吳林慧，余 珂，崔 悅，朱雪蓮，楊 正，馬 佳

蚌埠醫(yī)學(xué)院1腫瘤基礎(chǔ)研究與臨床檢驗(yàn)診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，4檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，安徽 蚌埠233030；2安徽省阜陽市婦女兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽 阜陽236000

腎癌是我國(guó)泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，在西方國(guó)家腎細(xì)胞癌被列入患病率前十名的惡性腫瘤［1］。近年來,腎癌的發(fā)病率有逐年增加的趨勢(shì)，大多數(shù)國(guó)家的年增長(zhǎng)率約為2%～3%。20%～25%的腎癌患者早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移腎癌患者的5年生存率不超過10%［19］。系統(tǒng)性治療轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌有了很大的進(jìn)展，靶向治療藥物血管表皮生長(zhǎng)因子和mTOR被批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移性腎癌［2］。靶向治療與免疫治療相結(jié)合的聯(lián)合治療將是未來轉(zhuǎn)移性腎癌治療的重要策略［3］。盡管如此，仍有相當(dāng)一部分患者對(duì)靶向治療產(chǎn)生耐藥，并伴隨腫瘤惡化，最終導(dǎo)致死亡。因此，深入研究腎癌的相關(guān)分子機(jī)制將為腎癌的治療提供新的有效靶點(diǎn)。SPOP蛋白是E3泛素連接酶cullin3的接頭分子，構(gòu)成E3泛素連接酶復(fù)合體，在蛋白的泛素化和降解中起著重要作用［4］。SPOP參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生，SPOP在腎癌組織中陽性表達(dá)要高于正常對(duì)照組織，且與腫瘤的分級(jí)、分期、轉(zhuǎn)移、預(yù)后相關(guān)［5-6］。目前研究已發(fā)現(xiàn)Cdc20［7］、TRIM24［8］、ATF2［9］、SIRT2［10］、LATS1［11］等均可被SPOP組成的E3泛素連接酶復(fù)合體降解，同時(shí)，SPOP也可以作為底物進(jìn)行泛素化修飾和降解［12］。已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道SPOP表達(dá)的增加與腎細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移成正相關(guān)，并誘導(dǎo)上皮細(xì)胞間質(zhì)化和促進(jìn)腎癌ACHN細(xì)胞的侵襲［13］；在腎癌A498和ACHN細(xì)胞沉默SPOP表達(dá)后，抑制腎癌細(xì)胞的遷移和誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡［14］；而目前過表達(dá)SPOP后對(duì)腎癌細(xì)胞凋亡能力的影響并無報(bào)道，因此本研究使用786-O、A704、Caki-2三株細(xì)胞來充分研究SPOP對(duì)腎癌細(xì)胞株生物學(xué)功能的影響，發(fā)現(xiàn)SPOP在腎癌的生長(zhǎng)凋亡等起關(guān)鍵作用。并且在研究中發(fā)現(xiàn)在腎癌細(xì)胞中SPOP能上調(diào)c-Jun蛋白的表達(dá)，而c-Jun被認(rèn)為是生長(zhǎng)和分化的關(guān)鍵調(diào)控分子，其蛋白產(chǎn)物是轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1（AP-1）的組成部分，由Jun和Fos基因家族的同二聚體或異二聚體組成，通過亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域二聚并結(jié)合于DNA序列［17］，因此本研究以期為腎癌的臨床治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

SPOP 質(zhì)粒和對(duì)照（EV）由本實(shí)驗(yàn)室保存；Lipofectamine3000（Invitrogen）；SPOP 抗體（Abcam），c-Jun（cell signaling technology），Anti-Vinculin（Servicebio）、TUNEL BrightRed 凋亡檢測(cè)試劑盒（Vazyme）；胎牛血清（CLARK），四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）（Sigma）；RPMI 1640，DMEM，Mccoy's 5A培養(yǎng)基（自Hyclone）；Transwell小室和基質(zhì)膠（BD）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

細(xì)胞培養(yǎng)：腎癌細(xì)胞786-O、A704、Caki-2購自上海酶研生物科技有限公司，分別使用含有10%濃度的血清+1%的青霉素－鏈霉素抗生素的RPMI 1640，DMEM，Mccoy's 5A 培養(yǎng)基，加入相應(yīng)的完全培養(yǎng)基將細(xì)胞放入含5%CO2的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d 換液，待細(xì)胞長(zhǎng)至90%以上后傳代處理或者做其他相關(guān)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后，均勻接種20萬的細(xì)胞于六孔板內(nèi)，待24 h 后細(xì)胞長(zhǎng)至70%左右的密度轉(zhuǎn)染空載及pcDNA3.1-SPOP 組，轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine3000 說明書操作。

1.3 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)及MTT法測(cè)細(xì)胞增殖

克隆形成實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染后24 h收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取5000個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，7 d后用瑞吉氏染液染色拍照，A液染色1 min，在A液的基礎(chǔ)上，加B液染色5 min，用純水潤(rùn)洗六孔板后拍照；MTT法測(cè)細(xì)胞增殖：轉(zhuǎn)染后24 h收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取5000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，72 h后每孔加20 μL MTT溶液，4 h后吸去MTT加200 μL DMSO溶液溶解甲臜結(jié)晶，30 min后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)吸光度A490nm。

1.4 創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)

六孔板內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h用10 μL短槍頭劃痕（記為0 h），在顯微鏡下拍照留存圖片；于劃痕后24 h觀察細(xì)胞遷移情況（記為24 h），在顯微鏡下拍照留存圖片做后續(xù)分析［15］。

1.5 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后用胰酶消化各組細(xì)胞并計(jì)數(shù)，在24孔板內(nèi)將細(xì)胞接種于未包被（細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)）和包被（細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)）基質(zhì)膠的Transwell小室，做相應(yīng)的遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)，方法同我們近期發(fā)表的文章［16］，培養(yǎng)24 h后先用4%多聚甲醛固定15 min，再用結(jié)晶紫染色15 min處理，最后在高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野的穿膜細(xì)胞數(shù)并拍照記錄。

1.6 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

在玻底培養(yǎng)皿培養(yǎng)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染72 h后，用PBS漂洗載玻片2次，再用4%多聚甲醛固定，在4 ℃放置25 min，透膜用Proteinase K溶液作用10 min，再加TUNEL反應(yīng)標(biāo)記液在37 ℃條件下放置60 min，最后用DAPI染液復(fù)染10 min，在熒光顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野凋亡細(xì)胞并拍照記錄。

1.7 反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量聚合酶反應(yīng)（Real-time PCR）

細(xì)胞經(jīng)過轉(zhuǎn)染24 h 后提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再按照熒光定量試劑盒說明書進(jìn)行操作。PCR所用引物序列如下：SPOP:5'-GCCCTCTGCAGTAA CCTGTC-3' (Forward)，5'-GTCTCCAAGACATCCGA AGC-3'(Reverse)；c-Jun: 5'-CAACATGCTCAGGGAA CAGGTG-3' (Forward)，5'-CTCAGCCCTGACAGTC TGTTCTC-3'(Reverse)；內(nèi)參GAPDH：5'-TATAAATT GAGCCCGCAGCC-3' (Forward)，5'-ATGAAGGGGT CATTGATGGCA-3'(Reverse)。

1.8 蛋白免疫印跡

收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用RIPA（加PMSF）裂解液在冰上裂解30 min，離心后用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)，再進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，電泳過后轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜，5%牛奶封閉2 h，一抗過夜孵育（4 ℃），次日洗膜后二抗室溫孵育2 h，顯影后對(duì)條帶做灰度值掃描。以目的條帶和內(nèi)參的灰度值比值做蛋白表達(dá)的定量分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Graphpad Prism6作圖，采用t檢驗(yàn)分析，比較組間差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SPOP促進(jìn)腎癌細(xì)胞的克隆形成能力及增殖能力

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1A、B）及MTT結(jié)果（圖1C～E）顯示，SPOP除能影響腎癌細(xì)胞的遷移和侵襲，還能促進(jìn)腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)能力。

圖1 SPOP促進(jìn)腎癌細(xì)胞的克隆形成能力及增殖能力Fig.1 SPOP promote clonal formation and proliferation of renal carcinoma cells.A:Renal cancer 786-O cells transfected with a vehicle plasmid(EV)and SPOP-overexpressing plasmid(SPOP).B:Caki-2 cells transfected with a vehicle plasmid (EV) and SPOP-overexpressing plasmid. C, D, and E:Viability of 786-O cells, CaKi-2 cells and A704 cells transfected with the vehicle plasmid (EV) and SPOP-overexpressing plasmid,respectively.**P＜0.01,*P＜0.05,***P＜0.01 vs control group.

2.2 SPOP促進(jìn)腎癌細(xì)胞的遷移和侵襲

與對(duì)照組相比，SPOP過表達(dá)能促進(jìn)786-O細(xì)胞和Caki-2細(xì)胞的遷移能力（圖2A、B）；Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，SPOP過表達(dá)組腎癌細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著增加（圖2C～E）。

2.3 SPOP抑制腎癌細(xì)胞的凋亡

TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在腎癌786-O細(xì)胞和Caki-2 細(xì)胞過表達(dá)SPOP 后，SPOP 顯著抑制細(xì)胞凋亡（圖3A、B）

2.4 過表達(dá)SPOP后c-Jun蛋白的表達(dá)相應(yīng)增強(qiáng)

Western blotting實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SPOP能上調(diào)c-Jun蛋白表達(dá)（圖4C、D）；Real-time PCR結(jié)果顯示c-Jun mRNA水平無明顯變化（圖4A、B）。

3 討論

SPOP既是癌基因又是抑癌基因，例如，在小細(xì)胞肺癌當(dāng)中SPOP是抑癌基因［20］；在肝癌細(xì)胞中，研究證明SPOP能抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移［21］；而在腎癌中，SPOP被認(rèn)為是一種癌基因，有研究顯示，敲除SPOP可以抑制腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡［14,22-23］，SPOP能促進(jìn)腎癌細(xì)胞體外成瘤能力及增殖能力［24］；在腎透明細(xì)胞癌的細(xì)胞質(zhì)中，SPOP表達(dá)升高，可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和促進(jìn)腎臟腫瘤的發(fā)生。而在正常細(xì)胞中，SPOP位于細(xì)胞核內(nèi)，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［19］。此外，SPOP可以誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞發(fā)生EMT（上皮細(xì)胞像間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變），促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲，其機(jī)制與SPOP 升高β-catenin 和TCF4 的表達(dá)有關(guān)［13］。因此，SPOP可能是腎癌治療的潛在分子靶點(diǎn)［19,25］。

對(duì)于SPOP在腎癌中的研究尚未完善，因此本研究主要研究SPOP對(duì)腎癌惡性生物學(xué)功能方面的影響及相關(guān)的分子機(jī)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)SPOP后腎癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)和侵襲能力增強(qiáng)，與前期報(bào)道結(jié)果一致，本研究還發(fā)現(xiàn)，在腎癌細(xì)胞中過表達(dá)SPOP后，該腫瘤細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)，凋亡能力被抑制，并且本研究還使用了786-O細(xì)胞、A704細(xì)胞以及Caki-2細(xì)胞，目前并無相關(guān)研究報(bào)道SPOP對(duì)A704細(xì)胞功能作用的影響，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步完善了SPOP在腎癌786-0和Caki-2細(xì)胞的相關(guān)功能研究。因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分體現(xiàn)了SPOP在腎癌發(fā)生的過程中起到關(guān)鍵作用。在分子機(jī)制方面，本研究在篩選SPOP靶基因時(shí)，還發(fā)現(xiàn)c-Jun也是SPOP的目標(biāo)靶蛋白之一。c-Jun在細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)化、生長(zhǎng)、分化或凋亡過程中起著重要作用［26］，且有研究發(fā)現(xiàn)c-Jun分子在腎癌中高表達(dá)［18］，但是c-Jun發(fā)揮作用的具體靶點(diǎn)為何需要進(jìn)一步去闡釋。目前國(guó)內(nèi)外并無相關(guān)研究報(bào)道SPOP與c-Jun的相關(guān)關(guān)系，然而本實(shí)驗(yàn)在研究中發(fā)現(xiàn)SPOP在轉(zhuǎn)錄后水平能上調(diào)c-Jun蛋白的表達(dá)，盡管如此，SPOP具體調(diào)控c-Jun的分子機(jī)制為何還需要進(jìn)一步去探究。

圖2 SPOP促進(jìn)腎癌細(xì)胞的遷移和侵襲Fig.2 SPOP promotes migration and invasion of renal carcinoma cells.A,B:Wound-healing assay of 786-O cells and Caki-2 cells transfected with a vehicle plasmid (EV) and SPOP-overexpressing plasmid. (**P＜0.01, ***P＜0.001 vs control group). C:Invasion and migration assays of 786-O cells,Caki-2 cells and A704 cells transfected with the vehicle plasmid(EV)and SPOPoverexpressing plasmid,respectively.**P＜0.01,***P＜0.001,****P＜0.0001 vs control group.

綜上所述，SPOP能促進(jìn)腎癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制腎癌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腎癌惡性生物學(xué)功能的進(jìn)展，并且能上調(diào)c-Jun蛋白的表達(dá)，將為后續(xù)腎癌的臨床治療提供新靶點(diǎn)和新思路，但是對(duì)于SPOP在分子機(jī)制方面的研究還需要進(jìn)一步去探索。

圖3 SPOP抑制腎癌細(xì)胞的凋亡Fig.3 SPOP overexpression inhibits apoptosis of renal carcinoma 786-O cells (A) and Caki-2 cells (B) (*P＜0.05 vs control group).

圖4 過表達(dá)SPOP后c-Jun蛋白的表達(dá)相應(yīng)增強(qiáng)Fig.4 Expressions of c-Jun and SPOP at mRNA and protein levels in 786-O cells and CaKi-2 cells over-expressing SPOP.A, B:Real-time PCR of c-Jun and SPOP mRNA expressions in 786-O cells and CaKi-2 cells,respectively(***P＜0.001,****P＜0.0001 vs control group). C, D: Western blotting of c-Jun and SPOP protein expressions in SPOP-overexpressing 786-O cells and CaKi-2 cells(C)and quantitative analysis of the results(D)(*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs control group).