趙海玉，譚振林，何利偉，朱世杰，顏如玉，寇宏強，彭 健

南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院心血管內科，廣東 廣州510515

房性快速性心律失常是一組臨床上常見的快速性心律失常，包括心房顫動、心房撲動、房性心動過速，藥物治療效果不滿意，并發(fā)癥嚴重。近年來經導管射頻消融（RF）已成為房性快速性心律失常治療的有效手段之一，原理是通過電極釋放能量產生高溫引起組織的熱損傷，阻斷異常電位的傳導。術后復發(fā)是目前房性快速性心律失常特別是心房顫動治療中存在的主要問題。房顫導管消融的基石是肺靜脈電隔離（PVI）［1-2］，研究表明房顫消融術后復發(fā)的主要原因是肺靜脈和心房之間電傳導的恢復［3-4］，這歸咎于消融點未實現(xiàn)連續(xù)透壁損傷［5］，組織學研究表明不完全的PVI消融區(qū)的心肌損傷程度與房顫術后復發(fā)率有負相關性［6］。連續(xù)線性消融對提高房性快速性心律失常的治療成功率尤為重要［7-8］。目前提高RF效率的研究主要著眼于物理材料及技術的更新，而RF的操作是通過點與點連接形成消融線，點與點之間的組織因未接受足夠的熱量易造成亞致死性損傷，導致留有消融“間隙”或后期傳導恢復［9］，僅通過物理方法做到電位被完全隔離阻斷仍存在困難。

胺碘酮是一種常用的Ⅲ類抗心律失常藥，在臨床上常被用于控制節(jié)律，在射頻消融圍手術期作為輔助用藥可預防和治療房顫［10］，有研究表明術前應用胺碘酮可減少RF完成PVI的消融點數(shù)［11］。本團隊前期一項前瞻性臨床研究表明，射頻消融術中經導管灌注胺碘酮溶液可有效提高術中肺靜脈電隔離效率和竇律轉復率，降低術后復發(fā)率［12］。

既往文獻報道，RF造成的組織熱損傷主要為高熱造成的壞死以及凋亡和炎癥［13］。然而，胺碘酮在RF中對心房肌細胞損傷的影響尚無研究報道。研究胺碘酮對受熱損傷后的心房肌細胞的作用對探明其是否能促進消融病變從而提高房性心律失常的消融效率具有重要意義。本研究擬建立不完全射頻消融的細胞模型，胺碘酮加以干預，初步探索熱處理對心房肌細胞的損傷作用，及胺碘酮對心房肌細胞熱損傷的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

小鼠HL1心房肌細胞（永諾生物）；HWS-20恒溫水浴箱（江蘇太倉市實驗設備廠），鹽酸胺碘酮（Amiodarone）注射液（賽諾菲）；細胞活性檢測試劑盒（MTS）G3580、超氧化物歧化酶（SOD）S0101試劑盒、丙二醛（MDA）S0131試劑盒（碧云天）；小鼠白介素1β（IL-1β）ELISAKit、小鼠白介素6（IL-6）ELISAKit、小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISAKit（武漢華美生物）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將HL-1心房肌細胞在含10%胎牛的Dulbecco改良版Eagle培養(yǎng)基（DMEM）中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基含10%血清（FBS，Gibco）和1%青霉素-鏈霉素（Invitrogen），置于37°C、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 熱處理 參考Yoshida等［14］的肝臟射頻消融體外模型方法，水浴熱誘導小鼠HL1心房肌細胞，體外模擬射頻消融術中亞致死的心房肌細胞。當HL1小鼠心房肌細胞生長至80%匯合時，通過胰蛋白酶消化，洗滌并在1.5 mL微量離心管中用1 mL含10%FBS的DMEM重懸細胞（5×104）并立即在溫度37、46、49、52、55、58 ℃的恒溫水浴箱中培養(yǎng)10 min，然后將細胞接種到含10%FBS的100 μLDMEM中的96孔培養(yǎng)板中（1×104/孔），繼續(xù)在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，MTS法測量吸光度顯示存活率，得出對比于37 ℃細胞活力降低25%的溫度，數(shù)據(jù)用于后續(xù)實驗。

1.2.3 藥物干預 先用鹽酸胺碘酮注射液與DMSO配成100 mmol/L的母液，HL-1心房肌細胞接種于96孔板，待細胞匯合度到80%時，分別加入不同劑量的胺碘酮母液滴定至濃度為0、3、10、30、60、90 μmol/L，在37 ℃恒溫水浴箱中持續(xù)1 h，繼續(xù)在37 ℃，5%CO2下培養(yǎng)12 h，用MTS法測量吸光度，得出對比于無藥物（0 μmol/L）時細胞活力降低25%的藥物濃度，此濃度用于后續(xù)實驗。

1.2.4 實驗分組 HL1心房肌細胞按前述1.2.1的方法培養(yǎng)并接種至96孔培養(yǎng)板（1×104/孔）后按下列方式分組：空白對照組：置于37 ℃恒溫水浴箱；熱處理組：置于1.2.2選出的溫度水浴箱；胺碘酮組：滴定至實驗1.2.3所選的胺碘酮濃度再立即置于1.2.2選出的溫度水浴箱，3組細胞均置于相應水浴箱10 min后繼續(xù)在37 ℃、5%CO2下復溫培養(yǎng)12 h進行后續(xù)指標測定。

1.2.5 MTS檢測細胞活性 3個實驗組細胞接種于96孔板，每組設置3 個復孔，加入5 mg/mL 的MTS 溶液（20 μL/孔），室溫孵育4 h，棄孔內培養(yǎng)液，加入DMSO（150 μL/孔），放入振蕩儀勻速振蕩15 min，采用酶標儀檢測波長為490 nm處各孔的吸光度A490nm，計算細胞存活率。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組細胞，采用0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗滌細胞3次，調整細胞密度至2×106/mL，細胞懸液轉移至離心管，4 ℃，1000 r/min離心10 min，棄上清，加入預冷PBS重懸細胞，相同條件下離心10 min，PBS 洗滌，加入200 μL Binding Buffer，分別加入5 μLAnnexin V-FITC與PI充分混勻，室溫避光孵育15 min，加入300 μL Binding Buffer，置于FACS Calibur流式細胞儀及應用Cellauest軟件檢測各組細胞凋亡率。

1.2.7 檢測炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的水平 收集各組細胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA試劑盒測定炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.8 檢測MDA與SOD活性 采用不含血清的培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA（稀釋比1∶1000），DCFH-DA 終濃度為10 μmol/L，將DCFH-DA分別加入“1.2.4”實驗分組的細胞中，室溫避光孵育20 min，采用0.25%胰蛋白酶消化各組細胞，預冷PBS洗滌細胞，加入500 μL PBS重懸細胞，使用超聲波裂解細胞，4 ℃，4000 r/min離心15 min，吸取上清液，按照MDA和SOD的ELISA試劑盒檢測活性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計處理。首先對組間各樣本量參數(shù)行正態(tài)檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)士標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，因本研究樣本量較少，均經Mann-Whitney U檢驗校驗結果相符；所有檢驗均為雙側檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同溫度梯度下的細胞活性

以對照組（37 ℃）的細胞存活率為參照，心房肌細胞存活率在46 ℃溫度干預后下降[（89.28±3.11）%vs（100.00±4.75）%，P＜0.01]，且隨溫度的升高，HL1細胞存活率進一步降低，52 ℃的細胞存活率為（75.43±1.38）%，該溫度下細胞失活率約為25%，與對照組的細胞存活率差異及顯著（P＜0.001，圖1），而55 ℃與52 ℃下心房肌細胞的存活率差異并無統(tǒng)計學意義（P=0.223），故后續(xù)實驗中采用52 ℃作為加熱溫度。

2.2 不同胺碘酮濃度下的細胞活性

MTS法檢測37 ℃下不同胺碘酮濃度時的細胞活性，與對照組（0 μmol/L）比較，3 μmol/L的干預對HL1細胞存活率并無明顯影響（P=0.507），心房肌細胞存活率在10 μmol/L濃度的胺碘酮干預后顯著降低[（100.00±0.65）%vs（94.42±0.69）%，P＜0.001]；30 μmol/L的胺碘酮濃度引起心房肌細胞存活率明顯下降，存活率為（75.70±1.99）%，失活率約25%，后續(xù)60、90 μmol/L濃度下的存活率與30 μmol/L 差異并無統(tǒng)計學意義（P=0.126，0.789，圖2），后續(xù)實驗中采用30 μmol/L作為藥物干預濃度。

2.3 胺碘酮可進一步降低加熱導致的小鼠HL1心房肌細胞存活率

與對照組相比，52 ℃熱處理組的HL1心房肌細胞活性顯著降低[（75.74±3.28）%vs（99.67±3.26）%，P＜0.001]；加熱同時加30 μmol/L的胺碘酮導致細胞活性進一步降低至（64.15±0.71）%（P＜0.01，圖3）。

圖3 3組細胞的細胞存活率Fig.3 Cell viability in different groups. ***P＜0.001 vs the blank group,##P＜0.01 vs heat group(Mean±SD,n=3).

2.4 胺碘酮促進熱處理導致的小鼠HL1心房肌細胞凋亡

流式細胞術結果顯示，相比空白組，熱處理組小鼠HL1 心房肌細胞凋亡率顯著升高[（3.80±0.80）% vs（27.66±0.96）%，P＜0.001]，與熱處理組相比，胺碘酮組小鼠HL1 心房肌細胞凋亡率進一步增加至（29.79±0.32）%（P＜0.05，圖4）。

2.5 胺碘酮促進熱處理后小鼠HL1心房肌細胞炎癥因子表達

ELISA檢測結果顯示，加熱組心房肌細胞的IL-1β水平升高（P＜0.01），IL-6 水平顯著升高（P＜0.001），TNF-α數(shù)值有所升高但無統(tǒng)計學意義（P=0.383），而聯(lián)合胺碘酮處理后，IL-1β和IL-6 水平進一步增加（P＜0.01），TNF-α水平的增加顯著（P＜0.001，表1）。

2.6 胺碘酮對加熱后小鼠HL1心房肌細胞氧化應激的影響

分光光度計檢測細胞MDA、SOD結果顯示，和空白對照組相比，加熱及加熱聯(lián)合胺碘酮導致MDA表達升高（P＜0.01），胺碘酮導致細胞的氧化應激因子MDA進一步升高（P＜0.01），加熱導致SOD 活性降低（P＜0.001），胺碘酮的應用則導致SOD活性進一步降低（P＜0.05，表2）。

3 討論

表1 胺碘酮對熱處理誘導的小鼠HL1心房肌細胞IL-1β、IL-6和TNF-α分泌的影響Tab.1 Effect of amiodarone on heat-induced IL-1β,IL-6 and TNF-α expression in mouse HL1 atrial myocytes(pg/mL,Mean±SD,n=3)

表2 胺碘酮對熱處理誘導的小鼠HL1心房肌細胞MDA和SOD產生的影響Tab.2 Effect of Amiodarone on heat-induced MDA and SOD production in mouse HL1 atrial myocyte(Mean±SD,n=3)

目前鮮有研究報道射頻消融對心房肌細胞的損傷影響，RF的治療原理是射頻電流的熱損傷，參考腫瘤細胞RF體外研究模型，用恒溫水浴箱加熱心房肌細胞建立RF細胞體外熱損傷研究模型［15］，以37 ℃下的細胞存活率為參照，46 ℃，49 ℃，52 ℃，55 ℃，58 ℃等不同溫度梯度加熱均引起不同程度的小鼠心房肌細胞存活率下降，提示加熱模型構建成功。設52 ℃為加熱溫度作為熱處理組，小鼠HL1心房肌細胞的凋亡率、炎癥介質IL1β和IL6以及丙二醛釋放均增加，細胞存活率及SOD活性下降，該結果提示，熱損傷效應可造成心房肌細胞凋亡、炎癥和氧化應激。符合既往研究中RF及熱處理對組織細胞產生損傷的研究結果［16-17］。

快速性心律失常射頻消融治療中導管大頭材料的更新允許我們在RF術中可經導管灌注不同藥物，目前常規(guī)用冷鹽水灌注冷卻導管減少阻抗上升從而造成有效消融［18］，本團隊前期臨床研究表明經導管灌注胺碘酮溶液可有效提高RF效率，降低術后復發(fā)率［12］。胺碘酮因廣譜抗心律失常作用被廣泛應用于臨床，其不良反應也逐漸被報道：最嚴重的副作用是肺毒性［19-20］，也可引起肝毒性［21］、甲狀腺毒性［22］、視神經毒性［23］等，靜脈注射時可引起靜脈炎［24］。研究表明胺碘酮可促進大鼠腎組織MDA和IL-6顯著增加［25］；可引起大鼠肺組織MDA的增加和SOD的減少［26］；胺碘酮能提高人肺上皮細胞的Bax和Caspase 3的表達誘導凋亡［27］；可劑量依賴性地增加視網膜色素上皮細胞活性氧ROS 的產生，引發(fā)脂質過氧化和細胞凋亡［28］，還可誘導肺上皮細胞和肝癌細胞發(fā)生自噬［29-30］。這些研究表明胺碘酮可能通過凋亡、炎癥、氧化應激促進組織細胞的損傷，胺碘酮作為抗心律失常藥應用于射頻消融圍手術期符合臨床規(guī)范，本團隊前期創(chuàng)新性使用胺碘酮灌注于房顫射頻消融病灶處，發(fā)現(xiàn)可提高術中轉竇率，減少術后復發(fā)［12］，基于這一發(fā)現(xiàn)，結合胺碘酮對組織細胞的毒性作用，我們推斷其原因可能為胺碘酮在RF術中的灌注應用導致消融點之間的心房肌組織損傷加重從而達到更有效的肺靜脈隔離，本研究用動物心房肌細胞加熱加藥模型模擬RF聯(lián)合應用胺碘酮探索損傷變化，預實驗用0、3、10、30、60、90 μmol/L等不同濃度的胺碘酮干預后測定細胞存活率變化，發(fā)現(xiàn)6個濃度梯度下的胺碘酮溶液均可降低心肌細胞存活率，最終選用降低25%細胞存活率的30 μmol/L胺碘酮濃度作為后續(xù)實驗條件，加入胺碘酮溶液后的心房肌細胞存活率進一步下降，SOD活性進一步下降，凋亡率進一步增加，炎癥因子、丙二醛進一步增加，說明胺碘酮促進了熱損傷引起的小鼠心房肌細胞凋亡、炎癥和氧化應激的發(fā)生。此結果亦符合前述胺碘酮促進組織細胞損傷增加的既往研究。

本實驗的加熱條件52 ℃未造成細胞全數(shù)死亡，僅造成約25%的細胞活性下降，模擬了臨床上射頻消融治療時消融點之間不完全損傷的受熱環(huán)境，本研究中將胺碘酮加入水浴加熱的心房肌細胞模擬了臨床上心房射頻消融術中經大頭導管灌注胺碘酮的應用。胺碘酮促進加熱后小鼠HL1心房肌細胞的凋亡、炎癥反應和氧化應激。此為本實驗的創(chuàng)新發(fā)現(xiàn)?？赡転榘返馔岣叻啃钥焖傩孕穆墒СＩ漕l消融手術效率提供了細胞層面的依據(jù)，也引發(fā)了射頻消融可聯(lián)合灌注不同藥物從而改善手術效率的思考與探索。

綜上所述，本研究揭示了熱處理可誘導小鼠HL1心房肌細胞的凋亡、炎癥、氧化應激的表達，胺碘酮可通過促進凋亡、炎癥、氧化應激從而加重熱處理造成的細胞損傷。我們首次揭示胺碘酮對熱處理的心房肌細胞有促損傷作用，但促進細胞損傷的具體機制有待進一步研究。盡管本研究采用體外水浴加熱的方法較好地模擬了熱消融術中消融點之間的亞致死性高熱區(qū)損傷，但是，研究對象小鼠HL1心房肌細胞卻脫離了體內環(huán)境。在細胞水平上探索得到的作用效果與動物實驗及臨床實踐尚存在一定差距。因此，胺碘酮對射頻消融心房肌組織的影響及其作用機制仍需結合臨床及動物實驗進行深入研究。