王 冰，黃啟林，李 帥，吳 俊，原小惠，孫紅玉，湯禮軍

1西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都610063；2西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院全軍普通外科中心//四川省胰腺損傷與修復(fù)重點實驗室，四川 成都610083

重癥急性胰腺炎（SAP）是一種具有較高致死性的炎性疾病，亢進(jìn)的炎癥反應(yīng)常導(dǎo)致機(jī)體全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）與多器官功能障礙綜合征（MODS）［1］，包括SAP相關(guān)性腸損傷［2］、肺損傷［3］、腎損傷［4］以及心血管系統(tǒng)損傷［5］等。腸道由于靠近胰腺，容易受到炎癥影響且與疾病的進(jìn)展密切相關(guān)［6］。在SAP早期即出現(xiàn)腸道損傷，導(dǎo)致腸道內(nèi)細(xì)菌和毒性物質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)引起腸源性感染，進(jìn)而加重患者病情且增加病死率［7］，使SAP的治療變得復(fù)雜。目前國內(nèi)外相對公認(rèn)的是采取分階段、多學(xué)科、升階梯的策略［8-9］，而針對SAP相關(guān)性腸損傷的治療局限于腸內(nèi)、腸外營養(yǎng)［10］，積極預(yù)防SAP相關(guān)性腸損傷的發(fā)生或減輕其程度是SAP治療中的重要環(huán)節(jié)。因此，探討SAP相關(guān)性腸損傷的發(fā)病機(jī)制對于開發(fā)改善腸道損傷的治療新策略具有重要意義。

鳥苷酸環(huán)化酶C（GC-C）是位于腸道上皮細(xì)胞胞膜上的跨膜受體，受內(nèi)源性配體激活后引起細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)升高進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［11］。GC-C因在調(diào)節(jié)水電解質(zhì)平衡［12-13］、維持腸屏障完整性［14］、控制炎癥反應(yīng)［15］、緩解腹痛［16］及調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)［17］等方面具有重要作用，近來被視為腸道疾病的新型治療靶點［18］。研究表明［19-20］，GC-C可通過調(diào)控腸上皮緊密連接蛋白（TJP）的表達(dá)來維持腸屏障功能的穩(wěn)定，還可通過影響NF-?B信號通路來緩解機(jī)體炎癥反應(yīng)［22］，而嚴(yán)重的腸損傷和持續(xù)的炎癥反應(yīng)都是加速SAP進(jìn)展的重要因素。目前，對于GC-C在SAP相關(guān)性腸損傷中的變化規(guī)律及作用尚不清楚，缺乏相關(guān)研究。基于此，我們旨在觀察GC-C在SAP相關(guān)性腸損傷中的作用，并探究GC-C與SAP相關(guān)性腸損傷嚴(yán)重程度之間的關(guān)系，希望以此能為開發(fā)SAP治療新靶點提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和主要實驗試劑

8周齡雄性SPF級SD大鼠（200～220 g）54只分批購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司。?；悄懰徕c（Sigma）。大鼠血清淀粉酶、二胺氧化酶、D-乳酸酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（建成生物），腫瘤壞死因子α ELISA試劑盒（華美生物）。全蛋白提取試劑盒（強）（索萊寶）。Trizol試劑（Invitrogen）。BCA蛋白定量試劑盒（博士德）?？笹C-C（ab225864）單克隆抗體、抗緊密連接蛋白Claudin-1抗體（ab15098）（Abcam）。GC-C激動劑利那洛肽（Linaclotide）（MedChem Express）。GC-C與GAPDH引物由成都高新區(qū)博瑞生物試劑耗材商貿(mào)部合成。吸入性麻醉劑異氟烷（瑞沃德）。

1.2 動物分組及模型制備

1.2.1 SAP建模 將36只SD大鼠于IVC籠具中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，給予12 h晝夜交替光照，術(shù)前禁食12 h，可自由飲水，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（SO組）和重癥急性胰腺炎組（SAP組），每組18只。所有大鼠實驗操作均采用異氟烷進(jìn)行吸入性麻醉。SO組大鼠麻醉后，開腹僅翻動胰腺數(shù)次后關(guān)腹。SAP組大鼠麻醉后，開腹沿十二指腸尋找胰膽管開口處，經(jīng)胰膽管逆行注射5%牛磺膽酸鈉（0.1 mL/100 g）誘導(dǎo)SAP。所有實驗過程均符合單位和國家有關(guān)實驗動物管理和使用的規(guī)定。

1.2.2 GC-C變化規(guī)律及干預(yù)時間節(jié)點選取 將上述實驗大鼠再次按照隨機(jī)數(shù)字表法分為12 h組，24 h組和48 h組，每組6只，于建模后12、24、48 h分批處死，收集胰腺與升結(jié)腸組織。經(jīng)免疫蛋白印跡實驗、免疫組織化學(xué)實驗和RT-PCR實驗明確GC-C在SAP相關(guān)性腸損傷中的變化規(guī)律，將GC-C在SAP相關(guān)性腸損傷中表達(dá)最低的時間點作為腸損傷最嚴(yán)重的大概時間點，即干預(yù)的時間節(jié)點。

1.2.3 干預(yù)實驗分組 將18只SD大鼠于IVC籠具中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，給予12 h晝夜交替光照，術(shù)前禁食12 h，可自由飲水，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為SO組、SAP組和Linaclotide組，每組6只。SAP組和SO組建模方法同前。Linaclotide組大鼠麻醉后，首先通過胰膽管逆行注射5%?；悄懰徕c（0.1 mL/100 g）誘導(dǎo)SAP，還原腸管逐層關(guān)腹，待大鼠蘇醒后立即灌胃GC-C激動劑利那洛肽（Linaclotide）水溶液（10 μg/kg/d）1次進(jìn)行干預(yù)，于GCC在SAP相關(guān)性腸損傷中表達(dá)最低的時間點進(jìn)行標(biāo)本收集。

1.3 標(biāo)本采集

于建模后12、24、48 h分批采用異氟烷麻醉SD大鼠，開腹后經(jīng)腹主動脈采血，收集胰腺與升結(jié)腸組織。動脈血靜置30min后離心（3500 r/min，5 min），收集上清液置于-80 ℃冰箱中凍存用于后續(xù)生化檢測。取胰腺與升結(jié)腸組織兩份置于凍存管中儲存在-80 ℃冰箱用于組織mRNA和蛋白質(zhì)提取，一份固定于4%中性甲醛中用于病理學(xué)檢測，再一份結(jié)腸組織置于電鏡固定液用于后續(xù)電鏡檢測。

1.4 組織學(xué)評估

胰腺與結(jié)腸組織固定后依次行脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟，最后行蘇木素-伊紅染色，封片后置于配備有數(shù)碼照相系統(tǒng)的Leica DM300光學(xué)顯微鏡下觀察。由病理醫(yī)師在不知道實驗分組的情況下依據(jù)Chiu等［23］報道標(biāo)準(zhǔn)對結(jié)腸病理進(jìn)行評分，依據(jù)Schmidt等［24］報道標(biāo)準(zhǔn)對胰腺病理進(jìn)行評分，每張切片隨機(jī)選取10個視野，取其平均分作為每張切片的最后評分。透射電鏡檢測，將腸道組織置于3%戊二醛預(yù)固定，經(jīng)丙酮脫水后進(jìn)行滲透、包埋、切片、染色，采用H-600IV型透射電鏡進(jìn)行觀察。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）

采用ELISA法測定血清中AMY、DAO、D-Lac與TNF-α的濃度，具體操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.6 免疫蛋白印跡

采用全蛋白提取試劑盒提取大鼠升結(jié)腸組織中蛋白質(zhì)，并用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。在小型凝膠電泳儀（Mini-Protein II,Bio-Rad,Hercules,CA,USA）上通過SDS-PAGE體系分離蛋白質(zhì)，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉后與GC-C（1∶500）單克隆抗體、Claudin-1（1∶1000）反應(yīng)，于4 ℃環(huán)境下孵育過夜。次日用TBST洗滌后與二抗（1∶10000）反應(yīng)1h，采用BioSpectrum4 發(fā)光儀進(jìn)行曝光，以GAPDH為內(nèi)參，使用UVP圖像采集和分析軟件分析蛋白印跡灰度值。

1.7 免疫組織化學(xué)

采用免疫組織化學(xué)方法檢測升結(jié)腸組織中GC-C、Claudin-1的表達(dá)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟對包埋的結(jié)腸組織進(jìn)行切片、脫蠟、抗原修復(fù)與封閉，然后滴加兔抗大鼠GCC（1∶500）、Claudin-1（1∶500）抗體在4 ℃下孵育過夜。次日用PBS液沖洗后滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G，在37 ℃下孵育30min。復(fù)染封片后，在Leica DM300光學(xué)顯微鏡下觀察陽性染色的細(xì)胞并捕獲圖像，用Image-Pro Plus軟件測定累計光密度值（A）。

1.8 RT-PCR檢測

采用Trizol法提取結(jié)腸組織總mRNA，使用Nano-Drop ND-1000 儀（Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA）測定每個樣品的mRNA濃度，以A260/A280值作為mRNA純度指標(biāo)，獲得mRNA的濃度在1.8～2.0。RNA 逆轉(zhuǎn)錄和PCR 擴(kuò)增使用一步法SYBR Prime-Script TM RT-PCR 試劑盒II（Takara）通過C1000 TM Thermal Cycler（Bio-Rad）儀器進(jìn)行檢測。PCR條件如下：在95 ℃下持續(xù)10 min，隨后在95 ℃持續(xù)10 s、60 ℃持續(xù)60 s的條件下進(jìn)行40個PCR循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進(jìn)行分析。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for RT-PCR

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad prism7.0（GraphPad,CA,USA）和SPSS 22.0軟件包（SPSS,IL,USA）進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差顯示。各組間同一指標(biāo)比較采用單因素ANOVA 方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺組織病理學(xué)改變

胰腺組織HE染色結(jié)果顯示，SO組大鼠胰腺腺泡結(jié)構(gòu)規(guī)則，未見明顯異常（圖1A）；SAP組大鼠胰腺表現(xiàn)為小葉間隔的局灶性擴(kuò)張、胰腺小葉水腫、腺泡細(xì)胞大片狀壞死和炎性細(xì)胞大量浸潤（圖1B），胰腺組織病理學(xué)評分與SO組相比顯著升高（P＜0.05，圖1C）。同時，相比SO組，SAP組大鼠血清中淀粉酶濃度顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1D）。

2.2 結(jié)腸組織中GC-C mRNA表達(dá)情況

大鼠結(jié)腸組織中GC-C mRNA在SO組表達(dá)最高，在SAP-12 h組表達(dá)最低（P＜0.05，圖2）。與SO組相比，GC-C mRNA在SAP-12 h組、SAP-24 h組和SAP-48 h組中表達(dá)降低（P＜0.05）。與SAP-12 h組相比，SAP-24 h組和SAP-482 h組結(jié)腸組織中GC-C mRNA表達(dá)水平升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 結(jié)腸組織中GC-C、Claudin-1的表達(dá)情況

GC-C主要表達(dá)于腸上皮細(xì)胞胞膜上，免疫組化染色結(jié)果顯示，SAP-12 h組中GC-C陽性表達(dá)明顯低于SO組、SAP-24 h組和SAP-48 h組（圖3A、C）；免疫蛋白印跡法進(jìn)一步證實，SAP-12 h組結(jié)腸組織中GC-C表達(dá)最低（P＜0.05，3D、E）。Claudin-1為位于腸上皮細(xì)胞外側(cè)膜上的帶狀結(jié)構(gòu)，免疫組化染色結(jié)果顯示SAP-12 h組中Claudin-1陽性表達(dá)低于其余組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3B、C）。

2.4 結(jié)腸組織病理學(xué)改變

結(jié)腸組織HE染色結(jié)果顯示，SO組大鼠腸道粘膜連續(xù)，間質(zhì)未見明顯炎性細(xì)胞浸潤；SAP-12 h組大鼠腸道粘膜表現(xiàn)為不同程度的斷裂、缺損，間質(zhì)水腫并伴有炎性細(xì)胞浸潤，黏膜肌層形態(tài)欠規(guī)整，組織病理學(xué)評分相比SO組顯著升高（P＜0.05）；Linaclotide組結(jié)腸粘膜缺損、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤程度均較SAP-12 h組好轉(zhuǎn)，病理學(xué)評分降低（P＜0.05，圖4A、B）。相比SO組，SAP-12 h組血清中TNF-α、DAO、D-Lac濃度顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而Linaclotide組血清中上述各分子表達(dá)水平均低于SAP-12 h組（P＜0.05，圖4C～E）。

2.5 Linaclotide組結(jié)腸組織中GC-C、Claudin-1的表達(dá)情況

各組建模成功后12 h收集結(jié)腸組織，免疫組化染色結(jié)果顯示，Linaclotide組中GC-C、Claudin-1陽性表達(dá)高于SAP-12 h組（P＜0.05，圖5A、B、D）；免疫蛋白印跡法結(jié)果進(jìn)一步證實，在建模后12 h SAP組結(jié)腸組織中GC-C、Claudin-1 表達(dá)低于SO 組和Linaclotide 組，而Linaclotide組中GC-C、Claudin-1表達(dá)較SAP-12 h組升高（P＜0.05，圖5E、F）。腸道透射電鏡結(jié)果顯示，SO組腸道上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞間隙可見正常連續(xù)的細(xì)胞間緊密連接，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰正常；SAP-12 h組可見細(xì)胞間緊密連接嚴(yán)重缺失，線粒體腫脹；Linaclotide組可見少數(shù)緊密連接存在（圖5C）。

圖1 各組大鼠胰腺組織病理學(xué)檢查及血清淀粉酶活性Fig.1 Pathological examination of rat pancreatic tissue and serum amylase activity in each group.A:HE staining of pancreatic tissue in SO group(Scale bar=100 μm).B:HE staining of pancreatic tissue in SAP group (Scale bar=100 μm). C: Histological score of pancreatic tissue. D: Serum Amylase activity.***P＜0.001 vs SO group.

圖2 大鼠結(jié)腸組織中GC-C mRNA的表達(dá)情況Fig.2 GC-C mRNA expression in rat colon tissue.**P＜0.01 vs SO group,##P＜0.01 vs SAP-12 h group.

3 討論

SAP在世界范圍內(nèi)都是一種高發(fā)病率、高入院率和高死亡率的消化系統(tǒng)疾病，器官衰竭是疾病嚴(yán)重程度的主要決定因素，也是患者早期死亡的主要原因［25］。而腸道損傷被認(rèn)為是MODS的始發(fā)事件［26］。SAP早期的炎癥級聯(lián)反應(yīng)、微循環(huán)障礙以及缺血再灌注都會對腸屏障造成損傷［27-29］。此外，一項研究表明［30］，靜脈輸注腸缺血大鼠的腸系膜淋巴液會加重胰腺炎嚴(yán)重程度,突出腸道在SAP發(fā)病機(jī)理中的重要作用，針對SAP相關(guān)性腸損傷的研究可能為探究SAP潛在治療新靶點提供理論支撐。

在本研究中，我們采用5%?；悄懰徕c經(jīng)胰膽管逆行注射誘發(fā)SAP，該造模方法已得到廣泛認(rèn)可。相比SO組，SAP組各時間點血清中促炎因子和淀粉酶濃度均顯著升高；此外，胰腺組織表現(xiàn)出更加明顯的組織水腫、腺泡細(xì)胞壞死和炎性細(xì)胞浸潤，表明SAP大鼠模型誘導(dǎo)成功。同時，與SO組相比，SAP組結(jié)腸組織表現(xiàn)為粘膜不同程度斷裂缺失、間質(zhì)水腫、炎性細(xì)胞浸潤，腸道病理損傷評分與血清DAO、D-Lac濃度顯著升高，提示SAP伴有明顯腸道損傷。

SAP相關(guān)性腸損傷主要表現(xiàn)為腸屏障功能的破壞以及炎性反應(yīng)的激活。腸屏障由腸道上皮細(xì)胞、細(xì)胞間緊密連接、菌膜、腸上皮黏液層以及腸道相關(guān)淋巴組織構(gòu)成［31］。其中，細(xì)胞間緊密連接對腸屏障功能影響最大，為位于腸道上皮細(xì)胞外膜頂端的狹長帶狀結(jié)構(gòu)，可以緊密封閉細(xì)胞間隙。完整的腸屏障可有效阻隔腸道中微生物和內(nèi)毒素進(jìn)入血液循環(huán)避免引起腸源性感染。研究表明［32］，GC-C可通過影響腸上皮細(xì)胞TJP的表達(dá)來維持腸屏障功能的完整。在GC-C敲低小鼠中，發(fā)現(xiàn)腸道上皮細(xì)胞通透性增高是由于GC-C信號的丟失導(dǎo)致腸上皮中肌球蛋白輕鏈激酶過度磷酸化，進(jìn)而破壞腸道組織中緊密連接蛋白的組裝，從而減少Claudin-2和黏附分子A的表達(dá)水平［21］。Lin等［33］通過體內(nèi)與體外實驗證實，GC-C調(diào)節(jié)腸道粘膜完整性與Claudin-2和Claudin-4的表達(dá)增加密切相關(guān)。在本研究中，我們通過免疫蛋白印跡、免疫組織化學(xué)及RT-PCR明確GC-C在SAP相關(guān)性腸損傷中的變化規(guī)律。實驗結(jié)果表明，GC-C在SAP-12 h組中表達(dá)顯著低于SO組、SAP-24 h組和SAP-48 h組，在SAP-24 h組中的表達(dá)低于SAP-48 h組，呈現(xiàn)出先下降后逐漸恢復(fù)的趨勢。腸道免疫組織化學(xué)結(jié)果同樣證實了該趨勢。提示GC-C與SAP相關(guān)性腸損傷的嚴(yán)重程度具有相關(guān)性，GC-C于建模后12 h表達(dá)最低，是腸損傷最嚴(yán)重的大概時間點。此外，我們發(fā)現(xiàn)與SO組相比，Claudin-1在SAP-12 h組中陽性表達(dá)低于其余組，但SAP-24 h組和SAP-48 h組組間差異不明顯。更重要的是，我們發(fā)現(xiàn)GC-C與Claudin-1具有相似的變化趨勢。因此，通過給予SAP大鼠灌胃GC-C激動劑Linaclotide來干預(yù)，并選擇在建模后12 h收集組織標(biāo)本進(jìn)行檢測，實驗結(jié)果表明，Linaclotide 組結(jié)腸組織中GC-C和Claudin-1的表達(dá)較SAP組升高，表明激活GC-C可能通過調(diào)節(jié)Claudin-1的表達(dá)來影響腸屏障的功能完整性。有研究發(fā)現(xiàn)GC-C維持腸上皮穩(wěn)態(tài)是通過與受體結(jié)合后升高胞內(nèi)cGMP進(jìn)而抑制AKT磷酸化來實現(xiàn)［34］，也有研究表明胞內(nèi)升高的cGMP可通過影響PKG II的活性，進(jìn)一步調(diào)節(jié)TJP的表達(dá)來影響腸屏障完整性［18］。那么在SAP相關(guān)性腸損傷中GC-C是如何影響Claudin-1的表達(dá)來維持腸屏障的完整還需要我們進(jìn)一步證實。以上研究表明GC-C在維持腸屏障功能完整性上具有重要作用，并有望成為由于腸道高通透性致病的治療靶點。

圖4 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)檢查及血清DAO、D-Lac、TNF-α活性Fig.4 Pathological examination of rat colon tissue and serum DAO,D-Lac,and TNF-α activity in each group.A: HE staining of colon tissue in each group (Scale bar=100 μm). B: Histological score of colon tissue. C: Serum content of TNF-α in each group. D: Serum content of DAO in each group. E: Serum content of D-Lac in each group.**P＜0.01,***P＜0.001 vs SO group,##P＜0.01 vs SAP-12 h group.

SAP相關(guān)性腸損傷的另一表現(xiàn)是炎癥反應(yīng)的激活。近年來，一些研究表明GC-C/cGMP信號傳導(dǎo)通路還與機(jī)體炎癥調(diào)節(jié)有關(guān)。在炎癥早期階段，GC-C的缺失會加速炎癥性腸?。↖BD）的病情進(jìn)展［35］。在炎性反應(yīng)中，絕大多數(shù)會引起機(jī)體活化B細(xì)胞核因子κ輕鏈增強子（NF-?B）系統(tǒng)的激活［36］。相反，抑制NF-?B系統(tǒng)就能抑制微生物產(chǎn)物、炎性因子和許多趨化因子對炎性細(xì)胞的誘導(dǎo)，而GC-C/cGMP信號傳導(dǎo)通路可以負(fù)性調(diào)控炎性因子的表達(dá)。據(jù)報道，人IBD樣本的全基因分析顯示，GC-C在活動性IBD中均顯著下調(diào)，且與炎性因子IL-1a、IL-1b、TNF-α、IFN-γ的增加呈負(fù)相關(guān)［37］。Freihat等［38］研究白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶3（IRAK3）假激酶結(jié)構(gòu)域中GC-C中心的作用，結(jié)果顯示野生型IRAK3能產(chǎn)生cGMP，而GC-C中心定點突變則減少了cGMP的產(chǎn)生，對未轉(zhuǎn)染的對照細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞滲透性cGMP處理后發(fā)現(xiàn)cGMP可通過下調(diào)NF-?B信號來抑制炎性反應(yīng)，表明GC-C/cGMP的存在可以影響炎癥級聯(lián)反應(yīng)下游信號通路。在本研究中，與SO組相比，SAP組血清中DAO、D-Lac、TNF-α濃度顯著升高，而Linaclotide組血清中上述因子水平較SAP組均下降，表明激活GC-C可負(fù)性調(diào)控炎癥反應(yīng)，可能與腸屏障的恢復(fù)有關(guān)，也可能直接對炎癥反應(yīng)產(chǎn)生影響，但其具體調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究分析了GC-C在SAP相關(guān)性腸損傷中的變化規(guī)律及作用，為后續(xù)探索以GC-C為治療靶點開發(fā)SAP治療新策略提供了新的觀點和思路。

利益沖突：文章的全部作者聲明，在課題研究和文章撰寫過程不存在利益沖突。

機(jī)構(gòu)倫理問題：實驗過程遵循了國際獸醫(yī)學(xué)編輯協(xié)會《關(guān)于動物倫理與福利的作者指南共識》和本地及國家法規(guī)。實驗動物在麻醉下進(jìn)行所有的手術(shù)，并盡一切努力最大限度地減少其疼痛、痛苦和死亡。