張 旭，薛崇祥，李 嘉，張靜怡，譚可欣，姜雪嬌，鄭舒月，董慧靜，俞儀萱，胡紫馨，崔慧娟

1北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100029；2中日友好醫(yī)院//國家呼吸醫(yī)學(xué)中心中西醫(yī)結(jié)合腫瘤內(nèi)科，北京100029

表皮生長因子受體抑制劑（EGFRIs）目前已成為EGFR突變陽性晚期肺腺癌［1］和KRAS野生型晚期結(jié)直腸癌［2］首選治療方式。在提高臨床獲益的同時，EGFRIs也會引起較為明顯的皮膚不良反應(yīng)，其中以皮疹最為常見和高發(fā)［3-4］，且已成為影響腫瘤患者生活質(zhì)量的最重要因素［5］。關(guān)于靶向藥相關(guān)皮疹的發(fā)生機制，大量研究都證實其與炎癥反應(yīng)有很大相關(guān)性［6-7］。

目前，已報道的EGFRIs相關(guān)皮疹動物模型建立方法復(fù)雜多樣，主要有基因敲除［8-9］以及應(yīng)用藥物干預(yù)［10-14］等不同的方式；但目前的造模方式仍存在著一些問題，如基因敲除小鼠存活率低、壽命短［15-16］、造價高、周期長等不利于進(jìn)行大規(guī)模實驗。而在藥物干預(yù)的造模方式中，應(yīng)用厄洛替尼［11,13］建造的小鼠模型在皮膚表型等方面與臨床實際有較大差別，可靠性和可復(fù)制性不高；Surguladze［10］建立的小鼠模型雖然在各方面的表現(xiàn)與雖臨床極其相似，但該研究中應(yīng)用的ME1為該實驗室自制，外界尚不能購得，且尚未有研究者對此進(jìn)行復(fù)制，故該模型的可靠性需進(jìn)行進(jìn)一步探討。此外，萬亮琴［12,14］雖然應(yīng)用吉非替建立了動物模型，其在皮膚表型、病理、血清學(xué)表現(xiàn)方面與臨床高度相似，但該研究尚未與吉非替尼藥物過敏導(dǎo)致皮疹的可能性進(jìn)行鑒別，故仍需進(jìn)行進(jìn)一步探索。

為了對既往文獻(xiàn)報道的模型進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，研究者在考慮到實驗可行性、實驗周期和經(jīng)濟(jì)性等方面，對潛在的動物模型進(jìn)行了復(fù)制和探索，以期為日后研究提供更加完善和可靠的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗一

1.1.1 實驗動物 雌性SCID小鼠，5周齡，體質(zhì)量20～30 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)環(huán)境為中日友好醫(yī)院臨床研究所SPF動物房（SYXK(京)2016-0043）。該研究經(jīng)中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)實驗動物平臺倫理委員會批準(zhǔn)（倫理批號190112）。

1.1.2 藥品 西妥昔單抗注射液（愛必妥），每瓶100 mg/20 mL，購于德國默克公司，儲存于4 ℃恒溫冰箱。使用時將西妥昔單抗配制成5、2.5、1.25 mg/mL溶液，分別按照80、40、20 mg/kg進(jìn)行腹腔注射，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.3 主要儀器 BX51 正置光學(xué)顯微鏡（Olympus）、CRM440 切 片 機（Sakura）、TISSUE-TEK 脫 水 機（Sakura）、TISSUE-TEK 包埋機（Sakura）、臺式高速冷凍離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）。

1.1.4 分組及處理 將小鼠隨機分為空白組、西妥昔單抗高劑量組、西妥昔單抗中劑量組、西妥昔單抗低劑量組、生理鹽水組，空白組2只，其余各組每組4只，其中空白組不干預(yù)，西妥昔單抗組分別予以80、40、20 mg/kg劑量腹腔注射，生理鹽水組予以等體積生理鹽水注射，給藥頻次為每周一、三、五，共干預(yù)28 d。實驗過程中持續(xù)觀察小鼠皮膚形態(tài)表現(xiàn)。實驗結(jié)束后麻醉小鼠，取心尖部血液0.5 mL，放入肝素抗凝管中保存待測。處死小鼠后將小鼠背部皮膚用備皮刀清理毛發(fā)，取適當(dāng)大小的背部皮膚1塊，面積約1 cm×1 cm，放入福爾馬林溶液中保存待檢測。

1.1.5 監(jiān)測指標(biāo) 每日觀察小鼠皮膚形態(tài)學(xué)變化以及小鼠皮膚進(jìn)行蘇木素-伊紅染色觀察。

1.2 實驗二

1.2.1 實驗動物 雌性棕色挪威大鼠（Brown Norway,BN大鼠），10周齡，體質(zhì)量140～160 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)環(huán)境為中日友好醫(yī)院臨床研究所SPF動物房（SYXK(京)2016-0043）。該研究經(jīng)中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)實驗動物平臺倫理委員會批準(zhǔn)（倫理批號為190113）。

1.2.2 藥品 卵清蛋白：購于Solarbio，40 g/瓶。使用時將卵清蛋白溶于超純水中，配制成1 mg/mL溶液，按照1 mg/只予大鼠灌胃，頻次為1次/d。儲存于4 ℃恒溫冰箱中保存。吉非替尼片：商品名易瑞沙，購于阿斯利康投資（中國）有限公司。使用時將吉非替尼片研成細(xì)末，溶于超純水中，配制成7.5 mg/mL的吉非替尼溶液，按照0.5 mL/100 g予大鼠灌胃。儲存于4 ℃恒溫冰箱中保存。厄洛替尼片：商品名特羅凱，購于上海羅氏制藥有限公司。使用時將厄洛替尼片研成細(xì)末，溶于超純水中，配制成4.7 mg/mL的溶液，按照0.5 mL/100 g予大鼠灌胃。儲存于4 ℃的恒溫冰箱中保存。

1.2.3 主要試劑 大鼠IgE抗體ELISA試劑盒（abcam）、大鼠TNF-α ELISA試劑盒（RayBio）、大鼠IL-6ELISA試劑盒（RayBio）。

1.2.4 分組及處理 將BN大鼠隨機分為空白組、吉非替尼組、厄洛替尼組、卵清蛋白組，空白組不干預(yù)，3只/組，其余各組分別按照37.5 mg/kg、23.5 mg/kg、1 mg/只相應(yīng)藥物予大鼠灌胃，頻次為1次/d，共干預(yù)45 d。實驗過程中持續(xù)觀察大鼠皮膚形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。實驗結(jié)束后麻醉大鼠，取心尖部血液約5 mL，放入肝素抗凝管中保存待測。處死后將大鼠皮膚用備皮刀清理備皮，取適當(dāng)大小的背部皮膚1塊，面積約2 cm×2 cm，用于制作石蠟切片；行蘇木素-伊紅染色，顯微鏡下觀察。

1.2.5 監(jiān)測指標(biāo) 每日觀察大鼠皮膚形態(tài)學(xué)變化并拍照保存。取大鼠血清，應(yīng)用ELISA法檢測血清中TNF-α、IL-6、IgE因子的水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)中計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。若樣本代表的總體資料均服從正態(tài)分布或近似正態(tài)分布，兩組樣本進(jìn)行比較時運用t檢驗進(jìn)行分析；單一組別前后比較運用配對t檢驗。組間比較時，若兩組數(shù)據(jù)均方差齊，則應(yīng)用兩獨立樣本t檢驗，若方差不齊則應(yīng)用校正t檢驗。多樣本均數(shù)的比較采用方差分析。數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布則運用非參數(shù)檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗一

2.1.1 小鼠形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 在應(yīng)用西妥昔單抗腹腔注射干預(yù)4周后，西妥昔單抗注射液組小鼠背部皮膚無明顯的皮疹、結(jié)痂、脫屑等皮膚毒性表現(xiàn)；實驗組背部皮膚表現(xiàn)與空白對照組無明顯差異（圖1）。

圖1 各組小鼠在實驗前后的皮膚表現(xiàn)Fig.1 Cutaneous manifestations of the mice before(A1-E1)and after 4 weeks of treatment(A2-E2). A1/A2:Control group.B1/B2:Highdose cetuximab group.C1/C2:Medium-dose cetuximab group.D1/D2:Low-dose cetuximab group.E1/E2:Saline group.

2.1.2 小鼠皮膚HE染色表現(xiàn) 本實驗中，應(yīng)用西妥昔單抗注射液干預(yù)SCID小鼠4周后，實驗組小鼠背部皮膚HE染色無明顯的中性粒細(xì)胞浸潤、毛囊炎癥等表現(xiàn)；另一方面，西妥昔單抗注射液組小鼠的表皮較空白組相比也沒有明顯的增厚表現(xiàn)（圖2）。

圖2 用藥4周后小鼠背部皮膚HE染色Fig.2 HE staining of dorsal skin tissue of the mice after 4 weeks of treatment(Original magnification: ×100).A: Control group. B: High-dose cetuximab group. C: Medium-dose cetuximab group. D: Low-dose cetuximab group.E:saline group.

2.2 實驗二

2.2.1 大鼠皮膚形態(tài)學(xué)變化 從圖3中可見空白對照組在用藥前后皮膚表現(xiàn)無明顯變化；卵清蛋白組在用藥前后的皮膚表現(xiàn)無明顯差別；吉非替尼組大鼠在用藥后出現(xiàn)里明顯的皮疹、結(jié)痂表現(xiàn)；厄洛替尼組大鼠在用藥前后皮膚表現(xiàn)無明顯差別。

2.2.2 皮膚HE染色表現(xiàn) 從圖4中可見，空白組、卵清蛋白組、厄洛替尼組大鼠皮膚病理切片未見明顯的炎癥細(xì)胞聚集、棘層松解、角化不全等表現(xiàn)；而吉非替尼組大鼠皮膚切片可觀察到大量炎癥細(xì)胞聚集、角化不全等表現(xiàn)，并可看到皮疹部位皮膚表皮明顯增厚。

2.2.3 血清學(xué)炎癥因子水平 在IgE、TNF-α濃度方面，各組間均未見明顯差異（P=0.061，P=0.057）；而在IL-6方面，吉非替尼組較空白組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.016），而厄洛替尼組較空白組未見明顯差異（P=0.910，表1）。

3 討論

由上述實驗我們可以得出，在應(yīng)用西妥昔單抗注射液腹腔注射后，SCID 小鼠皮膚未出現(xiàn)典型的皮疹表現(xiàn)。通過吉非替尼灌胃的方式，可以復(fù)制較為可靠的表皮生長因子受體抑制劑相關(guān)皮疹動物模型，其在皮膚大體表現(xiàn)、病理學(xué)表現(xiàn)、血清學(xué)指標(biāo)的變化等方面與文獻(xiàn)報道高度相符，且可初步排除過敏的可能性。此外，若應(yīng)用厄洛替尼，則并不能在BN大鼠中成功建立動物模型。

圖3 用藥前后大鼠背部皮膚表現(xiàn)Fig.3 Skin changes of the rats before (A1-D1) and after the 45-day treatment (A2-D2).A1-A3: Control group.B1-B3:Ovalbumin group.C1-C3:Gefitinib group.D1-D3:Erlotinib group.

文獻(xiàn)中ME1為大鼠表皮生長因子受體單克隆抗體，能夠與小鼠表皮生長因子受體特異性結(jié)合，阻斷其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而發(fā)揮與表皮生長因子受體抑制劑相似的作用［10］；但由于此單抗為該實驗室自制，獲取困難，故本研究尚不能再次應(yīng)用此單抗進(jìn)行實驗。西妥昔單抗注射液屬于單抗類表皮生長因子受體抑制劑，在作用機制上與ME1類似，且皮疹等皮膚不良反應(yīng)的發(fā)生率高［17-19］，故實驗一中我們選擇應(yīng)用西妥昔單抗建立動物模型；同時也更可以說明模型的可復(fù)制性和可靠性。

良好的動物模型需在皮膚表型、病理表現(xiàn)和血清學(xué)變化等方面與臨床高度一致，但本實驗結(jié)果顯示，在應(yīng)用西妥昔單抗4周后，小鼠皮膚并未出現(xiàn)典型的皮疹，病理未見明確的炎癥表現(xiàn)。故本研究雖未進(jìn)行血清學(xué)因子的檢測，仍可初步考慮該模型建造不成功。追究本研究失敗原因，最有可能與西妥昔單抗注射液為人鼠嵌合性IgG單克隆抗體，只能特異性識別人體抗原，并與人的表皮生長因子受體結(jié)合［20］，而無法與小鼠表皮生長因子受體結(jié)合有關(guān)。再者，故放棄該造模方式作為進(jìn)一步研究的模型基礎(chǔ)。

圖4 各組大鼠背部皮膚組織HE染色Fig.4 HE staining of the dorsal skin of the rats in different groups(1:×100.2:×200.3:×400).A1-A3:Control group.B1-B3:Ovalbumin group.C1-C3:Gefitinib group.D1-D3:Erlotinib group).

表1 各組間IgE/TNF-α/IL-6濃度水平Tab.1 IgE,TNF-α and IL-6 concentration levels in the groups(Mean±SD,pg/mL)

實驗二中，吉非替尼組大鼠在用藥2周時均開始出現(xiàn)了皮膚脫屑現(xiàn)象，用藥3周時開始出現(xiàn)背部皮疹、結(jié)痂、滲出等皮膚炎癥表現(xiàn)；且隨著用藥時間的不斷延長，皮疹等皮膚不良反應(yīng)越發(fā)嚴(yán)重。本實驗中大鼠在皮疹形態(tài)特征、出現(xiàn)時間等方面與臨床及文獻(xiàn)報道相符［21］；在病理表現(xiàn)方面，吉非替尼組大鼠皮膚HE染色病理切片顯示表皮中有大量中性粒細(xì)胞浸潤、棘層松解、毛囊周圍炎癥等表現(xiàn)；在血清指標(biāo)方面，IL-6等炎性因子指標(biāo)較空白對照組明顯升高，與文獻(xiàn)相關(guān)報道類似［10］；據(jù)此可初步判斷該模型的成功建立。在本實驗中，吉非替尼組大鼠皮疹發(fā)生率為100%，雖然與既往實驗研究的報道相似［12］，但較臨床報道有明顯提高［22］。通過文獻(xiàn)回顧并結(jié)合臨床實際，我們推測這可能與吉非替尼的致敏性有關(guān)。因此，為了與藥物過敏進(jìn)行鑒別，本研究選擇應(yīng)用卵清蛋白作為高致敏原對大鼠進(jìn)行干預(yù)，并以IgE為重要指標(biāo)進(jìn)行了初步探索。根據(jù)上述實驗二的結(jié)果，吉非替尼組大鼠在血清IgE水平方面較空白組無明顯差異，故可初步排除藥物過敏的可能。另一方面，BN大鼠為近交系大鼠，是評價藥物過敏反應(yīng)的良好的動物模型［23］，其對各種刺激的敏感性和反應(yīng)性更為強烈［24］，也可能是導(dǎo)致皮疹發(fā)生率升高的原因之一。

厄洛替尼皮疹的發(fā)生率應(yīng)較吉非替尼更高［25］，但根據(jù)本研究結(jié)果和既往文獻(xiàn)記載，應(yīng)用厄洛替尼灌胃的方式不能在小鼠中建立EGFRIs皮疹動物模型［9］。其原因可能是誘導(dǎo)性EGFR抑制或缺失對于成年鼠毛囊的生長發(fā)育沒有明顯的影響所致［9］。也可能與小鼠的皮膚中缺乏角質(zhì)形成細(xì)胞-血管生成素受體的過度表達(dá)有關(guān)［26］。因此在本研究中，厄洛替尼組并未表現(xiàn)出與吉非替尼組相似的臨床表現(xiàn)。且在本研究中，通過病理切片我們也發(fā)現(xiàn)，厄洛替尼組大鼠皮膚HE染色并未顯示出明顯的炎癥表現(xiàn)，與空白對照組無明顯差別；血清學(xué)指標(biāo)上較空白組也無明顯差異。故綜合文獻(xiàn)和以上實驗結(jié)果，我們初步判斷，厄洛替尼灌胃建立皮疹動物模型并不成功，此模型可復(fù)制性和可信性不高。

因此，應(yīng)用西妥昔單抗注射液、厄洛替尼并不能很好的建立皮疹動物模型，但運用吉非替尼可以在BN大鼠中建立較好的動物模型，大鼠皮膚可出現(xiàn)較為典型的皮疹表現(xiàn)，該模型的可靠性和可復(fù)制性較高。本研究尚未在小鼠或其他動物品系中運用吉非替尼進(jìn)行模型的復(fù)制工作，故此模型能否擴(kuò)大種群仍需進(jìn)行進(jìn)一步探索。