唐淬蓉，胡承光，周宇辰，宋楊達，李 孟，廖敏君，孫家潤，鐘春秀，周 琳，林志昭，周元平

南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院1消化內科，2感染內科，4內分泌科，廣東 廣州510515；3南方醫(yī)科大學中西醫(yī)結合醫(yī)院腫瘤中心，廣東 廣州510310

一直以來，HBV 感染被公認為我國肝細胞癌（HCC）發(fā)生最重要的病因，肝硬化是HCC發(fā)生主要的病理背景［1-2］。然而近20年來，在我國HBV現癥感染率從9.09%持續(xù)下降到6.0%以下的背景下［3］，HCC的發(fā)病率和病死率卻持續(xù)增加，發(fā)病率和病死率占全球50%以上，持續(xù)威脅著我國人民的健康和生命安全［4-5］。HBV現癥感染率下降和HCC發(fā)病率升高形成了剪刀差。文獻報道，HCC主要發(fā)生在40歲以上的人群，HBV現癥感染率降低主要見于20歲以下，特別是10歲以下人群，歸因于近20年來乙肝疫苗的普遍接種［1］。30歲以上HBV感染人群HCC發(fā)病率升高的推動因素是什么？近20年來，具有促進腫瘤發(fā)生的2型糖尿病（T2DM）發(fā)病率持續(xù)大幅升高［6-7］引起了我們的重視。T2DM是否HCC發(fā)病率升高的重要病因？針對這些臨床亟待解答的科學問題，我們采用最可能闡明病因聯系的隊列研究方法，以HCC 發(fā)病率較高的慢性乙型肝炎肝硬化（CHB-Cir）人群為研究對象，構成伴有T2DM的CHBCir觀察組，按配對對照原則組成不伴有T2DM的CHBCir對照組，進行了平均5年的大樣本隊列隨訪研究。試圖闡明T2DM是我國CHB-Cir患者HCC高發(fā)的重要危險因素，取得了較好的研究結果和客觀的臨床調查數據。

1 資料和方法

1.1 研究對象及分組

以2010年6月～2019年6月在南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院肝病中心接受抗病毒治療隨訪的CHB患者為基礎對象，確診為CHB-Cir的患者為隊列篩選對象。納入標準：年齡≥30歲；符合下述肝硬化診斷標準的CHB-Cir患者；同意基線調查并接受規(guī)律的復查和隨訪。排除標準：合并丙型肝炎病毒和艾滋病病毒感染者；其他原因引起的肝纖維化、肝硬化患者；合并酒精性肝病、自身免疫性肝病者；已有證據提示或證實為肝臟惡性腫瘤者；明確診斷1型糖尿病者。根據CHB-Cir患者是否合并T2DM，分為觀察組篩選群和對照組篩選群；再按照病例對照研究的設計，從2個群中依性別、年齡（相差≤5歲）、HBeAg狀態(tài)、HBV DNA定量基本匹配后，按1∶1的比例入組，構成隊列研究的CHB-Cir合并糖尿病組（簡稱觀察組，下同）和無糖尿病的CHB-Cir組（對照組）。并進行每半年一次的復查和隨訪。2020年12月底止，已經完成2年或以上隨訪且數據完整的病例納入統(tǒng)計分析。

本研究為前瞻性、對照、開放的隊列研究，已通過南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院倫理委員會批準，所有納入研究對象均為自愿參與并簽署書面知情同意書。研究隊列入組流程見圖1。

圖1 隊列研究觀察組和對照組入組流程圖Fig.1 Flowchart of patient enrollment.CHB:Chronic hepatitis B;CHB-Cir:Chronic hepatitis B with cirrhosis.

1.2 診斷標準

慢性乙型肝炎的診斷符合2010年中華醫(yī)學會肝病學分會與感染病學分會聯合制訂的《慢性乙型肝炎防治指南》［8］診斷標準；肝硬化的診斷符合2014年版《乙型肝炎病毒相關肝硬化的臨床診斷、評估和抗病毒治療的綜合管理》［9］診斷標準；HCC的診斷符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2011年版）》［10］診斷標準；2型糖尿病的診斷符合《中國2型糖尿病防治指南（2010年版）》［11］診斷標準。

1.3 基線調查與隨訪

基線調查以檢查結果和病歷記錄為依據，內容包括人口統(tǒng)計學數據、生活方式、既往史、腫瘤家族史等信息以及相關實驗室檢查結果。研究中所有對象均接受口服一線抗病毒藥物—核苷類似物（NAs）治療，每半年定期復查1次。有可疑HCC發(fā)生情況（例如AFP升高、B超發(fā)現肝內結節(jié)增大，可見低回聲結節(jié)）的病例，改為每2個月隨訪1次，以及時確診HCC發(fā)病。對于隨訪過程中的新發(fā)HCC病例，收集、核實其診斷依據，包括B超、增強CT、普美顯?增強磁共振等影像學檢查結果，AFP以及病理診斷等，以確認HCC的診斷。

1.4 統(tǒng)計學分析方法

應用SPSS25.0 進行數據分析。以Kolmogorov-Smirnov法檢驗數據正態(tài)分布與否，根據是否服從正態(tài)分布，分別采用均數±標準差或中位值（IQR）描述變量；對于正態(tài)分布計量資料，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布計量資料兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗；計數資料以例數和百分數表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier 法計算HCC 累積發(fā)生率；以Cox比例風險回歸模型分析T2DM與CHB-Cir相關HCC發(fā)生風險的關系。所有統(tǒng)計分析基于雙側假設檢驗，以α=0.05為檢驗水準，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 患者基線特征

CHB-Cir隊列共隨訪560例患者，剔除其中缺乏重要隨訪節(jié)點數據的病例、脫落病例以及隨訪時間不到2年的病例，最終進入統(tǒng)計分析的病例共467 例，其中男403例，女64例，CHB-Cir合并糖尿病203例（觀察組），無糖尿病的CHB-Cir264例（對照組）。467例研究對象共隨訪2262.42人年，隨訪時間4.4±1.62年。觀察組和對照組在性別、年齡、隨訪時間、肝癌家族史、抗病毒治療、肝硬化代償情況、HBeAg（+）、HBV DNA定量方面具有良好的可比性（P＞0.05，差異均無統(tǒng)計學意義，表1）。

表1 觀察組和對照組的基線指標比較分析Tab.1 Comparison of baseline clinical characteristics between CHB-Cir patients with and without diabetes

2.2 兩組HCC發(fā)病密度、HCC累積發(fā)生率的比較

觀察組203例研究對象共隨訪962.42人年，人均隨訪時間4.70±1.55年，隨訪期間新發(fā)HCC 69例，HCC發(fā)病率34.0%，發(fā)病密度71.69/千人年。對照組264例研究對象共隨訪1300人年，人均隨訪時間4.96±1.67年，新發(fā)HCC48例，HCC發(fā)病率18.2%，發(fā)病密度36.92/千人年。觀察組HCC發(fā)病率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學顯著性意義（χ2=15.273，P＜0.001）。用Kaplan-Meier法比較兩組HCC累積發(fā)生率的相對危險度，觀察組HCC 累計發(fā)生率高于對照組（Log-rank 檢驗，P＜0.001），相對危險度（RR）為2.096[95%置信區(qū)間（CI）：1.450～3.032，P＜0.01，圖2]。本研究揭示：乙型肝炎肝硬化合并糖尿病時發(fā)生HCC的風險是無糖尿病時的2.096倍，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

2.3 糖尿病與CHB-Cir患者HCC發(fā)生風險的關系

圖2 觀察組和對照組HCC累積發(fā)生率的比較Fig.2 Comparison of rates of cumulative incidence of HCC in the two groups.

2.3.1 HCC相關因素的單因素Cox比例風險分析選取既往文獻報道可影響HCC發(fā)生的因素，如性別、年齡≥40歲、合并糖尿病、肝癌家族史、抗病毒治療、肝硬化失代償、HBeAg狀態(tài)、病毒載量、血脂，進行單因素Cox比例風險分析，結果顯示：糖尿病、年齡≥40歲、肝癌家族史、低密度脂蛋白（LDL）升高、膽固醇升高（CHOL）是HCC 的相關危險因素；其風險率（HR）分別為2.656（95%CI:1.831～3.853）、2.334（95%CI:1.831～3.853）、2.438（95% CI:1.831～3.853）、1.944（95% CI:1.831～3.853）、1.980（95%CI:1.831～3.853），差異均具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）?？共《局委熓荋CC發(fā)生的保護因素，HR為0.087（95%CI:1.831～3.853，P=0.0000，表2）。

2.3.2 HCC相關因素的多因素Cox比例風險分析 根據單因素Cox 比例風險分析結果，對有統(tǒng)計學意義的HCC 相關因素進一步行多因素Cox 比例風險分析，發(fā)現：合并糖尿病、年齡≥40歲、有肝癌家族史是HCC發(fā)生的獨立危險因素，調整風險率（aHR）分別為2.092（95%CI:1.420～3.096）、2.095（95%CI:1.268～3.463）、1.892（95%CI:1.192～3.001）。調整年齡（≥40歲）、肝癌家族史、抗病毒治療、膽固醇升高、低密度脂蛋白膽固醇升高后，CHB-Cir合并糖尿病時發(fā)生HCC的風險是單純CHB-Cir 患者的2.092 倍（95%CI：1.420-3.096，P=0.000，表3）。

表2 HCC相關因素的單因素Cox比例風險分析Tab.2 Univariate Cox proportional hazards analysis of risk factors of HCC

表3 HCC相關因素的多因素Cox比例風險分析Tab.3 Multivariate Cox proportional hazards analysis of risk factor for HCC

3 討論

慢性乙型肝炎（CHB）肝硬化(Cir)是我國HCC發(fā)生發(fā)展的主要病因和重要病理背景。近20 年來，我國CHB防治取得了舉世矚目的成就：HBV現癥感染率由9.09%下降到6%以下，但HCC的發(fā)病率和病死率卻持續(xù)升高，形成了剪刀差。這個剪刀差的驅動因素是什么？廣泛調研后，具有促進腫瘤發(fā)生、呈逐年快速上升趨勢的T2DM引起了我們的深切關注。為揭示T2DM在CHB-Cir相關HCC高發(fā)中的驅動作用，我們采用前瞻性隊列研究設計，聚焦于CHB-Cir人群，按1∶1的病例對照比例構成觀察組（CHB-Cir合并T2DM組）和對照組（單純CHB-Cir組）。對納入的467例患者共隨訪2262.42人年，人均隨訪時間4.4±1.62年，新發(fā)HCC共117例，HCC發(fā)病率為25.1%，HCC發(fā)病密度為51.71/千人年。其中，CHB-Cir合并糖尿病（觀察組203例）時HCC發(fā)病率34.0%，發(fā)病密度71.69/千人年，風險比RR是對照組的2.096 倍。提示CHB-Cir 合并T2DM 時HCC發(fā)病密度明顯增高。在調整了年齡、肝癌家族史、病毒水平、血脂等混雜因素后，調整風險值未明顯改變。揭示T2DM是CHB-Cir相關HCC發(fā)生的重要危險因素。

近年來，CHB相關HCC與T2DM之間的聯系引起了研究者的較多重視。一項來自中國臺灣的病例對照研究［12］納入了4179例伴或不伴糖尿病的CHB患者，結果發(fā)現并發(fā)糖尿病的CHB患者的HCC累積發(fā)生率顯著高于無糖尿病的CHB 患者（RR=1.628，P=0.012）。在調整了年齡、性別、高脂血癥、抗病毒治療、他汀類藥物治療和肝硬化之后，糖尿病仍然是HCC的獨立預測因素（HR=1.798，P=0.005）。Kim［13］、Li［14］和Shyu 等［15］也報道了類似的結果。一項來自新西蘭的回顧性研究則納入了223例CHB-Cir患者，結果表明合并T2DM的CHB-Cir 患者的HCC 發(fā)病密度為60.5/千人年，而非T2DM的CHB-Cir患者僅為25.4/千人年（P=0.006）［16］。以上研究均提示T2DM是HCC發(fā)生的危險因素。但這些研究多為回顧性研究，納入的分析對象多為CHB患者，而關注CHB-Cir人群的研究則存在病例數較少、隨訪時間較短等情況。尚未見到來自中國大陸CHB-Cir合并糖尿病時發(fā)生HCC風險分析的3年以上隊列研究報道。由于HCC的發(fā)生是多因素、多步驟、多基因參與的復雜的致癌過程，我們在隊列研究設計時綜合考慮既往文獻報道的風險因素，采用傾向得分匹配法（PSM）按比例配對，以平衡已經報道的混雜因素，如性別、年齡、HBeAg狀態(tài)和HBV DNA載量水平，突出血糖升高對HCC 發(fā)生的影響，取得了良好的結果：隊列研究中，HCC相關因素的單因素Cox比例風險分析和多因素Cox比例風險分析糖尿病均為HCC發(fā)生的獨立危險因素；與對照組相比較，觀察組中，糖尿病的調整風險率（aHR）為2.092（95%CI:1.420～3.096），得出了明確的T2DM 是CHB-Cir 相關HCC 高發(fā)的重要危險因素的結論。

CHB-Cir合并T2DM時HCC發(fā)生風險顯著升高的機制是什么？在“乙肝-肝硬化-肝癌”三步曲的進展模式中，由于肝臟持續(xù)受到CHB炎癥活動的影響，肝內T細胞表型和功能逐漸缺失，導致功能上的不足和細胞活性的降低，即T細胞耗竭，進而造成肝臟局部“免疫抑制微環(huán)境”［17-20］。近來研究認為，糖尿病所致的高血糖、胰島素抵抗和慢性炎癥等均會增加惡性腫瘤的發(fā)病風險［21-22］。糖尿病患者由于血糖、血脂代謝紊亂產生過量自由基、TNF-α、IL-6、C-反應蛋白和其他炎性因子，從而促進炎癥反應的發(fā)生，也使肝內局部“炎癥微環(huán)境”惡化［23-24］；此外，糖尿病時微血管病變、組織微循環(huán)障礙、能量供應缺乏，易引發(fā)機體局部或全身性感染［25-27］，使糖尿病患者呈現慢性炎癥狀態(tài)。越來越多的證據表明，持續(xù)性的慢性炎癥增加基因的不穩(wěn)定性和腫瘤的發(fā)病風險［28-29］。CHB-Cir患者合并糖尿病時疊加了肝內的炎癥，促進了假小葉內肝細胞的異型性變，同時T細胞功能耗竭加快，進一步降低了機體的免疫監(jiān)視功能和調節(jié)功能，進而增加了HCC的發(fā)生風險。

既往研究提示，肝硬化、年齡大于50歲、高脂血癥、糖尿病是HBV相關HCC的風險因素，各因素與HCC發(fā)生的關系因研究差異而呈現不同特點［30-32］。本研究Cox比例風險分析提示T2DM、年齡≥40歲、肝癌家族史、LDL-C≥3.36 mmol/L、CHOL≥5.17 mmol/L是HCC的相關危險因素，HR分別為2.656、2.334、2.438、1.944和1.980，差異均具有統(tǒng)計學意義；早期（入組前1年以上）抗病毒治療是HCC發(fā)生的保護因素，HR為0.087（P=0.000）。因此，在CHB 防治過程中，阻止或延緩CHB朝肝硬化進展，以及T2DM的早發(fā)現、早診斷、早治療，對改善CHB患者遠期預后至關重要。

本研究有以下亮點：立足于我國慢性HBV感染者病程長、已進展為CHB-Cir患者較多的現狀，把研究對象聚焦于HCC高發(fā)的CHB-Cir高危人群；研究樣本量足夠大，并對CHB-Cir患者進行了5年的隊列隨訪，調整混雜因素之后重點分析T2DM是否協同CHB-Cir促進HCC的發(fā)生，為HCC的早期干預研究提供了重要的循證醫(yī)學依據和深入研究的線索。本研究的不足之處：包括未評估超重與肥胖、T2DM病程、不同的降糖藥物治療（既往由內分泌科專家制定）對HCC發(fā)生的影響。尚需納入相關因素深入開展多中心、大樣本量的隊列研究，以闡明體質量、T2DM病程、不同降糖治療藥物對CHB-Cir人群HCC發(fā)生風險的影響。

綜上所述，本研究通過建立前瞻性、配對對照的研究隊列，聚焦于CHB-Cir人群，經過長達5年的隊列隨訪的結果揭示：CHB-Cir合并糖尿病時HCC發(fā)生風險明顯增加；糖尿病是CHB-Cir相關HCC的獨立危險因素；年齡大于40歲、有肝癌家族史、LDL升高、CHOL升高也是HCC的相關風險因素。在臨床實踐中對于年齡大于40歲的CHB-Cir患者，需要高度重視血糖、血脂等早期HCC風險因素的檢測。下一步對這些風險因素深入開展多中心的干預和控制研究，可望為明顯降低CHB-Cir相關HCC的發(fā)生率提供循證醫(yī)學依據和臨床數據支持。