李麗莎，李 江，楊 泳，劉 娜，郭 欣，鄒 曦，馬文婕，劉星玲，朱曉燕，劉 睿

1云南省第一人民醫(yī)院麻醉科，云南 昆明650032；2昆明醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)機能實驗中心，云南 昆明650500；3昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明650500

肺通透性增加是呼吸機誘導(dǎo)的肺損傷（VILI）的早期關(guān)鍵病理變化環(huán)節(jié)，肺內(nèi)炎癥介質(zhì)的大量生成是其重要致病因素［1-2］。在眾多的炎癥介質(zhì)中，前列環(huán)素（PGI2）是一種強效內(nèi)源性擴血管和抗血小板聚集物質(zhì)，而血栓素A2（TXA2）具有強烈的縮血管和促血小板聚集作用。二者分別由前列腺素H2 經(jīng)前列環(huán)素合酶（PGIS）和血栓素合酶（TXS）直接代謝生成［3］。正常生理狀態(tài)下，它們的比值保持在一恒定水平，此種平衡狀態(tài)對維持機體的正常機能具有重要意義［4-5］。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，單肺通氣實驗動物肺內(nèi)大量生成的PGI2和TXA2以及PGI2/TXA2比值的降低是造成實驗動物肺通透性增加的重要原因［6］。但有關(guān)PGI2和TXA2調(diào)控機械通氣（MV）實驗動物肺通透性的具體作用機制，以及PGI2/TXA2比值變化會對肺通透性產(chǎn)生怎樣的影響，目前均不十分清楚。

大量研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達水平的增高是造成肺通透性增加的重要原因［7-9］。PGI2及其類似物的生物學(xué)活性作用與下調(diào)TNF-α表達有關(guān)［10-11］，而TXA2 的生物學(xué)活性作用可通過上調(diào)TNF-α而實現(xiàn)［12-13］。據(jù)此我們推測TNF-α是PGI2和TXA2的共同作用通路，上調(diào)PGI2/TXA2 比值具有抗VILI 保護作用，而下調(diào)PGI2/TXA2比值則會加重VILI。

本研究在MV致兔肺損傷動物模型中，分別觀察PGIS抑制劑反苯環(huán)丙胺和TXS抑制劑達唑氧苯對實驗動物肺內(nèi)TNF-α生成和肺通透性的影響，闡明PGI2和TXA2在MV致肺通透性增加中的作用機制，為臨床藥物防治VILI提供一定的實驗研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

多功能麻醉機（Aestiva/5 7900，Datex Ohmeda.Inc，美國）；麻醉監(jiān)護儀（S/5 Compact，通用電器醫(yī)療集團芬蘭公司）；多參數(shù)心電監(jiān)護儀（M8003A，飛利浦公司）；酶標(biāo)儀（Model NO 550，BIO RAD）；顯微照相系統(tǒng)（DM4000B，LEICA）；達 唑 氧 苯（sc-492401 Santa Cruz）；反苯環(huán)丙胺（S9464 Selleck）；MLCK 抗體（ab76092，abcam）；GAPDH 抗體（2118，CST）；PGI2（CEA727Ge，優(yōu)爾生）和TXA2（CEB396Ge，優(yōu)爾生）檢測試劑盒；TNF-α檢測試劑盒（GOY-E1354，TSZ）；48只健康日本大耳白兔，體質(zhì)量2.2～2.5 kg，雌雄各半，購自昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。本研究項目獲云南省第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（2015LH026）。

1.2 方法

1.2.1 實驗設(shè)計 實驗動物隨機均分為6組（n=8）：溶劑治療組（V組）；反苯環(huán)丙胺治療組（T組）；達唑氧苯治療組（D組）：溶劑治療+MV組（VM組）；反苯環(huán)丙胺治療+MV組（TM組）和達唑氧苯治療+MV組（DM組）。

1.2.2 機械通氣的實施、術(shù)中監(jiān)測和麻醉維持 戊巴比妥鈉（30 mg/kg）經(jīng)耳緣靜脈注入麻醉后，頸正中切口分離暴露氣管、左側(cè)頸總動脈和右側(cè)頸靜脈。左頸總動脈置管持續(xù)監(jiān)測動脈血壓，右側(cè)頸靜脈置管恒速輸注林格氏液（10 mL·kg-1·h-1），維持血壓波動在基礎(chǔ)值±20%之間。隨后，非MV實驗動物麻醉狀態(tài)下保留自主呼吸，MV各組經(jīng)右頸靜脈注入芬太尼（8 μg/kg）和維庫溴銨（0.2 mg/kg），待實驗動物呼吸停止后插入帶套囊氣管導(dǎo)管（ID 2.0 ～2.5 mm），接呼末CO2監(jiān)測儀和麻醉機，實施時長為2 h的MV：吸入氧濃度（FiO2）=1.0；潮氣量（VT）=20 mL/kg，調(diào)整呼吸頻率（RR）維持呼末CO2在35～45 mmHg范圍內(nèi)，吸氣時間：呼氣時間（I∶E）=1∶2。MV過程中以恒速輸注丙泊酚（8 mg·kg-1·h-1）和瑞芬太尼（10 μg·kg-1·h-1），每30 min追加維庫溴銨0.1 mg/kg維持麻醉。

1.2.3 反苯環(huán)丙胺和達唑氧苯的給予方法 參照他人研究［14-15］和我們之前預(yù)實驗的方法，將反苯環(huán)丙胺和達唑氧苯分別以10 mg/mL和15 mg/mL的濃度溶解于生理鹽水中，藥物治療組于取材前2 h或MV即刻經(jīng)右側(cè)頸靜脈給予各自對應(yīng)的藥物（反苯環(huán)丙胺：10 mg/kg；達唑氧苯：15 mg/kg），并于取材前1 h或MV 1 h時再次追加之前用量的1/2。溶劑治療組則在相應(yīng)時間點給予同等容積的溶劑。

1.2.4 肺組織取材 V組、T組和D組實驗結(jié)束后經(jīng)耳緣靜脈注入3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉狀態(tài)下取材，MV實驗動物于實驗結(jié)束后取材。收集各組實驗動物左肺支氣管肺泡灌洗液（BALF）用于測定肺通透性指數(shù)和TNF-α含量，右肺用于檢測其余各指標(biāo)。

1.2.5 肺通透性的評價方法

1.2.5.1 肺通透性指數(shù)和肺濕/干質(zhì)量（W/D）比值測定肺通透性指數(shù)和肺W/D比值（右肺上葉）測定的方法同之前實驗研究［16］。

1.2.5.2 肺通透性增加的分子標(biāo)志物測定 肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）的表達水平可作為反映肺通透性增加程度的分子標(biāo)志［17］。運用Western blot檢測右肺上葉MLCK蛋白表達水平（具體方法詳見1.2.9）。

1.2.6 肺組織學(xué)評分 靠右肺上葉外1/2內(nèi)側(cè)處切取肺組織，行HE染色。參照之前方法［6,16］在光學(xué)顯微鏡下對肺組織進行形態(tài)學(xué)評分。

1.2.7 肺PGI2、TXA2 含量及PGI2/TXA2 比值測定TXA2和PGI2在體內(nèi)的半衰期分別為30 s和3 min，難以直接測定，目前均以各自穩(wěn)定代謝產(chǎn)物TXB2和6-KPGF1α分別作為反映TXA2和PGI2含量的指標(biāo)［4,6,8］。運用相應(yīng)ELISA試劑盒檢測右肺中間兩葉TXB2和6-KPGF1α含量，計算6-K-PGF1α/TXB2比值。

1.2.8 肺組織和BALF中TNF-α含量測定 運用ELISA試劑盒檢測肺組織和BALF中TNF-α含量，具體方法按試劑盒說明書進行操作。

1.2.9 Western blot實驗 稱取肺組織100 mg，向其中加入1 mL 組織裂解液，電動勻漿機器勻漿后冰浴裂解10 min，4 ℃12 000 r/min 離心10 min，吸取上清液，BCA法測定蛋白濃度。各樣本均恒上樣量70 μg，60 V電壓電泳30 min，90 V電壓電泳40 min，100 V電壓濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜2 h。TBST充分洗膜。室溫封閉1 h，加入對應(yīng)濃度的一抗（MLCK，1∶1000；GAPDH，1∶2000），4 ℃孵育過夜。洗膜后加入HRP標(biāo)記二抗（abmart，1∶2000），室溫孵育1 h。TBST漂洗PVDF膜4次，5 min/次。將配制好的HRP 底物顯色液（millipore）滴加到待顯影的PVDF膜上并涂抹均勻，采用化學(xué)發(fā)光儀（Bio-Rad）采集圖片，所得圖片用Image J軟件分析灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)為計量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。多組間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組動物肺通透性指標(biāo)變化和肺組織學(xué)評分

單純給予溶劑、反苯環(huán)丙胺或達唑氧苯治療對實驗動物肺通透性相關(guān)指標(biāo)[肺濕/干質(zhì)量比值（圖A）、肺通透性指數(shù)（圖B）和肌球蛋白輕鏈激酶蛋白（圖C1，C2）表達水平]和肺組織學(xué)評分（圖D）無顯著影響；VM組實驗動物肺通透性和肺組織學(xué)評分明顯增高（P＜0.05）；反苯環(huán)丙胺治療使MV實驗動物肺通透性和肺組織學(xué)評分進一步增加（P＜0.05），而達唑氧苯治療可顯著降低MV實驗動物肺通透性和肺組織學(xué)評分（P＜0.05，圖1）。

圖1 各組動物肺通透性評價指標(biāo)和肺組織學(xué)評分Fig.1 Lung W/D ratio(A),pulmonary permeability index(B),expression of MLCK protein(C1 and C2)and histological scores(D)in different groups.▲P＜0.05 vs V group.★P＜0.05 vs VM group.◇P＜0.05 vs TM group.V:Vehicle treatment group.T:Tranylcypromine treatment group.D:Dazoxiben treatment group.VM:Vehicle treatment plus mechanical ventilation group.TM:Tranylcypromine treatment plus mechanical ventilation group.DM:Dazoxiben treatment plus mechanical ventilation group.

2.2 肺組織形態(tài)學(xué)（HE染色）

V組、T組和和D組實驗動物肺組織部分區(qū)域見毛細血管擴張充血、肺泡腔內(nèi)少量炎癥細胞外，無明顯病理改變。VM組動物肺組織肺泡腔內(nèi)較多紅細胞和炎癥細胞浸潤，肺泡壁增厚和滲出，TM組實驗動物上述病理學(xué)改變較VM組明顯加重，而DM組卻顯著減輕（圖2）。

2.3 各組動物BALF和肺組織TNF-α含量

單純給予溶劑、反苯環(huán)丙胺或達唑氧苯不影響實驗動物BALF（圖3A）和肺組織（圖3B）TNF-α含量；VM組實驗動物BALF和肺組織TNF-α含量均明顯增加（P＜0.05），TM組實驗動物BALF和肺組織TNF-α含量進一步增加（P＜0.05），而DM 組實驗動物BALF 和肺組織TNF-α含量明顯降低（P＜0.05，圖3）

2.4 各組動物肺組織6-K-PGF1α和TXB2 含量及6-KPGF1α/TXB2比值變化情況

圖2 各組動物肺組織HE染色Fig2 Lung histology in different groups (HE staining, original magnification: ×400). A: Group V. B: Group T. C:Group D.D:Group VM.E:Group TM.F:Group DM.

圖3 各組動物BALF和肺組織TNF-α含量Fig.3 Contents of TNF-α in BALF(A)and lung tissue(B)in different groups.▲P＜0.05 vs V group,★P＜0.05 vs VM group,◇P＜0.05 vs TM group.

單純給予溶劑或抑制劑治療對非MV實驗動物肺內(nèi)6-K-PGF1α和TXB2含量及6-K-PGF1α/TXB2比值均無顯著影響；MV實驗動物肺內(nèi)6-K-PGF1α和TXB2含量及6-K-PGF1α/TXB2比值均顯著增加（P＜0.05）；反苯環(huán)丙胺使MV實驗動物肺內(nèi)6-K-PGF1α含量顯著減少（P＜0.05），6-K-PGF1α/TXB2比值下降（P＜0.05）；達唑氧苯明顯減少MV實驗動物肺內(nèi)TXB2生成（P＜0.05），進一步增加6-K-PGF1α/TXB2比值（P＜0.05，圖4）。

3 討論

雖然目前將VT設(shè)置為6～8 mL/kg（理想體質(zhì)量）的“肺保護性通氣策略”已得到臨床廣泛認(rèn)可。但肺CT掃描顯示，對于非均質(zhì)性肺部疾?。ㄈ绶蔷|(zhì)性肺氣腫、ARDS等）的患者來說，采用潮氣量小于10 mL/kg的“非傷害性”通氣模式，局部肺組織的潮氣量往往都超過了20 mL/kg［18］。對于ARDS患者，即使將潮氣量設(shè)置為7 mL/kg，通氣局部肺組織的潮氣量仍接近20 mL/kg［19］。所以，在本研究中，我們將潮氣量為設(shè)置為20 mL/kg，以期對臨床實際工作提供一定的實驗研究基礎(chǔ)。

研究發(fā)現(xiàn)，MV實驗動物肺內(nèi)PGI2和TXA2大量生成，出現(xiàn)明顯的肺損傷。這與我們之前的研究結(jié)果相同［6］。但在之前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)右側(cè)單肺通氣實驗動物通氣側(cè)肺組織PGI2/TXA2比值較假手術(shù)實驗動物顯著降低［6］，而在本研究中卻發(fā)現(xiàn)VM組實驗動物肺組織PGI2/TXA2比值較V組顯著增加。Wilson等［20］認(rèn)為只有VT高達30～40 mL/kg才會對小鼠肺組織造成不可逆的損傷。研究發(fā)現(xiàn)，大潮氣量通氣20 min即可引起的實驗大鼠肺水含量和肺泡腔蛋白含量的增加，如果大VT降低得比較快，上述肺損傷恢復(fù)得也比較快［21］。在之前研究中，我們對實驗動物實施的是為時2 h VT=20 mL/kg的單肺通氣加1 h VT=20 mL/kg的雙肺通氣，而本研究僅對實驗動物實施了為時2 h VT=20 mL/kg的雙肺通氣。所以我們推測出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因是之前研究所用通氣參數(shù)設(shè)置對通氣側(cè)肺組織已產(chǎn)生了不可逆的損害，使之處于失代償狀態(tài)。而在本研究所用通氣參數(shù)設(shè)置情況下，實驗動物肺組織可能處于代償狀態(tài)。此外，本研究結(jié)果提示，PGI2/TXA2比值的變化或許可作為判斷MV實驗動物肺損傷處于代償還是失代償狀態(tài)的指標(biāo)。

圖4 各組動物肺組織6-K-PGF1α和TXB2含量及6-K-PGF1α/TXB2比值變化Fig.4 Contents of 6-K-PGF1α(A)and TXB2(B)and 6-K-PGF1α/TXB2 ratio(C)in lung tissues in different groups.▲P＜0.05 vs V group,★P＜0.05 vs VM group,◇P＜0.05 vs TM group.

由于PGI2 具有抗肺通透性增加保護作用，而TXA2有促進肺通透性增加作用。本研究發(fā)現(xiàn)VM組實驗動物肺組織PGI2/TXA2比值增高的同時卻出現(xiàn)了明顯的肺損傷。雖然本研究不能對此現(xiàn)象的本質(zhì)做出確切解釋，但正如PGI2對大鼠全腦缺血再灌注損傷具有保護作用，而TXA2會加重該損傷，與正常對照相比，全腦缺血-再灌注組實驗動物PGI2/TXA2比值顯著增高的同時，卻出現(xiàn)了明顯的神經(jīng)元損傷一樣［4］。我們推測可能是機體自身防御機能被激活的結(jié)果。大量研究發(fā)現(xiàn)，PGI2與其受體結(jié)合后可通過多種途徑下調(diào)TNF-α表達［22-24］，而TXA2會促進TNF-α表達［8,25-26］，但本研究卻發(fā)現(xiàn)VM 組實驗動物PGI2/TXA2 比值顯著增加的同時，卻出現(xiàn)了TNF-α生成的明顯增多。對此，我們推測可能是VM組實驗動物肺組織PGI2/TXA2比值顯著增加并不足以消除其它致病因素介導(dǎo)TNF-α表達水平的增加，亦或增加的PGI2對TNF-α的抑制作用明顯弱于增加的TXA2對TNF-α表達的促進作用。但鑒于本研究的局限性，其中具體作用機制仍需進一步深入闡明。

研究進一步發(fā)現(xiàn)，減少MV實驗動物肺內(nèi)TXA2的生成會造成肺組織TNF-α表達水平的降低并減輕MV誘導(dǎo)的肺通透性增加，而減少MV實驗動物肺內(nèi)PGI2的生成會造成肺組織TNF-α表達水平的增高并加重MV誘導(dǎo)的肺通透性增加，這一研究結(jié)果提示TXA2可通過上調(diào)TNF-α表達引起MV實驗動物肺通透性增加，而PGI2可通過下調(diào)TNF-α表達減輕MV誘導(dǎo)的肺通透性增加。除此之外，研究還發(fā)現(xiàn)MV實驗動物BALF和肺組織TNF-α含量增高或降低的同時伴隨著MLCK表達水平的增高或降低。由于MLCK的活化可直接引起肌動蛋白-肌球蛋白收縮和橫向細胞肌動蛋白束（應(yīng)力纖維）形成，造成細胞收縮和內(nèi)皮細胞屏障功能破壞。這一研究結(jié)果提示TNF-α造成MV實驗動物肺通透性增加的機制與上調(diào)肺組織MLCK表達水平有關(guān)。其具體作用機制可能與TNF-α使細胞內(nèi)鈣離子濃度增加［12］，核因子-κB 激活［27］等有關(guān)。

綜上所述，本研究首次證實了TXA2可通過上調(diào)TNF-α/MLCK信號通路活性引起MV實驗動物肺通透性增加，而PGI2可通過下調(diào)TNF-α/MLCK信號通路活性發(fā)揮其抗MV誘導(dǎo)的肺通透性增加保護作用。但鑒于本研究的局限性和肺通透性調(diào)控機制的復(fù)雜性，對于PGI2和TXA2對TNF-α調(diào)控作用大小、具體機制，以及除TNF-α外，PGI2和TXA2是否還可通過其它信號通路調(diào)控肺通透性等問題均待于進一步的深入研究。