葛鑫宇，郭 芳，范 俊，陳寶田，于 林，任 靜，李紀(jì)強(qiáng)，盧成林，莫嘉文，李樹基，袁樂欣，胡號應(yīng)，劉 赟，周 曉，崔 娟，朱志敏，曹 雄

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 廣州510515；2精神健康研究教育部重點實驗室//粵港澳大灣區(qū)腦科學(xué)和類腦研究中心//廣東省重大精神疾病重點實驗室//南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，廣東廣州510515；3南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 廣州510515；4南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院放療科，廣東 廣州510282

抑郁癥是一種常見精神疾病，全世界現(xiàn)有超過2.6億人受到抑郁癥的困擾，已成為一個嚴(yán)重的公共健康問題［1］。單胺假說是現(xiàn)在抑郁癥的主要學(xué)說，據(jù)此開發(fā)的藥物在改善抑郁癥狀方面取得了較好的療效，但這些抗抑郁藥物起效慢，有效率低，并伴有嚴(yán)重的副作用。因此，尋找和研發(fā)抗抑郁新藥是當(dāng)今抑郁癥研究的重大科學(xué)問題之一［2］。

神經(jīng)元突觸可塑性是抑郁癥發(fā)生及抗抑郁效應(yīng)的重要的機(jī)制之一?，F(xiàn)有研究提示突觸可塑性與抑郁癥病理機(jī)制密切相關(guān)［3-6］。此外，臨床抗抑郁藥可增強(qiáng)成年海馬突觸可塑性及神經(jīng)發(fā)生［7-9］。已發(fā)表研究表明，沉默調(diào)節(jié)蛋白1（sirt1）-p53信號通路在抑郁發(fā)生和突觸可塑性中扮演著重要的角色。遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)中國女性重度抑郁癥患者SIRT1基因位點突變［10］。在大腦中，上調(diào)神經(jīng)元sirt1的表達(dá)可促進(jìn)神經(jīng)元突觸可塑性相關(guān)基因表達(dá)［11-12］；p53是sirt1的重要下游信號通路，在神經(jīng)元凋亡、萎縮、損傷中發(fā)揮重要作用［13］。

中醫(yī)已被世界衛(wèi)生組織納入《第11版國際疾病分類規(guī)則》，并作為治療指導(dǎo)意見［14］。中醫(yī)藥可能是抗抑郁藥物研發(fā)的寶庫。柴胡桂枝湯最早記載于《傷寒論》，現(xiàn)用于抑郁癥臨床治療。我們前期已發(fā)表工作表明柴胡桂枝湯在臨床抑郁癥治療中有顯著的抗抑郁作用，但其機(jī)制不清楚［15-16］。柴胡桂枝湯在改善抑郁癥患者癥狀有較為明顯的作用，在嚙齒類動物研究中，已有文章報道柴胡桂枝湯在強(qiáng)迫游泳實驗和懸尾實驗中，可減少小鼠的不動時間；但該文章未使用經(jīng)典抑郁模型證明柴胡桂枝湯的抗抑郁效果；且未對其可能的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究和探討。在本研究中，我們使用多種動物行為學(xué)實驗評估柴胡桂枝湯的抗抑郁樣作用；并探討了柴胡桂枝湯通過sirt1-p53調(diào)節(jié)突觸可塑性發(fā)揮抗抑郁樣效應(yīng)的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 藥物

柴胡桂枝湯記載于《傷寒論》，處方藥材組成具體為：柴胡、黃芩、半夏、黨參、生姜、大棗、甘草、桂枝、白芍、龍骨、牡蠣、酸棗仁、合歡皮、遠(yuǎn)志、夜交藤。實驗中使用各藥材粉末狀沖劑，是華潤三九醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化柴胡桂枝湯中藥配方顆粒，混合沖泡后，儲存于4 ℃冰箱，供后續(xù)實驗使用。

1.2 動物

實驗使用動物為成年雄性C57BL/6J小鼠（8～10周，20～25 g），采購于南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，以每籠3～4只的密度飼養(yǎng)于24±1 ℃、濕度為50%～70%的通氣排風(fēng)籠具系統(tǒng)（EVC）。小鼠安置于標(biāo)準(zhǔn)實驗室條件，采用12 h光暗循環(huán)（早上8點到晚上8點開燈），并提供充足的食物和水。所有實驗方案經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)，在《實驗動物管理條例》指導(dǎo)下進(jìn)行。

實驗小鼠分為柴胡桂枝湯給藥組及溶劑對照組：柴胡桂枝湯組（CGD）小鼠接受柴胡桂枝湯灌胃給藥，藥物濃度為17 g·kg-1·d-1；溶劑對照組（Vehicle）小鼠接受藥物溶劑灌胃給藥。在慢性社會挫敗應(yīng)激模型（CSDS）和社會交互實驗（SI）實驗中，造模和對照小鼠分別接受柴胡桂枝湯或溶劑灌胃7 d，具體分組為：CSDS+柴胡桂枝湯組（CSDS+CGD，17 g·kg-1·d-1）、CSDS+溶劑組（CSDS+vehicle）、Con+柴胡桂枝湯組（Con+CGD，17 g·kg-1·d-1）、Con+溶劑組（Con+vehicle）。

小鼠均首先進(jìn)行7 d的灌胃給藥，給藥后再依次進(jìn)行抑郁模型造模及行為學(xué)檢測。

1.3 行為學(xué)實驗

1.3.1 強(qiáng)迫游泳實驗 強(qiáng)迫游泳實驗采用圓柱形透明玻璃缸（高45 cm，直徑19 cm），玻璃缸中裝入清水，水深23cm，水溫22～25℃。整個實驗過程持續(xù)6min。實驗時，首先將小鼠放入玻璃缸中，并使用EthovisionXT（Noldus,USA）軟件記錄、分析小鼠在后4 min內(nèi)的不動時間。

1.3.2 曠場實驗 曠場實驗采用Versmax記錄、分析系統(tǒng)，曠場規(guī)格為40×40×30 cm。將小鼠放置在曠場中央，使用Versmax系統(tǒng)記錄小鼠自由運動探索5 min的運動距離和站立次數(shù)。

1.3.3 高架十字迷宮實驗 高架十字迷宮實驗由兩個相對的開放臂（30×5×0.5 cm）和封閉臂（30×5×15 cm）組成，通過一個中央平臺（5×5 cm）連接，呈十字狀，離地面80 cm。小鼠在實驗房間中適應(yīng)30 min后，進(jìn)行高架十字迷宮試驗。將小鼠放置于中央平臺，使用Ethovision XT（Noldus,USA）軟件記錄分析小鼠5 min內(nèi)在開放臂和封閉臂上的停留時間。

1.3.4 新環(huán)境壓抑進(jìn)食實驗 新環(huán)境壓抑進(jìn)食實驗采用40×40×30 cm的方形曠場。在曠場中心放置糖丸，實驗開始時，將小鼠放入其中一角，使用Ethovision XT（Noldus,USA）系統(tǒng)記錄5 min內(nèi)小鼠在新環(huán)境中首次抱起糖丸進(jìn)食的時間（潛伏期）。實驗結(jié)束后，將小鼠放回原籠中，記錄5 min內(nèi)的進(jìn)食量，檢測小鼠食欲。

1.3.5 慢性社會挫敗應(yīng)激模型 根據(jù)Berton等《Nature Protocols》及我們已發(fā)表工作中慢性社會挫敗應(yīng)激模型的實驗步驟［17-18］，現(xiàn)簡述如下：實驗中使用的雄性CD1退役種鼠購自北京查爾斯河實驗室，單籠飼養(yǎng)，使其產(chǎn)生領(lǐng)地意識，具有強(qiáng)烈的攻擊行為。造模開始時將雄性C57BL/6J小鼠（8 w）放入CD1鼠籠中，CD1鼠猛烈攻擊C57BL/6J鼠；10 min后實驗人員終止實驗；使用透明帶氣孔隔板分隔CD1鼠和C57BL/6J鼠，兩鼠在該鼠籠中相處24 h。在此期間C57BL/6J小鼠可看到和嗅到CD1鼠，并受到CD1鼠騷擾，從而進(jìn)一步產(chǎn)生心理應(yīng)激。24 h后，將C57BL/6J鼠放入另一CD1鼠籠中，攻擊10 min，又共處24 h。這個實驗過程重復(fù)10 d。對照組小鼠每隔24 h更換與其配對飼養(yǎng)的小鼠，使其與不同的小鼠配對飼養(yǎng)。造模結(jié)果使用社會交互實驗進(jìn)行檢測。

1.3.6 社會交互實驗 在慢性社會挫敗應(yīng)激模型造模24 h后，使用社會交互實驗檢測C57BL/6J鼠抑郁樣狀態(tài)［18］。本實驗檢測盒制作材料為無味白色有機(jī)玻璃板，大小為：40 cm×40 cm×30 cm,在檢測盒一邊設(shè)置交互區(qū)，大小為24 cm×14 cm；交互區(qū)內(nèi)放置一個透明帶氣孔有機(jī)玻璃方盒，用于放置CD1鼠。本試驗進(jìn)行兩次檢測，第1 次實驗交互區(qū)不放入CD1 鼠，使用Ethovision XT（Noldus,USA）軟件記錄2.5 min內(nèi)小鼠在交互區(qū)停留的時間。第2次檢測，在交互區(qū)的透明帶氣孔有機(jī)玻璃方盒中放入CD1鼠，再次記錄C57BL/6J鼠在2.5 min內(nèi)在交互區(qū)停留的時間。

1.4 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)

本實驗取小鼠海馬組織，參照RNA提取說明書，使用TRIzol（TaKaRa）提 取 海 馬 組 織 的RNA，使 用PrimeScriptTMⅡ1鏈cDNA合成試劑盒（TaKaRa）將提取獲得的RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；使用SYBR Green PCR Master Mix（TaKaRa）進(jìn)行實時定量PCR。PCR循環(huán)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性（2 min）、94 ℃變性（30 s）、60 ℃退火（30 s）、72 ℃延伸（30 s），重復(fù)40個循環(huán)。獲取分析CT值，計算樣本2-△△CT，相照內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。本實驗檢測突觸可塑性相關(guān)蛋白synapsin I，Rab，SNAP25，Tubb的mRNA水平，本研究使用的引物如表1。

表1 用于qRT-PCR的引物序列Tab.1 Sequence of primers used in quantitative real-time PCR

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡實驗

本實驗使用RIPA提取大腦海馬組織蛋白，并使用BCA 試劑盒（Pierce）測定蛋白濃度；使用10% SDSPAGE 膠電泳分離等量蛋白樣品，然后將蛋白轉(zhuǎn)入PVDF膜（Millipore）；使用5%脫脂奶粉封閉1 h后，一抗4 ℃孵育過夜；然后孵育1 h 二抗；化學(xué)發(fā)光試劑盒（Pierce）檢測印跡。具體抗體：sirt1（1∶1000，Abclone 8469），P53(1∶1000，Abcam ab26），Acetylation-p53（1∶1000，Abcam ab183544），GAPDH（1∶1000，銳抗生物RM2002），Goat-anti mouse（1∶5000，銳 抗 生 物RM3001），Goat-anti rabbit（1∶2000，銳抗生物RM3002）。

1.6 統(tǒng)計分析

數(shù)值資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析或雙因素方差分析（ANOVA）比較各組間的統(tǒng)計差異，采用Bonferroni或Fisher LSD對各組間的多重比較檢驗，或采用非配對t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)檢測柴胡桂枝湯對小鼠抑郁樣行為、焦慮樣行為和運動能力的作用

使用成年雄性C57BL/6J鼠，連續(xù)7 d灌胃柴胡桂枝湯或藥物溶劑，并進(jìn)行相關(guān)行為學(xué)檢測（圖1A）。在強(qiáng)迫游泳實驗中，柴胡桂枝湯組小鼠的不動時間顯著減少（兩樣本非配對t檢驗，P＜0.05，n=12/14，圖1B）。在高架十字迷宮實驗中，柴胡桂枝湯組與對照組小鼠在開放臂的時間無統(tǒng)計學(xué)差異[F（1,48）=0.0962，P=0.758，n=12/14]（圖1C）。在新環(huán)境壓抑進(jìn)食檢測中，柴胡桂枝湯組與對照組小鼠食用糖丸潛伏期（兩樣本非配對t檢驗，P=0.797,n=8/9）和食欲（非配對t檢驗，P=0.842，n=8/9）均無明顯差異（圖1D）。在曠場實驗中，柴胡桂枝湯組與對照組沒有顯著性差異[非配對t檢驗，P=0.560（總運動距離），P=0.953（站立次數(shù)），n=12/14]（圖1E）。

2.2 柴胡桂枝湯降低小鼠在慢性社會失敗應(yīng)激模型中的抑郁敏感性

圖1 柴胡桂枝湯對小鼠抑郁樣行為、焦慮樣行為和運動能力的作用Fig.1 CGD produces antidepressant effect in mice in FST. A: Schematic representation of the behavioral tests. B: Immobility time of the C57BL/6J mice treated with CGD (n=12) or vehicle (n=14) in FST (P＜0.05). C: Time spent in the open and closed arms of CGD(n=12)and vehicle(n=12)groups in the EPM.F(1,48)=0.09622,P=0.758.D:Latency(P=0.797)to feed(P=0.842)and food consumption in the NSF test in CGD group(n=8)and vehicle group(n=9).E:Open field test in CGD(n=12)and vehicle(n=12)groups.P=0.560(total distance),P=0.9529(No.of standing).Data are presented as Mean±SE.*P＜0.05.

采用經(jīng)典抑郁模型——慢性社會失敗應(yīng)激模型進(jìn)一步明確柴胡桂枝湯在抑郁模型中的作用（圖2A）。成年雄性C57BL/6J鼠經(jīng)過連續(xù)7 d柴胡桂枝湯或藥物溶劑灌胃，再經(jīng)過10 d CSDS造模后進(jìn)行社會交互實驗的檢測，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)CSDS+vehicle組小鼠在交互區(qū)停留的時間顯著減少；而CSDS+CGD組在交互區(qū)停留的時間無明顯降低，[藥物×CSDS 交互作用F（1, 29）=7.475，P=0.011]（圖2B）。然而，當(dāng)交互區(qū)無CD1鼠時，CSDS+CGD組和CSDS+vehicle組小鼠在交互區(qū)的停留時間均無明顯差異[藥物×CSDS 交互作用F（1,29）=0.5982，P=0.4455]（圖2C）。柴胡桂枝湯處理對動物體質(zhì)量無明顯改變[非配對t檢驗，P=0.370（給藥前體質(zhì)量），P=0.972（給藥后體質(zhì)量），n=16]（圖2D）。

2.3 柴胡桂枝湯調(diào)控sirt1-p53信號通路及突觸可塑性基因的表達(dá)

與溶劑對照組相比，柴胡桂枝湯組sirt1蛋白表達(dá)水平顯著增加（非配對t檢驗，P＜0.05，每組n=6）（圖3A、B）；sirt1下游蛋白p53的總體水平?jīng)]有變化，但p53乙?；矫黠@下降[非配對t檢驗，P=0.931（總P53）、P＜0.05（乙?；疨53），每組n=4]（圖3C、D）。

與溶劑對照組相比，柴胡桂枝湯組海馬組織中的突觸可塑性基因Syn1 mRNA水平顯著升高（非配對t檢驗，P＜0.01，n=7/8）（圖4A）；而Rab4B、SNAP25和Tubulin beta4b沒有顯著性差異[非配對t檢驗，P=0.813（Rab），P=0.820（SNAP），P=0.864（Tubb），n=6～8]（圖4B～D）。

3 討論

目前臨床常用的抗抑郁藥主要是基于單胺假說開發(fā)的藥物，已取得了較好的治療效果。但現(xiàn)有藥物也具有起效慢、有效率低、副作用大和復(fù)發(fā)率高等不足。因此，有必要探索新的抑郁發(fā)生機(jī)制及抗抑郁新方法。中醫(yī)學(xué)和中藥已被納入最新版（第11版）《國際疾病分類》［14］，是抑郁癥治療的有益補(bǔ)充。我們研究發(fā)現(xiàn)柴胡桂枝湯通過海馬sirt1-p53信號通路調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸可塑性產(chǎn)生抗抑郁樣作用，為柴胡桂枝湯作為抗抑郁藥的臨床使用提供了理論依據(jù)。

我們已發(fā)表臨床研究表明，柴胡桂枝湯可改善抑郁癥患者的癥狀，具有顯著的抗抑郁作用［19］，但其抗抑郁機(jī)制仍不清楚。在嚙齒類動物研究中，已有文章報道柴胡桂枝湯在強(qiáng)迫游泳實驗和懸尾實驗中，可減少小鼠的不動時間；但該文章未使用經(jīng)典抑郁模型證明柴胡桂枝湯的抗抑郁效果；且未對其可能的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究和探討［20］。我們研究發(fā)現(xiàn)柴胡桂枝湯灌胃7 d后（17 g·kg-1·d-1），小鼠在強(qiáng)迫游泳實驗的不動時間顯著縮短，具有抗抑郁效應(yīng)。我們進(jìn)一步使用了慢性社會失敗應(yīng)激模型驗證柴胡桂枝湯的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)柴胡桂枝湯可顯著增加動物在社會交互區(qū)的停留時間，逆轉(zhuǎn)慢性社會失敗應(yīng)激模型引起的抑郁樣表型。以上多種動物行為學(xué)結(jié)果證明了柴胡桂枝湯在動物模型中的抗抑郁作用。

圖2 柴胡桂枝湯降低小鼠在慢性社會失敗應(yīng)激模型中的抑郁敏感性Fig.2 CGD attenuates susceptibility of mice to chronic social stress. A: Schematic of the CSDS model and social interaction test. B, C: Time in the interaction zone of the CGD and vehicle-treated mice in the conditions of CD1 target and no target.Two-way ANOVA.(In B,medicine×CD1 interaction F(1,29)=7.475,P=0.011); n=8 for CSDS+CGD, n=11 for CSDS+Vehicle, n=8 for Con+CGD, and n=6 for Con+Vehicle. In C,medicine×CD1 interaction F(1, 29)=0.5982, P=0.4455) followed by Bonferroni post hoc test for multiple comparisons; **P＜0.01; ***P＜0.001. D: Body weight before and after intragastric administration. P=0.370(before),P=0.972(after)(n=16).Data are presented as Mean±SE.**P＜0.01;***P＜0.001.

圖3 柴胡桂枝湯對小鼠海馬腦區(qū)sirt1/p53-AC蛋白表達(dá)的作用Fig.3 CGD alters sirt1/p53-AC levels in the hippocampus of mice. A, B: Western blotting of sirt1 protein and quantitative results in CGD and vehicle-treated groups (n=6; P＜0.05). C-E: Western blotting of acetylated p53 (P＜0.05) and p53 (P=0.931)protein levels(n=4).Data are presented as Mean±SE.*P＜0.05.

sirt1是一種去乙?；?，具有高度保守、NAD+依賴性的特點，參與神經(jīng)元樹突分支形成和正常功能的維持［21-22］。SIRT1是首次發(fā)現(xiàn)的中國漢族女性抑郁癥易感基因［10］。在sirt1神經(jīng)元敲除鼠中，樹突長度減少、分支復(fù)雜度降低，突觸可塑性相關(guān)基因發(fā)生改變［23］。使用腺病毒上調(diào)神經(jīng)元sirt1的表達(dá)可促進(jìn)突觸可塑性相關(guān)基因表達(dá)，并在行為學(xué)實驗中產(chǎn)生抗抑郁樣作用［24-25］。此外，已有研究報道sirt1調(diào)控p53、Nrf2、NLRP3、FOX1等胞內(nèi)信號通路［26-27］。其中p53是sirt1的重要下游信號通路，活性形式為乙酰化p53蛋白；具有促進(jìn)細(xì)胞衰老的作用，在神經(jīng)元凋亡、萎縮、損傷中發(fā)揮重要作用［13］。在本研究中，我們使用蛋白質(zhì)免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)，C57BL/6J小鼠接受7 d柴胡桂枝湯灌胃給藥后，其海馬組織內(nèi)sirt1蛋白表達(dá)水平上調(diào)；sirt1信號通路下游蛋白p53的乙?；较抡{(diào)。這些結(jié)果提示柴胡桂枝湯具有上調(diào)sirt1表達(dá)的作用，其可能通過sirt1-p53信號通路參與抗抑郁樣效應(yīng)。

圖4 柴胡桂枝湯對小鼠海馬腦區(qū)Syn、Rab、SNAP、Tubb mRNA表達(dá)的作用Fig.4 CGD alters synaptic function-related genes in the hippocampus of CGD and vehicle-treatedgroups.A: Expression of Syn mRNA in CGD (n=7) and vehicle-treated (n=8) groups (P＜0.05). B-D: Expressions of Rab, SNAP and Tubb mRNA (P=0.813,0.820,and 0.864,respectively;n=6).**P＜0.01.

在海馬、前額皮層等腦區(qū)，突觸可塑性異常與抑郁發(fā)生密切相關(guān)［3］。突觸蛋白-1（syn1）、RAB4B、突觸小體相關(guān)蛋白（SNAP 25）和β-微管蛋白4b（Tubulin beta 4b）是突觸可塑性的標(biāo)志蛋白，參與突觸可塑性［28-32］。在本研究中，柴胡桂枝湯灌胃后，海馬組織syn1的mRNA水平顯著升高，其他三種mRNA無顯著性變化，提示柴胡桂枝湯可促進(jìn)神經(jīng)元突觸Syn1的表達(dá)，調(diào)控突觸可塑性，進(jìn)而產(chǎn)生抗抑郁樣效應(yīng)。

綜上所述，我們的研究結(jié)果證明柴胡桂枝湯在動物抑郁模型中具有抗抑郁樣作用，其可能通過海馬sirt1-p53信號通路調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸可塑性，進(jìn)而產(chǎn)生抗抑郁樣作用。我們的發(fā)現(xiàn)為柴胡桂枝湯作為抗抑郁藥的使用提供了依據(jù)。然而，目前我們還不清楚柴胡桂枝湯中的哪些化合物產(chǎn)生的抗抑郁作用。我們將分離提取柴胡桂枝湯的活性成分，并使用多種抑郁模型測試其活性成分的抗抑郁作用。