■魏滿紅 張佳運(yùn) 陳玉林 楊雨鑫

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌712100）

幼齡動(dòng)物的消化器官未發(fā)育完全，其所分泌的蛋白酶不能將飼料中的蛋白質(zhì)完全消化，將蛋白酶添加在飼料中可以促進(jìn)幼齡動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)消化吸收，同時(shí)蛋白酶也可以促進(jìn)飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子的降解，提高動(dòng)物機(jī)體的免疫力。與瘤胃微生物相比，添加外源菌可能會(huì)與瘤胃微生物產(chǎn)生拮抗等不良反應(yīng)。從瘤胃中篩選出的產(chǎn)蛋白酶菌更易于在瘤胃中定植[1]。在飼料行業(yè)內(nèi)根據(jù)“最適作用pH 值”為標(biāo)準(zhǔn)，將蛋白酶分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶以及堿性蛋白酶[2]。堿性蛋白酶的最適作用pH 值為9～11，最先在豬的胰腺中發(fā)現(xiàn)，主要在小腸中發(fā)揮作用，堿性環(huán)境下可以把蛋白質(zhì)水解成小分子肽鏈[3]；從酶的活力pH值曲線分析可知，酸性蛋白酶的最適作用pH 值為2～4，能夠水解蛋白質(zhì)肽鍵，酸性蛋白酶的活性部位中含有一個(gè)或更多的羧基；中性蛋白酶是一種可用于蛋白質(zhì)水解的內(nèi)切酶，目前也已在飼料行業(yè)中廣泛應(yīng)用[4]。利用微生物生產(chǎn)蛋白酶具有成本低、產(chǎn)出率高、周期短、易控制等優(yōu)點(diǎn)，為當(dāng)下規(guī)?；a(chǎn)蛋白酶主要來源[5]。產(chǎn)蛋白酶微生物主要有乳酸桿菌和芽孢桿菌，但產(chǎn)酶菌種較為單一，難以滿足工業(yè)化對(duì)各類蛋白酶的生產(chǎn)需求。有研究表明，酵母菌具有高生產(chǎn)率、發(fā)酵快[6]等優(yōu)勢(shì)，但是關(guān)于酵母菌產(chǎn)蛋白酶報(bào)道較少。本試驗(yàn)對(duì)山羊瘤胃內(nèi)容物中產(chǎn)蛋白酶酵母菌進(jìn)行初步分離和鑒定，并對(duì)其酶學(xué)特性進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 樣品的來源、培養(yǎng)基、試劑

1.1.1 樣品的來源

從西北農(nóng)林科技大學(xué)畜牧站內(nèi)抽取西農(nóng)薩能奶山羊瘤胃液，立即裝入無菌管，帶回實(shí)驗(yàn)室保存在-80 ℃冰箱中。

1.1.2 培養(yǎng)基

蛋白酶培養(yǎng)基：葡萄糖50 g、蛋白胨10 g、KH2PO42 g、MgSO4·7H2O 0.4 g、用無菌水定容至1 000 mL，pH值調(diào)至7，121 ℃滅菌15 min。

植酸酶培養(yǎng)基：氯化鉀0.5 g、植酸鈉2 g、硫酸錳0.03 g、葡萄糖30 g、硫酸鎂0.5 g、硫酸亞鐵0.03 g、硝酸銨5 g，用無菌水定容至1 000 mL，pH 值調(diào)至5.5，121 ℃滅菌15 min。

纖維酶培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉10 g、蛋白胨2 g、酵母膏0.5 g、K2HPO41.5 g、Na2SO42.5 g、瓊脂20 g，用無菌水定容至1 000 mL，pH 值調(diào)至7.0，121 ℃滅菌15 min。

果膠酶培養(yǎng)基：果膠10 g、酵母提取物10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，用無菌水定容至1 000 mL，pH值調(diào)至7.0，121 ℃滅菌15 min。

YPD 培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、酵母粉5 g、蛋白胨10 g，用無菌水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌15 min。

1.1.3 試劑

羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、3，5-二硝基水楊酸、葡萄糖、植酸鈉、果膠、牛肉膏、檸檬酸三銨、乙酸鈉、蔗糖、瓊脂、酪蛋白、干酪素、酪氨酸、三氯乙酸、脫脂乳奶粉、HCl、PDA、KH2PO4、KCl、MgSO4、FeSO4、MnSO4、吐溫80、NaCl、NaOH、H2SO4、Na2CO3、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O，購(gòu)自楊凌曉白化玻儀器公司；酵母提取物、蛋白胨，購(gòu)自O(shè)XOID 公司；Folin-酚，購(gòu)自北京東方順科生物科技有限公司；2×Taq PCR Master?Mix，TIANampYeast DNA kit（離心柱型），gelRed 核染色劑，引物NL-1（5-GCATATCAATAA GCGGA GGA AAAG-3），NL-4（5-GGTCCGT GTTTCAAGACG-3）購(gòu)自北京擎科生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)蛋白酶酵母菌株的篩選

將瘤胃液10 倍梯度稀釋于滅菌水中，在搖床上振蕩培養(yǎng)30 min。取20 μL 稀釋液涂布于PDA 固體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取符合酵母菌菌落形態(tài)的菌株進(jìn)行純化。將純化得到的酵母菌株，接種在脫脂乳培養(yǎng)基中進(jìn)行初篩，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d[7]，篩選出水解圈較大的菌株進(jìn)行活化擴(kuò)繁，將菌株培養(yǎng)液以1∶1 與30%甘油混合保存于2 mL EP管中，放置-80 ℃冰箱內(nèi)進(jìn)行保存。

1.2.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

將2 mL左右的種子液加入離心管中，10 000 r/min離心2 min，棄上清液富集菌體，使用酵母菌基因組DNA 提取試劑盒提取目標(biāo)菌株基因組DNA。以基因組DNA 為模板，用酵母菌通用引物NL-1 和NL-4 對(duì)26S rDNA D1/D2 區(qū)基因片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸45 s，共35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增效果和片段大小。測(cè)序結(jié)果應(yīng)用NCBI Blast 在線比對(duì)工具對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.3 產(chǎn)蛋白酶酵母菌產(chǎn)酶條件優(yōu)化

將篩選出來的菌株從-80 ℃冰箱拿出，立即放置到冰盒中進(jìn)行冰浴融化，再接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于不同溫度、不同pH值、不同接種量濃度、100 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，采用福林法[8]測(cè)定粗酶液中蛋白酶活力。

1.3.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶影響

將初始菌液按體積分?jǐn)?shù)3%接種量，在30 ℃、pH為7、100 r/min 條件下?lián)u床培養(yǎng)，每隔12 h 取樣，5 000 r/min條件下離心10 min，取上清液測(cè)蛋白酶活力，繪制酶活統(tǒng)計(jì)圖，確定最適產(chǎn)酶時(shí)間。

1.3.2 接種量對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響

將初始菌液按體積分?jǐn)?shù)1%、2%、3%、4%、5%接種量在30 ℃、pH 值為7、100 r/min 條件下?lián)u床培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為1.3.1 得到的各菌株最佳產(chǎn)酶時(shí)間，5 000 r/min 離心10 min，取上清液測(cè)蛋白酶活力，繪制酶活統(tǒng)計(jì)圖，確定最適接種量。

1.3.3 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響

將初始菌液按1.3.2得到的各菌株最佳接種量，在溫度分別為18、25、30、37、50 ℃、pH 值為7、100 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為1.3.1 得到的各菌株最佳產(chǎn)酶時(shí)間，5 000 r/min 離心10 min，取上清液測(cè)蛋白酶活力，繪制酶活統(tǒng)計(jì)圖，確定最適培養(yǎng)溫度。

1.3.4 初始培養(yǎng)基pH值對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響

將培養(yǎng)基的初始pH 值分別調(diào)節(jié)為5、6、7、8、9、10，各菌株按1.3.2 最佳接種量及1.3.3 最佳溫度、100 r/min 條件下?lián)u床培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為1.3.1 各菌株最佳產(chǎn)酶時(shí)間，5 000 r/min 離心10 min，取上清液測(cè)蛋白酶活力，繪制酶活統(tǒng)計(jì)圖，確定最適產(chǎn)酶pH值。

1.4 產(chǎn)植酸酶、果膠酶、纖維素酶三種水解酶效果的研究

將初始菌液按體積分?jǐn)?shù)3%接種量接入產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基、產(chǎn)果膠酶培養(yǎng)基、產(chǎn)植酸酶培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)48 h 后，5 000 r/min 離心10 min，分別取上清液采用DNS 法測(cè)定纖維素酶活力、果膠酶活力、植酸酶活力，繪制酶活統(tǒng)計(jì)圖。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)蛋白酶酵母菌株的篩選結(jié)果

通過比對(duì)《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》與平板上的菌株外觀形態(tài)，結(jié)合相關(guān)試驗(yàn)分析進(jìn)行初篩，篩選出Y1、Y5、Y12、Y16、Y19、Y20、Y21、Y22、Y27、Y28、Y29、Y30等12株酵母菌。將這12株菌點(diǎn)涂到脫脂乳培養(yǎng)基上30 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，Y1、Y5、Y16、Y20、Y21五株菌均出現(xiàn)明顯的水解圈（見圖1）。

圖1 具有明顯水解圈菌落

2.2 分子生物學(xué)鑒定

將分離出的五株酵母菌基因組進(jìn)行26S rDNA區(qū)PCR 擴(kuò)增，用1%的瓊脂糖凝膠對(duì)擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)，電泳順序?yàn)? 000 bp Marker、Y1、Y5、Y16、Y20、Y21，擴(kuò)增后的結(jié)果如圖2所示。

圖2 菌株26S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

5 株菌擴(kuò)增出的片段長(zhǎng)度均在500～750 bp，條帶清晰可見，無雜帶，可用于菌株26S rDNA 測(cè)序。將PCR 產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司武漢分公司測(cè)序，利用QuickStart 軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接后通過NCBI Blast 在線比對(duì)工具對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比對(duì)。Y1為庫(kù)德畢赤酵母、Y5為東方伊薩酵母、Y16為馬克斯克魯維酵母、Y20為近平滑假絲酵母、Y21為單孢釀酒酵母。

2.3 產(chǎn)蛋白酶酵母菌產(chǎn)酶條件優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響

3%接種量在培養(yǎng)基pH 值為7、30 ℃、100 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌種產(chǎn)蛋白酶的影響如圖3所示。隨著時(shí)間的增加，培養(yǎng)液中菌株產(chǎn)蛋白酶活力也逐漸增加，在48 h 時(shí)產(chǎn)蛋白酶活力達(dá)到了最高；培養(yǎng)超過48 h 后，蛋白酶活力逐漸減少。因此篩選出的產(chǎn)蛋白酶酵母菌株的最適產(chǎn)酶時(shí)間為48 h。

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響

2.3.2 菌液接種量對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響

將初始菌液按體積分?jǐn)?shù)1%、2%、3%、4%、5%的接種量，在培養(yǎng)基pH 值為7、30 ℃、100 r/min 條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h，測(cè)定蛋白酶活力，不同接種量對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響如圖4 所示。在接種量1%時(shí)，產(chǎn)蛋白酶活力較低；隨著初始菌液接種量增加，產(chǎn)蛋白酶活力逐漸上升，其中菌株庫(kù)德畢赤酵母Y1、馬克斯克魯維酵母Y16在3%時(shí)酶活最大，東方伊薩酵母Y5、近平滑假絲酵母Y20、單孢釀酒酵母Y21在4%時(shí)酶活最大。

圖4 接種量對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響

2.3.3 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響

各菌株按2.3.2得到的最佳接種量、培養(yǎng)基pH為7、100 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h，不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響如圖5 所示。菌株庫(kù)德畢赤酵母Y1、單孢釀酒酵母Y21產(chǎn)蛋白酶的最佳溫度為30 ℃，菌株東方伊薩酵母Y5、馬克斯克魯維酵母Y16、近平滑假絲酵母Y20產(chǎn)蛋白酶的最佳溫度為37 ℃。

圖5 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響

2.3.4 初始培養(yǎng)基pH對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響

各菌株按2.3.2 得到的最佳接種量，2.3.3 得到的最培養(yǎng)溫度、100 r/min、不同培養(yǎng)基pH 值(5、6、7、8、9、10)條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h，不同培養(yǎng)基pH值對(duì)菌種產(chǎn)蛋白酶的影響如圖6 所示。隨著pH 值的升高，各培養(yǎng)液中蛋白酶的活性也逐漸升高，在pH值為9時(shí)5株菌的培養(yǎng)液中蛋白酶的活性均最高。

圖6 初始培養(yǎng)基pH對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響

2.4 產(chǎn)植酸酶、果膠酶、纖維素酶三種水解酶效果的研究

2.4.1 產(chǎn)植酸酶效果的研究

圖7 產(chǎn)植酸酶效果的研究

由圖7可知，各菌株以3%的添加量，100 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h后，庫(kù)德畢赤酵母Y1、馬克斯克魯維酵母Y16、單孢釀酒酵母Y21具有較高的植酸酶活性，酶活力分別達(dá)到14.38 U/mL、15.34 U/mL、15.63 U/mL。東方伊薩酵母Y5和近平滑假絲酵母Y20產(chǎn)生的植酸酶較少，低于1.00 U/mL。

2.4.2 產(chǎn)果膠酶效果的研究

由圖8可知，各菌株以3%的添加量，100 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h后，五株菌株均表現(xiàn)出較高的果膠酶活性。其中單孢釀酒酵母Y21 酶活力顯著高于其他菌株（P＜0.05），達(dá)到15.18 U/mL。

2.4.3 產(chǎn)纖維素酶效果的研究

圖8 產(chǎn)果膠酶效果的研究

圖9 產(chǎn)纖維素酶效果的研究

由圖9 可知，各菌株以3%的添加量，100 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h 后，五株菌株均表現(xiàn)出較高的纖維素酶活性，均超過180 U/mL，其中近平滑假絲酵母Y20 酶活力顯著高于其他菌株（P＜0.05），達(dá)到199.08 U/mL。

3 討論

3.1 發(fā)酵條件對(duì)微生物蛋白酶活力的影響

隨著工業(yè)用酶用量的不斷增加，已有的蛋白酶無法滿足日益增長(zhǎng)的需求。篩選出新的高產(chǎn)產(chǎn)酶菌株和對(duì)已有的菌株產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化以提高蛋白酶的產(chǎn)量和品質(zhì)，是兩種最主要的解決方案[9]。從土壤、污泥、海水及動(dòng)物腸道中已經(jīng)分離出可產(chǎn)生中性、堿性或耐鹽性蛋白酶的微生物菌株，同時(shí)也從不同來源的植物中篩選出了產(chǎn)蛋白酶的內(nèi)生真菌、細(xì)菌和放線菌[10]，極大地拓寬了產(chǎn)蛋白酶菌的菌株庫(kù)。菌株在液體培養(yǎng)基中發(fā)酵，其產(chǎn)酶能力也會(huì)受到培養(yǎng)基發(fā)酵條件的影響。溫度、pH 值、發(fā)酵的時(shí)間等條件會(huì)對(duì)菌株的生產(chǎn)繁殖產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致最終的蛋白酶活性不同[11]。

本研究通過點(diǎn)涂于脫脂乳平板來初篩具有降解蛋白酶的菌，喬傳麗等通過計(jì)算HE 值，比對(duì)HE 大小初步判斷產(chǎn)蛋白酶活力，但是實(shí)際上培養(yǎng)出來的菌落并不是完整的圓形，通過測(cè)量水解圈直徑、菌落直徑等數(shù)據(jù)，誤差較大，缺乏科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)性。據(jù)報(bào)道，HE值和蛋白酶活力的高低并非顯著的正相關(guān)[12]。因此結(jié)合相關(guān)實(shí)際狀況，通過肉眼觀察，找出水解圈相對(duì)而言比較明顯的五株菌，進(jìn)行后續(xù)產(chǎn)蛋白酶條件優(yōu)化的試驗(yàn)。

將篩選出的菌株以3%接種量在培養(yǎng)基pH 為7、溫度30 ℃、100 r/min條件下培養(yǎng)，12 h時(shí)菌株還未開始增殖，數(shù)量較少，產(chǎn)蛋白酶能力有限，故產(chǎn)蛋白酶活力較低；隨著時(shí)間的增加，酵母菌數(shù)量增多，培養(yǎng)液中菌株產(chǎn)蛋白酶活力也逐漸增加，在48 h時(shí)產(chǎn)蛋白酶活力達(dá)到了最高；這與Zhou等[13]的研究結(jié)果一致。但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少蛋白酶活力逐漸降低。劉靜等[14]發(fā)現(xiàn)產(chǎn)蛋白酶菌在30 h 蛋白酶活力達(dá)到最高。在接種量1%時(shí)，培養(yǎng)48 h 產(chǎn)蛋白酶活力較低，隨著初始菌液接種量增加，產(chǎn)蛋白酶活力逐漸上升，其中菌株庫(kù)德畢赤酵母Y1、東方伊薩酵母Y5、馬克斯克魯維酵母Y16在3%時(shí)酶活力最大，近平滑假絲酵母Y20、單孢釀酒酵母Y21在4%時(shí)酶活力最大。這同曹慧等[15]的研究結(jié)果一致，可能是當(dāng)接種量較大時(shí)，菌體前期生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被迅速消耗，同時(shí)產(chǎn)生大量代謝廢物，抑制中后期菌體的生長(zhǎng)。同時(shí)酵母菌在生長(zhǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生大量的乙醇，隨著乙醇含量的升高，培養(yǎng)液中pH值降低也會(huì)抑制菌株的增殖使蛋白酶的活性降低。將五株菌株加入到不同pH的培養(yǎng)液中，隨pH值的升高蛋白酶活也逐漸增加，五株菌均在pH值9的培養(yǎng)基中最高，達(dá)到200 U/mL以上，結(jié)合先前的報(bào)道可知，五株菌產(chǎn)生的均為堿性蛋白酶。在30～55 ℃蛋白酶的活性較高，篩選出的產(chǎn)蛋白酶酵母菌株庫(kù)德畢赤酵母Y1、單孢釀酒酵母Y21的最佳培養(yǎng)溫度為30 ℃，菌株東方伊薩酵母Y5、馬克斯克魯維酵母Y16、近平滑假絲酵母Y20 最佳培養(yǎng)溫度為37 ℃，溫度對(duì)產(chǎn)蛋白酶的活性也具有顯著的影響。

3.2 微生物產(chǎn)復(fù)合酶的研究

微生物由于繁殖速度快、發(fā)酵簡(jiǎn)單、易于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，目前成為蛋白酶、纖維素酶、植酸酶、果膠酶等生物酶類的重要來源。植酸鹽是谷類、豆類和油料中磷酸鹽和肌醇的主要儲(chǔ)存形式。磷以肌醇六磷酸的形式存在不能被人類、家禽或其他單胃動(dòng)物利用。為了提高膳食植酸磷的利用率，不同來源的植酸酶一直是研究的熱點(diǎn)。Li 等[16]從魚類的腸道中分離出可以分泌大量植酸酶的海洋酵母菌株，該酵母的最佳產(chǎn)酶條件為pH5.0 和28 ℃。崔明玉[17]從酵子和全麥面團(tuán)中篩選分離出具有較高植酸降解能力的一株異常威克漢遜姆酵母和一株釀酒酵母，其植酸酶活性分別為18.52 U/mL 和19.74 U/mL。本研究中篩選分離出的單孢釀酒酵母Y21植酸酶活性為15.63 U/mL，可能跟菌液的起始濃度等因素有關(guān)。

果膠酶屬于多糖家族，可以降解果膠物質(zhì)。果膠酶在工業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)領(lǐng)先地位，具有廣泛的應(yīng)用前景，如植物纖維的脫膠、榨油，果汁和葡萄酒的澄清，生物燃料的生產(chǎn)，動(dòng)物飼料的生產(chǎn)等。但像許多其他工業(yè)酶一樣，果膠酶在其經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)中也面臨著低產(chǎn)量和高生產(chǎn)率的限制[18]。據(jù)報(bào)道，果膠酶的50%來源是真菌和酵母菌，35%來源是細(xì)菌。近年來，已經(jīng)篩選分離出了許多具有果膠酶活性的微生物，如可以生產(chǎn)果膠酶的黑曲霉菌和曼赫毛菌。此外，從土壤和牛糞便中篩選出的芽孢桿菌也能高效的生產(chǎn)果膠酶[19]。Karabi 等[20]從土壤中篩選出了產(chǎn)果膠酶的細(xì)菌在37 ℃和pH 7.5 的條件下產(chǎn)生最大的果膠酶活性0.671 U/mL。本研究中果膠酶活性達(dá)到15.18 U/mL，具有較高的果膠酶活性。果膠酶的活性高低可能和菌屬有關(guān)，本試驗(yàn)篩選分離得到的菌株為酵母菌。

纖維素酶可以通過酶的協(xié)同作用將纖維素有效地水解為葡萄糖單位，將植物細(xì)胞中平常不消化以及難以消化的大分子物質(zhì)，如大分子多糖、蛋白質(zhì)和脂類等物質(zhì)分解成小分子容易被動(dòng)物吸收的物質(zhì)。這些酶被稱為內(nèi)切β-1-4-葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-D-葡萄糖苷酶[21]。有研究表明，幾乎所有酵母菌種均具有胞外纖維素酶活性，大多數(shù)酵母中纖維素酶活性在30 ℃時(shí)最高[22]。因此本研究對(duì)菌株在30 ℃產(chǎn)蛋白酶活性進(jìn)行了探討，五株菌株均表現(xiàn)出較高的纖維素酶活性，均超過180 U/mL，其中近平滑假絲酵母Y20 酶活力顯著高于其他菌株（P＜0.05），達(dá)到199.08 U/mL。

具有產(chǎn)蛋白酶、果膠酶、植酸酶、纖維素酶的菌株對(duì)菜籽粕等進(jìn)行發(fā)酵，不僅能夠?yàn)閯?dòng)物提供所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也是含有多種酶的復(fù)合酶制劑。復(fù)合的酶制劑具有互補(bǔ)作用，在多種酶的共同作用下，飼料中的一些抗?fàn)I養(yǎng)因子會(huì)被破壞，可顯著促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，提高機(jī)體免疫力。據(jù)報(bào)道，將復(fù)合酶添加到不同動(dòng)物的基礎(chǔ)日糧中，動(dòng)物生產(chǎn)性能均顯著提高[23]。本文研究了從山羊瘤胃液中篩選出產(chǎn)蛋白酶的酵母菌并分析了影響產(chǎn)酶因素以及纖維素酶、植酸酶、果膠酶的活性，其結(jié)果將為雜粕類發(fā)酵飼料提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

①本試驗(yàn)篩選出的5 株產(chǎn)蛋白酶菌經(jīng)形態(tài)學(xué)分析及分子生物學(xué)（26S rDNA序列分析）鑒定菌株Y1為庫(kù)德畢赤酵母，Y5為東方伊薩酵母，Y16為馬克斯克魯維酵母，Y20為近平滑假絲酵母，Y21為單孢釀酒酵母。

②對(duì)各菌株產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，在最佳產(chǎn)酶條件下，菌株庫(kù)德畢赤酵母Y1（時(shí)間48 h、接菌量3%、溫度30 ℃、pH 值9）酶活力為229.89 U/mL，東方伊薩酵母Y5（時(shí)間48 h、接菌量4%、溫度37 ℃、pH值9）酶活力為212.63 U/mL，馬克斯克魯維酵母Y16（時(shí)間48 h、接菌量3%、溫度37 ℃、pH值9）酶活力為208.44 U/mL，近平滑假絲酵母Y20（時(shí)間48 h、接菌量4%、溫度37 ℃、pH 值9）酶活力為211.74 U/mL，單孢釀酒酵母Y21（時(shí)間48 h、接菌量4%、溫度30 ℃、pH 值9）酶活力為209.96 U/mL。對(duì)復(fù)合酶進(jìn)行測(cè)定，庫(kù)德畢赤酵母Y1、馬克斯克魯維酵母Y16、單孢釀酒酵母Y21 具有較高的植酸酶活性。五株菌株均表現(xiàn)出較高的果膠酶活性、纖維素酶活性。