOPS緩沖液(pH 6.0)混合，分別置于不同溫度(30、40、45、50、55、60、65、70、75、80和90 ℃)下反應(yīng)10 min，測(cè)定酶活，確定最適反應(yīng)溫度。將3 g/L純化后的酶分別放置在45、55和65 ℃條件下，熱處理不同時(shí)間，取出熱處理后的酶液，在50 ℃下測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)的剩余酶活力，與初始酶活進(jìn)行比較,考察酶在不同溫度下的穩(wěn)定性。

1.3.2 重組酶的最適pH

將重組酶分別與濃度均為0.1 mol/L的甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH 4.0、4.5和5.0)、乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 5.0、5.5和6.0)、MOPS緩沖液(pH 6.0、6.5和7.0)和HEPES緩沖液(pH 7.0、7.5和8.0)混合，再加入終濃度10 mmol/L G6P和5 mmol/L MgCl2進(jìn)行反應(yīng)，在50 ℃下測(cè)定酶的最適pH。

1.3.3 不同金屬離子對(duì)重組酶活性的影響

在酶與含10 mmol/L G6P、0.1 mol/L MOPS緩沖液(pH 6.0)的混合體系中，分別加入終濃度為5 mmol/L的MgCl2、CoCl2、MnCl2、NiCl2、ZnCl2、CuCl2、CaCl2和FeCl3溶液，未加任何離子反應(yīng)體系的酶活定義為100%，測(cè)定金屬離子對(duì)重組酶活性的影響。

1.3.4 重組酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

在50 ℃下，含5 mmol/L MgCl2的0.1 mol/L MOPS緩沖液(pH 6.0)中，分別添加不同濃度的底物G1P(0.5～50 mmol/L)、G6P(0.5～20 mmol/L)和F6P(0.5～20 mmol/L)，以產(chǎn)物磷酸的變化量計(jì)算初始速率，采用GraphPad Prism 5.01軟件的Michaelis-Menten方程,經(jīng)非線性回歸計(jì)算該重組酶的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Km、Vmax和kcat)。

1.4 重組酶的應(yīng)用

質(zhì)粒pET21c-CtCDP、pET20b-CtCBP和pET20b-CtPGM分別用于表達(dá)重組蛋白纖維多糖磷酸化酶(CDP)、纖維二糖磷酸化酶(CBP)和磷酸葡萄糖變位酶(PGM)，其編碼蛋白基因cdp、cbp和pgm均來(lái)源于嗜熱纖維梭菌(Clostridiumthermocellum)。酶活測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[17]。

利用體外多酶系統(tǒng)催化纖維素完全轉(zhuǎn)化生成葡萄糖。1 mL反應(yīng)體系包含經(jīng)酸水解方法[17]預(yù)處理的5 g/L纖維多糖(25 mmol/L葡萄糖)，5 mmol/L MgCl2、10 mmol/L K2HPO4-KH2PO4、1 U CDP、1 U CBP、1 U PGM、1 U AcPase(相對(duì)葡萄糖6-磷酸的比酶活)、0.1 mol/L MOPS緩沖液(pH 6.0)，50 ℃、600 r/min反應(yīng)5 h。本研究中所用纖維多糖的平均聚合度(degree of polymerization，DP)為2.9，DP值為纖維多糖中葡萄糖單元的摩爾數(shù)與還原端摩爾數(shù)的比值。采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定試劑盒來(lái)測(cè)定產(chǎn)物葡萄糖的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組酶的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

重組菌E.coliRosetta (DE3)/pET20b(+)-AcPase經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，超聲破碎后的全菌液和離心后的上清液經(jīng)SDS-PAGE電泳驗(yàn)證，如圖1所示。由圖1可知，在分子量大約3.0×104處出現(xiàn)明顯的特異性條帶，而來(lái)源于A.cellulolyticus的重組酶是由287個(gè)氨基酸組成，與預(yù)期重組酶的理論分子量(3.01×104)大小一致，說(shuō)明重組菌成功表達(dá)可溶性蛋白。上清液經(jīng)鎳柱純化后獲得了電泳純目的蛋白，可用于進(jìn)一步研究。

M—標(biāo)準(zhǔn)蛋白; T—total cell lysate; S—supernatant ofthe cell lysate; Ni-NTA—purified AcPase圖1 SDS-PAGE分析重組菌E. coli Rosetta (DE3)表達(dá)和純化的蛋白AcPaseFig.1 SDS-PAGE analysis of recombinant AcPase expressed and purified from E. coli Rosetta (DE3)

AcPase純化結(jié)果如表1所示。由表1可知:300 mL重組菌經(jīng)純化后獲得11 mg蛋白，在鎳柱純化過(guò)程中，蛋白存在一定損失，導(dǎo)致酶活性回收率為32.2%。

表1 來(lái)源于A. cellulolyticus的AcPase的純化

2.2 重組酶的底物譜

磷酸酶或磷酸單酯酶(EC 3.1.3-)具有廣泛的底物譜，可水解多種天然底物中的磷酸單酯鍵，包括小分子的核苷酸、糖和糖醇或蛋白質(zhì)。本研究中AcPase對(duì)多種磷酸鹽物質(zhì)的底物特異性如表2所示。由表2可知，重組磷酸酶對(duì)G1P、G6P、F6P、FDP、GlcN6P、T6P、P6P、M6P和pNPP均顯示磷酸酶活性。其中，在50 ℃下，AcPase對(duì)G6P的比酶活為0.685 U/mg，對(duì)G1P的比酶活為0.323 U/mg，對(duì)P6P、F6P的比酶活約為0.2 U/mg。由此可見(jiàn)，來(lái)源于A.cellulolyticus的AcPase屬于糖酸化酶并且擁有廣泛的底物譜。

表2 AcPase的磷酸酶底物特異性

2.3 重組酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 重組酶的最適溫度及其穩(wěn)定性

解纖維素?zé)崴峋?A.cellulolyticus)的最適生長(zhǎng)溫度為55 ℃，但是酶的最適催化溫度與菌的生長(zhǎng)溫度不一定一致。因此，考察重組酶的最適溫度及穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，AcPase最適催化溫度為 65 ℃。溫度從30 ℃升高到65 ℃時(shí)，該重組酶活性隨溫度逐漸升高;當(dāng)達(dá)到80 ℃時(shí)，酶活性損失達(dá)63%。重組酶(3 g/L)在45、55和65 ℃的半衰期分別為17.4、6.3和2.7 h，而且隨著溫度升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，該酶活衰減較快。由此可知，雖然重組酶的最適催化溫度為65 ℃，但在此溫度下，酶的熱穩(wěn)定性較差。

圖2 AcPase的最適溫度和溫度穩(wěn)定性Fig.2 Optimal temperature and thermostability of AcPase

2.3.2 重組酶的最適pH

在pH為4.0～8.0時(shí)測(cè)定AcPase的最適pH，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知:該重組酶在酸性環(huán)境下具有較大的催化活性，其最適pH為6.0;當(dāng)pH大于7.0時(shí)，酶活力迅速降低。同時(shí)該酶對(duì)不同緩沖液具有選擇性:在pH 6.0下，MOPS緩沖液中的酶活力是乙酸-乙酸鈉緩沖液中的1.8倍;在pH 7.0下，MOPS緩沖液中的酶活力是HEPES緩沖液的1.1倍。由此可見(jiàn)，該重組磷酸酶在pH 6.0的MOPS緩沖液中酶活最高。

圖3 pH對(duì)AcPase酶活力的影響Fig.3 Effects of pH on the specific activity of AcPase

2.3.3 不同金屬離子對(duì)重組酶活性的影響

金屬離子會(huì)對(duì)HAD家族水解酶蛋白結(jié)構(gòu)域環(huán)4(loop 4)上的羧酸殘基及環(huán)4位置在調(diào)節(jié)酶活性方面產(chǎn)生影響[18]，且多數(shù)磷酸酶需要金屬離子的激活作用，其中，Mg2+、Mn2+對(duì)酶活性的影響最為顯著。因此，考察重組磷酸酶對(duì)各種金屬離子的依賴性，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知：在5 mmol/L Mg2+的環(huán)境中，AcPase展現(xiàn)出最高酶活性，是未加任何離子反應(yīng)體系的21倍；Co2+、Mn2+、Ni2+可分別提高酶活性11、5.3和4.7倍；Zn2+對(duì)該酶活性無(wú)明顯的影響。然而，Cu2+、Fe3+和Ca2+具有抑制酶活性的作用，殘余酶活力分別保持在62%、40%和30%，其中Fe3+和Ca2+嚴(yán)重影響酶活性且會(huì)造成酶發(fā)生沉淀。

圖4 金屬離子對(duì)AcPase酶活力的影響Fig.4 Effects of metal ions on the specific activity of AcPase

2.3.4 重組酶的動(dòng)力學(xué)分析

針對(duì)酶活性較高的3種磷酸糖進(jìn)行動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定，結(jié)果如表3所示。由表3可知，該重組酶以G6P、G1P和F6P為底物時(shí)的米氏常數(shù)(Km)分別為8.9、17.57和7.47 mmol/L。因此，相對(duì)于G1P，AcPase對(duì)G6P和F6P展現(xiàn)出較高的底物親和力。該重組酶對(duì)底物的轉(zhuǎn)換數(shù)(kcat)分析顯示，AcPase對(duì)G6P的Kcat值為1.65 s-1，分別是G1P和F6P的1.96倍和2.95倍。盡管AcPase對(duì)G6P的底物親和力稍低于F6P，但是該酶對(duì)G6P的高轉(zhuǎn)換常數(shù)導(dǎo)致AcPase對(duì)G6P具有最高的催化效率(kcat/Km)。AcPase對(duì)G6P的底物催化能力分別是對(duì)F6P和G1P的2.5和4倍，這與該酶的比酶活測(cè)定結(jié)果相一致。因此，AcPase是一個(gè)廣泛底物特異性的磷酸酶，同時(shí)表現(xiàn)出良好的葡萄糖-6-磷酸酶活性。

表3 AcPase的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.4 重組酶的應(yīng)用

纖維素是地球上最豐富的可再生資源，被認(rèn)為是生產(chǎn)生物燃料和生物基化學(xué)品的重要原料。目前，纖維素的利用研究通常通過(guò)多酶(內(nèi)切纖維素酶、外切纖維素酶、纖維二糖水解酶)協(xié)同水解生成葡萄糖，進(jìn)而經(jīng)微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物基化學(xué)品[19]。然而，外切纖維素酶和纖維二糖水解酶通常會(huì)受到產(chǎn)物的嚴(yán)重抑制，因此，傳統(tǒng)的纖維素水解方法很難將纖維素完全轉(zhuǎn)化為葡萄糖。根據(jù)對(duì)AcPase的酶學(xué)性質(zhì)分析，該酶可被引入體外多酶系統(tǒng)，通過(guò)底物磷酸化、中間產(chǎn)物異構(gòu)化、脫磷酸反應(yīng)，從而避開(kāi)產(chǎn)物抑制。

因此，筆者構(gòu)建了從經(jīng)預(yù)處理后的纖維素轉(zhuǎn)化葡萄糖的體外多酶催化系統(tǒng)，如圖5所示，該途徑包括4個(gè)酶催化的連續(xù)反應(yīng)步驟：①在磷的存在下，多糖磷酸化酶(CDP)使纖維多糖磷酸化，生成纖維二糖和葡萄糖-1-磷酸；②在磷的存在下，纖維二糖磷酸化酶(CBP)磷解纖維二糖，生成葡萄糖(Glc)和葡萄糖-1-磷酸；③在磷酸葡萄糖變位酶(PGM)催化下，葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸；④通過(guò)磷酸酶(AcPase)將葡萄糖-6-磷酸去磷酸化為葡萄糖，生成的磷供應(yīng)反應(yīng)①②，從而使得整個(gè)系統(tǒng)磷平衡。

圖5 纖維多糖轉(zhuǎn)化葡萄糖的途徑Fig.5 Scheme of pathway for the conversion of cellodextrins to glucose

在纖維素生物轉(zhuǎn)化葡萄糖反應(yīng)中，選用的CDP、CBP、PGM和AcPase，在50 ℃、0.1 mol/L MOPS緩沖液(pH 6.0)條件下，測(cè)定的比酶活分別為0.66、30、50和0.68 U/mg。

利用AcPase轉(zhuǎn)化5 g/L纖維多糖進(jìn)行葡萄糖的生物合成，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知：反應(yīng)的前1 h，產(chǎn)物的生成速率最快，但隨著底物的消耗，產(chǎn)率的增長(zhǎng)逐漸變緩慢；反應(yīng)5 h后，預(yù)處理的5 g/L纖維多糖(DP=2.9，25 mmol/L葡萄糖)成功轉(zhuǎn)化為24.4 mmol/L葡萄糖，產(chǎn)率達(dá)到97.6%。因此，該熱穩(wěn)定性的AcPase實(shí)現(xiàn)了纖維素到葡萄糖的完全轉(zhuǎn)化，為將來(lái)工業(yè)上纖維素的利用提供了堅(jiān)實(shí)的研究基礎(chǔ)。

圖6 使用5 g/L纖維多糖進(jìn)行葡萄糖的生物合成Fig.6 Biosynthesis of glucose from 5 g/L cellodextrins

3 結(jié)論

以解纖維素?zé)崴峋?Acidothermuscellulolyticus)基因組中HAD超家族的磷酸酶基因?yàn)榛A(chǔ)，通過(guò)E.coli密碼子偏愛(ài)性優(yōu)化后得到新的磷酸酶基因AcPase，并成功在E.coliRosetta (DE3)中進(jìn)行異源表達(dá)，經(jīng)過(guò)His Trap HP樹(shù)脂柱純化獲得純酶。AcPase屬于Mg2+依賴型的HAD磷酸酶并具有廣泛的底物譜。經(jīng)酶學(xué)性質(zhì)分析，以D-葡萄糖-6-磷酸為底物時(shí)，在45～65 ℃、pH 6.0～7.0的MOPS緩沖液中表現(xiàn)出相對(duì)高的酶活力和熱穩(wěn)定性。在“一鍋法”將纖維素生物轉(zhuǎn)化為葡萄糖的研究中，實(shí)現(xiàn)葡萄糖產(chǎn)率達(dá)到97.6%，與傳統(tǒng)纖維素利用纖維素酶進(jìn)行水解方式相比，該研究為纖維素完全轉(zhuǎn)化提供了新的研究思路。