張坤成,戴 杰,范文博,劉秋元,郅若宇,李 霜

(1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800；2.南京工業(yè)大學(xué) 2011學(xué)院,江蘇 南京 211800)

黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)，革蘭氏陰性，具周生鞭毛，因其能夠產(chǎn)鮮紅色的靈菌紅素,又被稱為靈桿菌。早在20世紀(jì)60年代，Wasserman等[1-2]在研究靈菌紅素分子結(jié)構(gòu)時(shí)，從靈菌紅素母液中發(fā)現(xiàn)了一種新的環(huán)狀內(nèi)酯天然產(chǎn)物，命名為serratamolide。直到20世紀(jì)80年代，日本學(xué)者M(jìn)atsuyama等[3]對(duì)S.marcescens所產(chǎn)的具有潤(rùn)濕活性(wetting activity)的胞外產(chǎn)物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，證明其中一種功能產(chǎn)物就是serratamolid；此后，Matsuyama將黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)和深紅沙雷氏菌(Serratiarubidaea)合成的潤(rùn)濕活性物質(zhì)分別命名為serrawettins[4]和rubiwettins[5]。近年來(lái)，國(guó)際上有關(guān)serrawettins的研究報(bào)道越來(lái)越多。

Serrawettins是一種脂肽類生物表面活性劑，具有典型的兩親性分子結(jié)構(gòu)——親水端由氨基酸或肽構(gòu)成，親油端由β-羥基脂肪酸構(gòu)成。根據(jù)薄層層析(TLC)的結(jié)果差異性， serrawettins可分為serrawettin W1、serrawettin W2和serrawettin W3；又因脂肪酸鏈長(zhǎng)或氨基酸殘基的差異，serrawettins存在多種同系物組分(congeners)或異構(gòu)體。Serrawettins不僅具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗線蟲(chóng)及抗腫瘤等生物學(xué)功效，還具有乳化活性、表面活性以及潤(rùn)濕活性等，在醫(yī)藥領(lǐng)域和石油工業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景[6]。

本文中，筆者對(duì)沙雷氏菌屬所產(chǎn)的生物表面活性劑進(jìn)行了歸納總結(jié)，重點(diǎn)對(duì)serrawettins的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、合成機(jī)制、表征方法以及應(yīng)用潛力等進(jìn)行綜述，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)serrawettins提供參考。

1 Serrawettins：S. marcescens 典型形態(tài)特征的物質(zhì)基礎(chǔ)

眾所周知，S.marcescens的菌落形態(tài)和溫度息息相關(guān)：在37 ℃培養(yǎng)時(shí)，S.marcescens會(huì)呈現(xiàn)規(guī)整的圓形淡黃色菌落；在30 ℃培養(yǎng)時(shí)，菌落會(huì)變成紅色，且菌落形態(tài)會(huì)擴(kuò)散成樹(shù)突狀不規(guī)則形態(tài)(圖1)。這一顯著的菌落形態(tài)變化與兩種重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物有關(guān)：在30 ℃生長(zhǎng)時(shí)，S.marcescens會(huì)產(chǎn)生靈菌紅素和serrawettins；而在37 ℃生長(zhǎng)時(shí)，則不能合成serrawettins。靈菌紅素使菌落變紅，而serrawettins使其呈現(xiàn)不規(guī)則的擴(kuò)散生長(zhǎng)(spreading growth)。Matsuyama 等[6]為進(jìn)一步證明serrawettins對(duì)菌落形態(tài)的影響，分別構(gòu)建了serrawettins缺陷型和鞭毛缺陷型的S.marcescens突變菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)serrawettins缺陷型的菌株失去了形成擴(kuò)散型菌落形態(tài)的能力(圖2)。在serrawettins的各種組分中，serrawettin W1通常與靈菌紅素伴生；serrawettin W2和serrawettin W3通常與靈菌紅素?zé)o關(guān)[6]。但是也有例外，Su等[7]分離獲得一株S.surfactantfacienssp.nov.YD25T，可以同時(shí)合成靈菌紅素和serrawettin W2。

S.marcescens NS 38在硬瓊脂平板上培養(yǎng)20 d的形貌圖1 黏質(zhì)沙雷氏菌的擴(kuò)散型菌落形態(tài)[6]Fig.1 Expanded colony morphology of Serratia marcescens[6]

1—S.marcescens NS 38野生型菌株；2—S.marcescens NS 38 serrawettin缺陷型菌株；3—S.marcescens NS 38鞭毛缺陷型菌株圖2 黏質(zhì)沙雷氏菌不同菌株的菌落形態(tài)[6]Fig.2 Colony morphology of different Serratia marcescens strains[6]

2 沙雷氏菌屬合成的生物表面活性劑及其結(jié)構(gòu)特征

沙雷氏菌屬細(xì)菌所產(chǎn)的生物表面活性劑可分為脂肽類和糖脂類這兩大類。脂肽類包括serrawettins(W1、W2和W3)和stephensiolides(A～K)[8-9]，糖脂類主要包括rubiwettins[10](R1和RG1)、鼠李糖脂[11]以及少數(shù)的蔗糖脂[12]和arabinolipid等[13](表1)。

表1 沙雷氏菌屬細(xì)菌所產(chǎn)的生物表面活性劑

2.1 脂肽類表面活性劑

Serrawettin W1與serratamolides分子結(jié)構(gòu)一致，是最早發(fā)現(xiàn)的與S.marcescensNS 38的菌落擴(kuò)展運(yùn)動(dòng)特性相關(guān)的代謝產(chǎn)物。Serrawettin W1是由L-Ser和β-羥基脂肪酸(癸酸)通過(guò)酰胺鍵和酯鍵(內(nèi)酯)連接而成的環(huán)狀內(nèi)酯結(jié)構(gòu)(圖3(a))，分子量為514.6[15]。Serrawettin W1的脂肪酸鏈長(zhǎng)度通常是可變的，在C8與C14之間，以C10為主，其同系物的分子量為486.61～665.40[14，16]。

Serrawettin W2的產(chǎn)生菌有S.marcescens和S.surfactantfaciens，其分子結(jié)構(gòu)類似于脂肽surfactin，是由β-羥基脂肪酸(癸酸)連接五肽(D-Leu/Ile-L-Ser-L-Thr-D-Phe-L-Ile/Leu)形成的環(huán)狀脂肽[5](圖3(b))，分子量為731.93。Serrawettin W2的結(jié)構(gòu)多樣性由肽環(huán)結(jié)構(gòu)上第1、第2或第5位的氨基酸種類和脂肪酸鏈長(zhǎng)短所決定的[7-8,17]，脂肪酸鏈長(zhǎng)通常為C8或C10，分子量為703.3～759.3。

Serrawettin W3是一種新型的非離子型環(huán)狀脂肽，產(chǎn)生菌為S.marcescensNS 45，其分子結(jié)構(gòu)由十二烷酸、蘇氨酸、絲氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸組成，分子量為683。但serrawettin W3的具體結(jié)構(gòu)目前尚未被明確地解析出來(lái)，其結(jié)構(gòu)的多樣性可能是由氨基酸的種類(亮氨酸或異亮氨酸)決定的[6]。

Stephensiolides(A～K)是由Serratia代謝產(chǎn)生，最初是在史蒂芬斯氏按蚊的中腸和唾液腺中發(fā)現(xiàn)的，其結(jié)構(gòu)與serrawettin W2類似，由脂肪酸鏈和五肽(Thr-Ser-Ser-Val(Ile)-Ile(Val))構(gòu)成。由于脂肪酸鏈長(zhǎng)短、氨基酸殘基變化以及脂肪酸鏈中是否存在雙鍵等情形，造成了stephensiolides結(jié)構(gòu)的多樣性，其分子量為599～695[9]。

2.2 糖脂類表面活性劑

深紅沙雷氏菌SerratiarubidaeaATCC 27593是目前報(bào)道的唯一產(chǎn)糖脂表面活性劑rubiwettins的菌株[18]，可以生產(chǎn)rubiwettin R1和rubiwettin RG1 2種結(jié)構(gòu)產(chǎn)物。

Rubiwettin R1的分子結(jié)構(gòu)尚未完全闡明，僅對(duì)分子中的疏水結(jié)構(gòu)——β-羥基脂肪酸部分完成了鑒定，包括3-(3′-羥基十四烷氧基) 癸酸酯和3-(3′-羥基十六烷氧基) 癸酸酯2種(圖4(a))，分子中的親水結(jié)構(gòu)——碳水化合物組分(糖基單元)還不清楚[10]。

Rubiwettin RG1的結(jié)構(gòu)與鼠李糖脂結(jié)構(gòu)類似，但rubiwettin RG1的糖基單元以及脂肪酸鏈長(zhǎng)不同于鼠李糖脂[10]，由β-D-葡萄糖和3-(3′-羥基十四烷氧基)癸酸酯兩部分組成(圖4(b))，分子量為576.77。

圖4 Rubiwettin R1(a)脂肪酸鏈和rubiwettin RG1(b)結(jié)構(gòu)Fig.4 Structure of rubiwettin R1 fatty acid chain (a)and rubiwettin RG1 (b)

3 Serrawettins的理化性質(zhì)

生物表面活性劑因其具有兩親性，可以存在于油水界面，降低界面張力，使兩種不互溶的液體乳化。近年來(lái)，各種生物表面活性劑因其獨(dú)特的理化性質(zhì)而被廣泛研究，在日用品、制藥工業(yè)、食品工業(yè)以及生物修復(fù)中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[19]。

3.1 表面活性

一般來(lái)說(shuō)，生物表面活性劑如果能將水和空氣的表面張力從72 mN/m降至35 mN/m以下，將水和十六烷之間的界面張力從40 mN/m降到1 mN/m，那么就被認(rèn)為是有效的表面活性劑[20]。Serrawettins是一類高效的生物表面活性劑，可以顯著降低水的表面張力，且具有較低的臨界膠束濃度(CMC值)。Serrawettins各種結(jié)構(gòu)的CMC值、降低水的表面張力及接觸角參數(shù)如表2所示[8]。闞公[21]將純化后的serrawettin W1溶于0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的NaCl溶液中，測(cè)定其表面張力、界面張力與CMC值，結(jié)果表明serrawettin W1可將水的表面張力降至32.2 mN/m,其CMC值為32.8 mg/L。值得注意的是，當(dāng)serrawettin W1的質(zhì)量濃度為100 mg/L 時(shí)，可以將水與正庚烷的界面張力降低至6 mN/m，而質(zhì)量濃度達(dá)到500 mg/L時(shí)，則形成超低界面張力；對(duì)照組化學(xué)表面活性劑十二烷基磺酸鈉(SDS)質(zhì)量濃度為500 mg/L時(shí)，界面張力降低至12.8 mN/m，而質(zhì)量濃度達(dá)1 000 mg/L時(shí)，形成超低界面張力。這表明serrawettin W1的使用量比SDS要低得多。

表2 Serrawettins的表面活性特征參數(shù)[8]

Serrawettins所具有的表面活性給沙雷氏菌的大規(guī)模發(fā)酵帶來(lái)工程技術(shù)難題。在通氣攪拌發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵體系中的表面活性劑容易引起嚴(yán)重的泡沫，甚至使培養(yǎng)基出現(xiàn)溢液導(dǎo)致雜菌污染等現(xiàn)象[22]。Zhang等[23]在利用黏質(zhì)沙雷氏菌發(fā)酵產(chǎn)2,3-丁二醇時(shí)，就遭遇了生物表面活性劑serrawettin W1帶來(lái)的困擾，通過(guò)敲除serrawettin W1合成的關(guān)鍵基因，大幅減少了發(fā)酵泡沫，并使得2,3-丁二醇的產(chǎn)量有小幅提升。

3.2 乳化活性

由于serrawettins的分子結(jié)構(gòu)中具有疏水末端和親水末端，因此具有兩親性。這種兩親性質(zhì)會(huì)導(dǎo)致serrawettins在2種不互溶的液體間積累，減小兩相之間的斥力[24]，促進(jìn)一種液體分散到另一種液體中，從而導(dǎo)致兩相乳化[20]。乳化活性通常是篩選生物表面活性劑的方法之一，通過(guò)測(cè)量乳化層的高度，除以溶液總高度，從而確定乳化指數(shù)，根據(jù)乳化指數(shù)的大小判斷乳化活性的高低。煤油和柴油是測(cè)定乳化指數(shù)最常用的烴類[25-26]。

Serrawettins具有乳化活性，可以促進(jìn)疏水性物質(zhì)的溶解[27]。Wei等[28]獲得了一株生物表面活性劑產(chǎn)生菌S.marcescensSMΔR，其發(fā)酵上清液對(duì)煤油和柴油的乳化指數(shù)分別為72%和40%，經(jīng)鑒定，該表面活性劑為serrawettin W1，并測(cè)定了其與煤油和柴油的臨界乳化指數(shù)，結(jié)果表明煤油的最低乳化劑用量為800 mg/L，柴油的最低乳化劑用量為600 mg/L[21]。在利用疏水性碳源發(fā)酵生產(chǎn)靈菌紅素時(shí)，往往能夠觀察到油脂的乳化現(xiàn)象，但很少有研究者就這一現(xiàn)象展開(kāi)深入研究。因此，可以進(jìn)一步探究serrawettins的乳化活性對(duì)于沙雷氏菌攝取疏水性碳源的作用。

4 Serrawettins的生物合成及調(diào)控

脂肽的生物合成是由非核糖體肽合成酶(NRPS)介導(dǎo)的多步驟過(guò)程。與脂肽surfactin的合成機(jī)制類似，serrawettins同樣是由NRPS催化合成的，serrawettin W1和serrawettin W2的合成機(jī)制已經(jīng)被報(bào)道[6-7]，而serrawettin W3的合成機(jī)制還未闡明?；騭wrW和swrA分別是編碼serrawettin W1合成酶SwrW和serrawettin W2合成酶SwrA的功能基因[29]。

4.1 Serrawettin W1的生物合成

Serrawettin W1的生物合成主要涉及2個(gè)基因：swrW和pswP。由swrW編碼的serrawettin W1合成酶(SwrW)屬于NRPS家族，由1 310個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，包含4個(gè)不同的功能結(jié)構(gòu)域(圖5)，分別為縮合結(jié)構(gòu)域(C)、腺苷?；Y(jié)構(gòu)域(A)、硫醇化結(jié)構(gòu)域(T)和硫酯酶結(jié)構(gòu)域(TE)[30]?；騪swP在serrawettin W1的合成中也是必不可少的，其功能類似surfactin合成過(guò)程中的sfp基因，編碼的功能蛋白PswP(磷酸泛酰巰基轉(zhuǎn)移酶，PPTase)是PCP(T域)的激活因子，負(fù)責(zé)激活PCP[31]，只有激活后的PCP才能夠連接絲氨酸殘基。因此，基因swrW和pswP在serrawettin W1的生物合成過(guò)程中缺一不可，而關(guān)于serrawettin W1中脂肪酸鏈的生物合成途徑至今未見(jiàn)報(bào)道。

圖5 Serrawettin W1的生物合成示意[6]Fig.5 Schematic diagram of biosynthesis of serrawettin W1[6]

Serrawettin W1合成的具體過(guò)程見(jiàn)圖5。①L-Ser進(jìn)入SwrW的A域，由A域催化形成活化形式的腺嘌呤-L-Ser；②活化后的L-Ser轉(zhuǎn)移到T域，連接到肽酰-載體蛋白PCP；③此時(shí)，由C域催化3-羥基癸酸-ACP與活化的絲氨酸殘基通過(guò)酰胺鍵進(jìn)行縮合形成L-Ser-脂酰基殘基；④L-Ser-脂?；鶜埢蒀域轉(zhuǎn)移到TE域；⑤下一個(gè)L-Ser進(jìn)入A域，重復(fù)前面的步驟，這時(shí)T域上的殘基與TE域上的殘基進(jìn)行酯鍵的縮合；⑥最后整個(gè)殘基轉(zhuǎn)移到TE域，通過(guò)內(nèi)酯鍵環(huán)化形成serrawettin W1[32]。

Zhang等[23]通過(guò)敲除swrW基因構(gòu)建了serrawettin W1缺陷型菌株，從而解決了黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)2,3-丁二醇發(fā)酵過(guò)程中的泡沫問(wèn)題。Thies等[33]將S.marcescensDSM12481中的swrW基因克隆到E.coliBL21 Gold中，重組E.coli菌株成功合成了serrawettin W1。

4.2 Serrawettin W2的生物合成

Su等[7]推測(cè)serrawettin W2的脂?；Y(jié)構(gòu)由聚酮合酶PKS合成，而肽環(huán)結(jié)構(gòu)由NRPS SwrA共同催化合成。聚酮合酶PKS和NRPSswrA的編碼基因共同存在于一個(gè)有間斷序列的21 kb基因簇，2個(gè)基因的間距為9 478 bp。PKS由?；D(zhuǎn)移酶(AT)、酮合成酶(KS)和酮還原酶(KR)這3個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，負(fù)責(zé)脂肪酸鏈的合成。SwrA由5個(gè)模塊構(gòu)成，每個(gè)模塊由4個(gè)功能結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，負(fù)責(zé)催化特定的氨基酸合成五肽，其具體合成過(guò)程見(jiàn)圖6。①脂?；暮铣桑篜KS的3個(gè)結(jié)構(gòu)域分別負(fù)責(zé)脂肪酸鏈的?；D(zhuǎn)移、酮基合成和酮基還原，脂肪酸合成后以脂酰CoA的形式釋放。②肽合成的起始：第1個(gè)氨基酸D-Leu進(jìn)入SwrA第一個(gè)模塊的A域，活化形成腺嘌呤D-Leu，然后轉(zhuǎn)移到第一個(gè)模塊的T域，這時(shí)由第一個(gè)模塊的C域催化脂酰CoA與T域上的D-Lue殘基進(jìn)行縮合。③肽合成的延伸：每個(gè)模塊按順序合成相應(yīng)的氨基酸殘基，直到第5個(gè)L-Ile殘基連接到第五個(gè)模塊的T域。④內(nèi)酯鍵的合成及釋放：整個(gè)脂肽殘基轉(zhuǎn)移到TE域，由TE域催化L-Ile殘基與脂肪酸鏈的β-羥基環(huán)化，形成環(huán)狀脂肽serrawettin W2并釋放[7]。值得關(guān)注的是，serrawettin W2的合成也需要PPTase激活swrA各個(gè)模塊上的PCP功能域。Gerc等[34]在S.marcescensDb10菌株中發(fā)現(xiàn)，激活因子PswP對(duì)于serrawettin W2的合成也是必需的。

圖6 Serrawettin W2的生物合成示意[7]Fig.6 Schematic diagram of the biosynthesis of serrawettin W2[7]

4.3 Serrawettins的合成調(diào)控

眾所周知，靈菌紅素和serrawettins的合成受到溫度的影響。Matsuyama等[8]利用TLC分析了這一現(xiàn)象，后來(lái)有研究者就這一現(xiàn)象進(jìn)行了深入研究。Tanikawa等[35]利用轉(zhuǎn)座插入調(diào)控因子hexS獲得了S.marcescens274的突變株S.marcescensTan1，將二者同時(shí)在30 ℃培養(yǎng)時(shí)，突變株中靈菌紅素和serrawettin W1的出現(xiàn)時(shí)間與野生型相比均有所提前，而且產(chǎn)量較野生型菌株也有所提高；但在37 ℃培養(yǎng)時(shí)，突變株Tan1會(huì)形成淡紅色的菌落，這可能是合成了靈菌紅素和serrawettin W1。Tanikawa等[35]進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)：hexS的氨基酸序列與Erwiniacarotovora“ssp.”carotovoraLysR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子HexA具有高度的同源性；與HexA不同的是，hexS在靈菌紅素和serrawettin的合成過(guò)程中屬于負(fù)調(diào)控因子，其編碼的蛋白HexS具有靶向性，HexS能夠特異性地結(jié)合在pigA和swrW基因的上游，阻止了功能基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，以致于靈菌紅素合成酶和serrawettin W1合成酶都無(wú)法合成，因此無(wú)法合成靈菌紅素與serrawettin W1。除此之外，hexS基因?qū)τ趕errawettin W2和W3的合成以及其他幾種蛋白酶、幾丁質(zhì)酶也具有同樣的負(fù)調(diào)控作用[6]。然而hexS對(duì)于pswP并未表現(xiàn)出負(fù)調(diào)控作用，因此hexS基因并不影響pswP的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[35]。

目前關(guān)于serrawettin W2的合成調(diào)控報(bào)道最多的是群體感應(yīng)(QS)調(diào)控系統(tǒng)。Givskov等[36]在培養(yǎng)S.liquefaciens過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)達(dá)到一定細(xì)胞密度時(shí)，S.liquefaciens的鞭毛會(huì)有明顯增加，與此同時(shí)，細(xì)胞也具有高度的運(yùn)動(dòng)性，這種現(xiàn)象稱為群體感應(yīng)。QS現(xiàn)象的出現(xiàn)與信號(hào)分子AHL(N-acyl homoserine lactone) 有關(guān)。Eberl等[37]在S.l￣i￣q￣u￣e￣f￣a￣c￣i￣e￣n￣sMG1的發(fā)酵上清液中檢測(cè)到與AHL具有相同功能的BHL(N-butanoyl L-homoserine)和HHL(N-hexanoyl L-homoserine lactone),進(jìn)而發(fā)現(xiàn)了BHL和HHL的合成酶基因swrI。通過(guò)插入失活swrI獲得突變株S.liquefaciensMG44，觀察到突變株失去了群集行為(swarming behavior)，而通過(guò)外源添加BHL后，這種行為便會(huì)恢復(fù)。此后,Lindum等[38]研究發(fā)現(xiàn)，突變株S.liquefaciensMG44并不能合成生物表面活性劑serrawettin W2，而在外源添加BHL后則恢復(fù)了合成serrawettin W2的能力。這說(shuō)明serrawettin W2的合成依賴于BHL，進(jìn)一步證明了serrawettin W2的生物合成受到細(xì)胞密度的影響，與QS調(diào)控系統(tǒng)有關(guān)。除此之外，serrawettin W1同樣也受到QS系統(tǒng)的調(diào)控[39-40]。

Serrawettin W3的生物合成及調(diào)控的報(bào)道至今還未見(jiàn)報(bào)道，需要進(jìn)一步的探究以解析出來(lái)。

5 Serrawettins的提取及表征

目前還沒(méi)有比較完善的serrawettins分析純化方法，已報(bào)道的serrawettins分析表征方法僅限于TLC[8]、高效液相色譜(HPLC)[41]和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)[42]等分析手段。因此，尋找適合的serrawettins純化和表征方法是推進(jìn)其深入研究的重要步驟。

5.1 Serrawettins的提取

Serrawettins的分離純化對(duì)于其應(yīng)用非常重要，可以進(jìn)一步探究純化后serrawettins的理化性質(zhì)及生物學(xué)功能。Serrawettins的提取大多采用萃取的方法。Shanks等[43]用乙酸乙酯萃取發(fā)酵液中的serrawettin W1，并用于后續(xù)分析，但所分離的serrawettin W1純度不高，而且萃取過(guò)程中會(huì)引起乳化，給后續(xù)的分離純化帶來(lái)不便。闞公[21]對(duì)serrawettin W1的分離純化進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究，以甲醇、氯仿對(duì)發(fā)酵液中的serrawettin W1進(jìn)行提取，并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行了研究。Su等[7]先用乙醇提取發(fā)酵液中的serrawettin W2，后用乙酸乙酯進(jìn)一步萃取，再使用凝膠層析進(jìn)行純化。Lindum等[38]以等體積(含有1%甲酸)的乙酸乙酯對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行萃取，再以甲醇進(jìn)行提取，分離得到358 mg的serrawettin W2粗品。

5.2 Serrawettins的表征

起初，研究者利用TLC對(duì)serrawettins進(jìn)行分析。Matsuyama等[8]以氯仿、甲醇和5 mol/L氨水(體積比為80∶ 25∶ 4)作為展開(kāi)劑，用 50%(體積分?jǐn)?shù))H2SO4噴灑層析板，在200 ℃加熱后，可以在層析板上觀察到serrawettin W1、W2和W3以及靈菌紅素的顯色斑點(diǎn)。但是TLC的局限性在于只能定性分析，而無(wú)法定量分析serrawettins。當(dāng)前，研究者們通常采用LC-MS分析serrawettins的結(jié)構(gòu)和分子量。Thies等[33]將swrW導(dǎo)入E.coliBL21 Gold中， 并利用HPLC-ESI-MS對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，成功鑒定了發(fā)酵液中產(chǎn)物serrawettin W1的結(jié)構(gòu)。另外，Nakagawa 等[41]將serrawettin W1水解并利用HPLC對(duì)3-羥基脂肪酸進(jìn)行分析，以此得知，serrawettin W1具有不同的脂肪酸鏈長(zhǎng)度。然而，目前還沒(méi)有serrawettins W1常規(guī)定量分析方法的報(bào)道，這也使得serrawettin W1的高產(chǎn)菌株選育和發(fā)酵優(yōu)化等工作效率不高。

Serrawettin W2的結(jié)構(gòu)類似于surfactin，在紫外波長(zhǎng)215 nm處具有吸收峰[7]，雖然可以推測(cè)在有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下利用HPLC對(duì)其進(jìn)行定量表征，但至今還未見(jiàn)有利用HPLC單獨(dú)對(duì)serrawettin W2進(jìn)行定量分析的報(bào)道。Su等[7]同樣利用 HPLC-ESI-MS成功地鑒定出發(fā)酵液中serrawettin W2的結(jié)構(gòu)。目前，針對(duì)serrawettin W3的表征方法尚未見(jiàn)報(bào)道。

6 Serrawettins的應(yīng)用前景

與化學(xué)表面活性劑相比，生物表面活性劑具有許多優(yōu)勢(shì)。由于它們低毒，可生物降解，生產(chǎn)成本低，并且可耐受極端的pH、溫度和鹽度。因此，由于生物表面活性劑的化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的多樣性，其廣泛地應(yīng)用于石油、醫(yī)藥、食品及生物修復(fù)等行業(yè)[43]。Serrawettins作為生物表面活性劑，同樣具有抑菌、抗腫瘤、防污及乳化烴類化合物的特性，這使得serrawettins在生物醫(yī)藥、石油工業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景。

6.1 在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用潛力

沙雷氏菌屬所產(chǎn)的生物表面活性劑，如serrawettins、rubiwettins和stephensiolides等均具有生物學(xué)活性特征。其中，人們對(duì)serrawettins研究得相對(duì)較為深入。Serrawettins具有較強(qiáng)的抑菌作用，可以用于抗生素開(kāi)發(fā)和生物防治。Heise等[44]從Serratiamarcescens2MH3-2菌株獲得serrawettin W2粗提物，發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗菌和抑制線蟲(chóng)的活性。Dwivedi等[45]純化了serrawettin W1及同系物，之后測(cè)定了其對(duì)分枝桿菌的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)serrawettin W1及其同系物對(duì)分枝桿菌均具有抑制作用。Hage-Hülsmann等[46]進(jìn)一步研究了S.marcescensDSM 12481所產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物靈菌紅素和serrawettin W1對(duì)谷氨酸棒狀桿菌的抑菌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單一化合物相比，靈菌紅素與serrawettin W1的組合抑菌效果更好，這表明，使用生物分子組合策略開(kāi)發(fā)抑菌劑可能具有較好的應(yīng)用前景。Su等[7]考察了S.surfactantfacienssp.nov.YD25T代謝合成serrawettin W2的抑菌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)serrawettin W2為30 μg/mL時(shí)，對(duì)模式菌株Staphylococcusaureus、Pseudomonasaeruginosa和Shigelladysenteriae均具有抑制作用。Kadouri等[47]認(rèn)為，盡管沙雷氏菌屬所產(chǎn)的生物表面活性劑對(duì)多種菌株均表現(xiàn)出了抑制作用，但是serrawettin W1在抑菌的同時(shí)還具有一定的細(xì)胞毒性，因此不能作為抗生素直接使用。

Serrawettins除抑菌活性之外，還具有抗癌活性。Perez等[48]研究了serrawettin W1的抗癌活性，發(fā)現(xiàn)serrawettin W1可降低多種癌細(xì)胞(Jurkat、Molt-4、NSO、 HGT-1、HT-29和GLC-4S)的活性，具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，而對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有影響。Su等[7]發(fā)現(xiàn)serrawettin W2能夠抑制癌細(xì)胞(HeLa和Caco-2)生長(zhǎng)而表現(xiàn)出抗腫瘤的活性，其對(duì)正常細(xì)胞生長(zhǎng)并無(wú)抑制作用。由此可見(jiàn)，serrawettins具有開(kāi)發(fā)成治療白血病、淋巴癌等化療藥物的潛力。

6.2 在石油工業(yè)的應(yīng)用潛力

在石油工業(yè)中，表面活性劑應(yīng)用得非常廣泛。與化學(xué)表面活性劑相比，生物表面活性劑具有低毒、可生物降解、對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn)，因而得到了人們的青睞[49]。

Serratia屬細(xì)菌作為一類常見(jiàn)的石油烴降解菌而被廣泛報(bào)道。Serrawettins具有良好的表面活性和乳化石油烴效果，可以應(yīng)用于微生物采油(MEOR)和生物修復(fù)。Ibrahim等[50]分離獲得了一株S.marcescens，此菌可產(chǎn)脂肽類表面活性劑，該表面活性劑具有提高石油采收率的作用，原油的采收率達(dá)76%，可作為潛在的采油劑。Arajo等[51]利用SerratiamarcescensUCP 1549 發(fā)酵生產(chǎn)脂肽類表面活性劑，并提取粗品進(jìn)行了洗油實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)該表面活性劑質(zhì)量濃度為1 g/L時(shí)，可去除94%的機(jī)油，而對(duì)照組的機(jī)油去除率僅為63%。吳濤等[52]從石油污染的土壤中分離獲得了一株Serratiasp.，該菌在7 d內(nèi)對(duì)1 g/L的原油降解率達(dá)到56.7%，且能夠高效合成生物表面活性劑；土壤修復(fù)實(shí)驗(yàn)表明，添加該菌分泌的表面活性劑可有效提高石油烴的生物可利用性，促進(jìn)石油烴污染土壤的生物修復(fù)，但是并未對(duì)該生物表面活性劑的結(jié)構(gòu)和類型進(jìn)行鑒定。

7 結(jié)論與展望

脂肽類生物表面活性劑serrawettins具有抑菌、抗癌等生物學(xué)活性以及乳化、表面活性等，具有較好的應(yīng)用前景。Serrawettin W1和serrawettin W2的合成機(jī)制和結(jié)構(gòu)都已經(jīng)獲得解析，serrawettin W3的合成機(jī)制和結(jié)構(gòu)還未闡明，需要進(jìn)一步的研究。由于serrawettins的定量分析、分離純化及結(jié)構(gòu)表征等難度較大，人們對(duì)serrawettins缺乏深刻的認(rèn)識(shí)；serrawettins的分離純化以及定量表征等研究方法亟待突破。在合成生物學(xué)方面，針對(duì)serrawettins的生物合成途徑，可以通過(guò)代謝工程的手段對(duì)合成調(diào)控的關(guān)鍵基因進(jìn)行敲除或途徑強(qiáng)化，構(gòu)建serrawettins高產(chǎn)菌株或定向改造serrawettins結(jié)構(gòu)組分，有助于提高serrawettins產(chǎn)量，促進(jìn)生物表面活性劑serrawettins進(jìn)入應(yīng)用階段。