邱 峰，張 琳，鄭介婷，操龍斌，張子康，鄧屹琪

1南方醫(yī)科大學(xué)南海醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，廣東 佛山528244；2南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州510515；3廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院急診科，廣東 廣州510120

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是目前對(duì)人類(lèi)健康影響最嚴(yán)重、最常見(jiàn)的慢性病之一，其發(fā)病機(jī)制有多種假說(shuō)［1-2］。其中，AS發(fā)病的炎癥機(jī)制是相對(duì)新的一種學(xué)說(shuō)，而巨噬細(xì)胞是一種炎癥細(xì)胞，在AS的炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用［3］。研究表明，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)病變并參與斑塊的進(jìn)展，不同極化類(lèi)型的巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)過(guò)程中起重要作用，巨噬細(xì)胞貫穿于AS發(fā)展的全過(guò)程，其數(shù)量、表型、遷移等與AS斑塊的命運(yùn)息息相關(guān)，其亞型的極化被認(rèn)為是AS發(fā)展的“關(guān)鍵動(dòng)力”，并影響斑塊穩(wěn)定和AS結(jié)局［4］。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）是一類(lèi)配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，在巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，表現(xiàn)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞代謝、抑制促炎基因和促進(jìn)M2表型的轉(zhuǎn)化［5-6］。中醫(yī)藥可通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞極化改善動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性，在防治動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊中展現(xiàn)良好的應(yīng)用前景［7］。

我們前期篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)，穗花杉雙黃酮可靶向結(jié)合PPAR-α/γ，但能否通過(guò)激動(dòng)PPAR-α/γ對(duì)巨噬細(xì)胞的極化產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，既往未見(jiàn)研究報(bào)道。本研究擬采用不同濃度的穗花杉雙黃酮干預(yù)用聯(lián)合脂多糖（LPS）及重組人干擾素-γ（rhIFN-γ）誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞，鑒定穗花杉雙黃酮是否能夠抑制THP-1源性巨噬細(xì)胞向M1型極化，隨后檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子、基因、蛋白表達(dá)情況，結(jié)合穗花杉雙黃酮（AF）的分子對(duì)接結(jié)果檢測(cè)靶蛋白表達(dá)水平。旨在初步探索穗花杉雙黃酮對(duì)巨噬細(xì)胞極化的分子調(diào)控作用，為動(dòng)脈粥樣硬化提供新的治療靶點(diǎn)和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑

THP-1細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)），RPMI 1640培養(yǎng)基、雙抗（青霉素-鏈霉素）、胰蛋白酶、胎牛血清[賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司]，AF、佛波酯（PMA）、聯(lián)合LPS、重組人IFN-γ、GW9662、GW6471（Sigma），CCK8檢測(cè)試劑（東仁化學(xué)科技上海有限公司），L-6、IL-10、TNF- α、TGF-β ELISA 試 劑 盒（Biolegend），抗 體PPAR-α/γ、Arg-1、Fizz1、GAPDH（CST）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

THP-1 單核細(xì)胞用含有10%熱滅活胎牛血清和10 U/mL青霉素、10 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，維持細(xì)胞數(shù)1×108/培養(yǎng)瓶左右。將傳代培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞稀釋成1×106/mL，接種于35 mm培養(yǎng)皿中，于含100 ng/mL佛波酯（PMA）、0.3%BSA的無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)72 h誘導(dǎo)分化為M0狀態(tài)。M0狀態(tài)的巨噬細(xì)胞細(xì)胞稀釋成1×106/mL用接種到6孔板中，加入1 μg/mL的LPS和20 ng/mL的rhIFN-γ極化成M1型細(xì)胞。

1.3 CCK-8測(cè)定

在96孔板中每孔加入M0狀態(tài)的巨噬細(xì)胞細(xì)胞（1×105/mL）100 μL的細(xì)胞懸液。用上述方法對(duì)THP-1細(xì)胞作M1型極化誘導(dǎo)24、48、72 h，并同步在每組中加入穗花杉雙黃酮0.0、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、100.0 μmol/L。作用規(guī)定時(shí)間后，按照CCK-8說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)確定試驗(yàn)的安全濃度。

1.4 分子對(duì)接建模

根據(jù)pubchem網(wǎng)站上中藥單體的名稱(chēng)和CAS 編號(hào)，下載小分子3D結(jié)構(gòu)的SDF文件。然后針對(duì)PDB（mol2）獲 得 的chem3D 軟 件 優(yōu) 化SDF。 使 用Chemidraw 11.0獲得小分子結(jié)構(gòu)，保存為mo12格式，Mgtools1.5.6獲得PDBQT文件。蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（http：// www.rcsb.org/ structure/ 3VI8，http：// www.rcsb.org/ structure/ 3ADS，http：// www.rcsb）下載。經(jīng)Mgtools1.5.6蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)處理，通過(guò)氫化、電荷計(jì)算，合并非極性氫后另存為PDBQT文件。使用AutoDock 4.2程序進(jìn)行分子對(duì)接。選擇最多的簇中具有最低結(jié)合能的構(gòu)象用于進(jìn)一步分析。通過(guò)Lamarck遺傳算法打開(kāi)分子PDBQT文件，并以靈活的方式對(duì)小分子結(jié)構(gòu)操作100次，并通過(guò)autodock4保存到DPF文件中。

1.5 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中相關(guān)細(xì)胞因子含量

將建模成功的M0型細(xì)胞以1×106/孔接種于24孔板中，每孔加入含2 μg/mL的LPS和20 ng/mL的rhIFNγ的培養(yǎng)基向M1型極化誘導(dǎo)24 h；同時(shí)用不同濃度藥物處理24 h，設(shè)實(shí)驗(yàn)組（加藥物培養(yǎng)）及對(duì)照組[溶媒對(duì)照組（3‰DMSO）和無(wú)藥對(duì)照組]。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)細(xì)胞上清中L-6、IL-10、TNF-α、TGF-β各自的表達(dá)。

1.6 RT-qPCR檢測(cè)mRNA的表達(dá)水平

取2 mL M0型細(xì)胞以5×105/mL密度接種于12孔板中，M1型極化誘導(dǎo)方法同前，同步用不同濃度藥物處理24 h，設(shè)實(shí)驗(yàn)組（加藥物培養(yǎng)）及正常對(duì)照組[溶媒對(duì)照組（3‰DMSO）和無(wú)藥對(duì)照組]。胰酶消化后，1200 r/min離心5 min收集細(xì)胞，冰冷PBS洗滌，應(yīng)用TRIzol試劑（Takara）提取總RNA，離心樣品加入氯仿，轉(zhuǎn)移上清并加入預(yù)冷異丙醇。16 000 r/min離心10 min，棄上清加入冰冷乙醇清洗2次，離心后小心吸棄上清，產(chǎn)物以焦碳酸二乙酯水溶解。RNA定量采用NanoDrop微量分光光度計(jì)。取1 μg RNA 用于合成cDNA，qPCR 按照SYBR Green qPCR Master Mix（Thermo）操作說(shuō)明進(jìn)行，所用引物見(jiàn)表1。上、下游引物各1 μL，無(wú)核酶水7 μL，總體系20 μL。以GADPH作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算，對(duì)特異性擴(kuò)增目的基因進(jìn)行相對(duì)定量。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primers

1.7 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

取4 mL M0型細(xì)胞以2.5×104/mL密度接種于6孔板中，M1 型極化誘導(dǎo)方法同前，同步用不同濃度藥物處理24 h，實(shí)驗(yàn)分組同上。收集細(xì)胞，冰上裂解30 min，12 000 r/min離心30 min，吸取上清液，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天生物）檢測(cè)總蛋白濃度，將裂解液蛋白（50～100 μg）進(jìn)行8%～15%SDS-PAGE，電泳轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（Amersham Bioscience）上。印跡后，將膜與特異性一抗在4 ℃孵育過(guò)夜。與HRP連接的二抗雜交后，通過(guò)增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑（Amersham Biosciences）顯可視化蛋白質(zhì)條帶。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)定量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用單因素方差分析及兩因素方差分析，組間兩兩比較采用LSDt檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 THP-1細(xì)胞向M1型極化的模型誘導(dǎo)

THP-1細(xì)胞100 ng/mL PMA、0.3%BSA的無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)72 h誘導(dǎo)分化為M0狀態(tài)，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞形態(tài)以圓形為主且貼壁。加入LPS（2 μg/mL）和rhIFN-γ（20 ng/mL）誘導(dǎo)24 h極化成M1型細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化較明顯，多成梭形有偽足出現(xiàn)（圖1C）。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)誘導(dǎo)極化為M1狀態(tài)后的細(xì)胞，TNF-α、IL-6mRNA表達(dá)水平高于正常THP-1細(xì)胞和M0狀態(tài)的細(xì)胞（P＜0.01，圖2）。

圖1 不同狀態(tài)下THP-1細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Morphology of THP-1 cells with or without induction. A: THP-1 cells without treatment. B: Cells stimulated with PMA for 72 h(M0).C:Cells induced by LPS and IFN-γ for 24 h after PMA stimulation(M1)(Original magnification:×200).

圖2 誘導(dǎo)成M1型細(xì)胞TNF-α、IL-6mRNA表達(dá)水平Fig.2 Expressions of TNF-α and IL-6 mRNA in the cells after LPS and IFN-γ induction for 24 h.*P＜0.05 vs PMAgroup,**P＜0.01 vs PMAgroup.

2.2 穗花杉雙黃酮與PPAR-α/γ蛋白分子對(duì)接建模

通過(guò)分析對(duì)接100次的結(jié)果，選取能量最優(yōu)構(gòu)象（圖3）。穗花杉雙黃酮主要通過(guò)疏水、范德華力進(jìn)入PPAR-α/γ靶點(diǎn)蛋白活性位點(diǎn)非共價(jià)結(jié)合，其中與PPAR-α蛋 白 活 性 位 點(diǎn) 處 的AL332、MET330、LEU331、LEU321、ILE317、THR279、SER280、HIS440、CYS276、CYS275、ILE272、GLU251、LEU247等氨基酸殘基發(fā)生相互作用，配體能夠與LEU331、GLU251氨基酸形成氫鍵。穗花杉雙黃酮與PPAR-γ蛋白活性位點(diǎn)處的ARG280、ILE281、LYS265、HIS448、TYR327、SER239、ARG288、LYS265、ILE341、PHE264、LEU333、GLY284等氨基酸殘基發(fā)生相互作用，配體能夠與LYS265、TYR327、ILE281、LYS367、PHE264五個(gè)氨基酸形成氫鍵。氫鍵的形成增強(qiáng)了穗花杉雙黃酮靶向PPAR-α/γ蛋白能力，其中與PPAR-γ結(jié)合能力更強(qiáng)，更好的抑制或者激活該蛋白。

圖3 分子對(duì)接結(jié)果示意圖Fig.3 Molecular docking simulation.A: Molecular docking simulation between amentoflavone and PPARα/γ. B, C:Protein accumulation diagram and enlarged view of PPARα/γ binding withAmentoflavone.

2.3 穗花杉雙黃酮對(duì)M1型極化的THP-1細(xì)胞毒性影響

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著穗花杉雙黃酮濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制細(xì)胞的增殖效果增強(qiáng)，且高濃度具有殺傷作用（圖4）。穗花杉雙黃酮對(duì)M1型極化的THP-1細(xì)胞24、48、72 h的IC50值分別為56.55±5.28、16.97±3.13和8.55±0.87 μmol/L。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇5、10 μmol/L濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 穗花杉雙黃酮對(duì)M1型極化的THP-1細(xì)胞毒性影響Fig.4 Toxic effect of amentoflavone on M1 polarized THP-1 cells.

2.4 穗花杉雙黃酮對(duì)THP-1源性M1型極化細(xì)胞的干預(yù)作用

THP-1細(xì)胞先用佛波酯誘導(dǎo)分化為M0狀態(tài)后，加入LP、rhIFN-γ和AF誘導(dǎo)24 h后，進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示：與正常組相比，誘導(dǎo)成M1型極化細(xì)胞的模型組的TNF-α、IL-6 表達(dá)水平升高（P＜0.05），TGF-β、IL-10表達(dá)水平下降（P＜0.05，圖5）。與模型組比較，穗花杉雙黃酮干預(yù)后使TGF-β、IL-10表達(dá)水平上調(diào)，而TNF-α、IL-6表達(dá)水平下調(diào)。RT-qPCR的結(jié)果也顯示穗花杉雙黃酮上調(diào)THP-1源性M1型極化細(xì)胞的TGF-β、IL-10 mRNA（圖6）。

2.5 穗花杉雙黃酮對(duì)THP-1源性M1型極化細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

在上述分子對(duì)接的理論基礎(chǔ)上，我們推測(cè)穗花杉雙黃酮可能通過(guò)激活PPAR-α/γ抑制THP-1源性M0型細(xì)胞向M1型極化。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，M1型極化誘導(dǎo)的細(xì)胞中，藥物同步處理24 h后，PPAR-α/γ、Arg-1、Fizz1蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05，圖7）。

2.6 PPAR-α/γ的拮抗劑GW9662，GW6471對(duì)穗花杉雙黃酮作用的THP-1源性M1型極化細(xì)胞的影響

使用PPAR-γ的選擇性拮抗劑GW9662（2 nmol/L）和PPAR-α的有效拮抗劑GW6471（100 μmol/L）與穗花杉雙黃酮（10 μmol/L）共同孵育THP-1源性M1型極化細(xì)胞。ELISA 法檢測(cè)結(jié)果顯示：與正常組相比，GW9662可以逆轉(zhuǎn)穗花杉雙黃酮對(duì)THP-1源性M1型極化細(xì)胞因子的影響，模型組的TNF-α、IL-6表達(dá)水平升高（P＜0.05），TGF-β，IL-10 表達(dá)水平下降（P＜0.05，圖8）。而PPAR-α的有效拮抗劑GW6471對(duì)穗花杉雙黃酮對(duì)THP-1源性M1型極化細(xì)胞因子的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，使用Western blot檢測(cè)GW9662和GW6471對(duì)穗花杉雙黃酮共同孵育THP-1源性M1型極化細(xì)胞分泌的蛋白發(fā)現(xiàn)，GW9662下調(diào)PPAR-γ、Arg-1、Fizz1蛋白的表達(dá)，但GW6471僅下調(diào)PPAR-α的表達(dá)，對(duì)Arg-1、Fizz1無(wú)影響（圖9）。

3 討論

圖5 穗花杉雙黃酮對(duì)THP-1源性M1型極化細(xì)胞因子的影響Fig.5 Contents of IL-6,TNF-α,IL-10 and TGF-β in supernatant of M1 type polarized THP-1 cells treated with amentoflavone.A,B:Amentoflavone down-regulated the expression of IL-6 and TNF-α.C,D:Amentoflavone up-regulated the expression of IL-10 and TGF-β.*P＜0.05 vs BLANK group,**P＜0.01 vs BLANK group.

圖6 穗花杉雙黃酮對(duì)THP-1源性M1型極化細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)影響Fig.6 mRNA expressions of IL-6,TNF-α,IL-10 and TGF-β in M1 polarized THP-1 cells treated with amentoflavone.A,B:Amentoflavone down-regulated the expression of mRNA-IL-6 and mRNA-TNF-α.C,D:Amentoflavone upregulated the expression of mRNA-IL-10 and mRNA-TGF-β.*P＜0.05 vs M1-24 h group,**P＜0.01 vs M1-24 h.

圖7 穗花杉雙黃酮對(duì)THP-1源性M1型極化細(xì)胞的相關(guān)蛋白影響Fig.7 Protein expressions of PPAR-α/γ,Arg-1 and Fizz1 in M1 polarized THP-1 cells treated with amentoflavone(AF).*P＜0.05,**P＜0.01 vs BLANK group.

圖8 PPAR-γ的拮抗劑GW9662對(duì)THP-1源性M1型極化細(xì)胞因子的影響Fig.8 Contents of IL-6,TNF-α,IL-10 and TGF-β in supernatant of M1 polarized THP-1 cells treated with GW9662 and amentoflavone(AF).*P＜0.05,**P＜0.01.

炎性細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)之間相互作用調(diào)控著AS的發(fā)生、發(fā)展及消退，尤其是單核-巨噬細(xì)胞，在動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮不可缺少的作用［8-10］。巨噬細(xì)胞的極化類(lèi)型與AS的斑塊密切相關(guān)，其中，M1主要存在于早期斑塊中，與斑塊形成相關(guān)；M2主要與斑塊的進(jìn)展相關(guān)，且能發(fā)揮抗炎效應(yīng)，促進(jìn)AS炎癥的修復(fù)。隨著AS損傷的進(jìn)展，M1型和M2型巨噬細(xì)胞表型會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化，在斑塊的不同部位可同時(shí)存在不同極化類(lèi)型的巨噬細(xì)胞［11-12］。穗花杉雙黃酮是一種黃酮類(lèi)中藥單體，既往的研究顯示它有抗炎、抗氧化等作用［13］。由于巨噬細(xì)胞具有高度可塑性，針對(duì)巨噬細(xì)胞極化的扭轉(zhuǎn)可能是炎癥過(guò)程修復(fù)的策略之一［14］。但穗花杉雙黃酮能否對(duì)巨噬細(xì)胞的極化產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，既往少有文獻(xiàn)報(bào)道。

圖9 PPAR-α/γ的拮抗劑GW9662，GW6471對(duì)THP-1源性M1型極化細(xì)胞的相關(guān)蛋白影響Fig.9 Protein expressions of PPAR-α/γ,Arg-1, and Fizz1 in M1 polarized THP-1 cells treated with GW9662 and GW6471.*P＜0.05 vs GW9662 group,**P＜0.01 vsAF group,#P＜0.05 vs GW6471 group,##P＜0.01 vsAF group.

研究顯示，巨噬細(xì)胞可以在不同環(huán)境中主要向兩個(gè)極端極化：M1型巨噬細(xì)胞稱(chēng)為經(jīng)典活化型，可由LPS單獨(dú)或與其他細(xì)胞因子如IFN-γ、TNF-α等協(xié)同誘導(dǎo)活化，其表面特異性標(biāo)志物以大量的促炎細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6、IL-12、IL-23、TNF-α為特征，亦高表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；M2型巨噬細(xì)胞稱(chēng)為替代活化型，可由IL-4、IL-13、IL-10、TGF-β、糖皮質(zhì)激素、免疫復(fù)合物等誘導(dǎo)活化，以IL-10高表達(dá)、IL-12低表達(dá)為特征，高表達(dá)甘露糖受體、CD163，并表達(dá)高水平的Arg-1［8,12,15-17］。本研究中，加入LPS和rhIFN-γ誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞24 h后，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化較明顯，多成梭形有偽足出現(xiàn)，TNF-α、IL-6mRNA表達(dá)水平顯著高于正常THP-1細(xì)胞和M0狀態(tài)的細(xì)胞，說(shuō)明誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞至M1型是成功的。穗花杉雙黃酮在安全同濃度干預(yù)LPS+rhIFN-γ聯(lián)合誘導(dǎo)的THP-1源M1型細(xì)胞后，能使TGF-β，IL-10表達(dá)水平上調(diào)，而使TNF-α、IL-6表達(dá)水平下調(diào)，RT-qPCR的結(jié)果也顯示穗花杉雙黃酮能上調(diào)THP-1源性M1型極化細(xì)胞的TGF-β，IL-10 mRNA，說(shuō)明穗花杉雙黃酮可抑制巨噬細(xì)胞向M1型分化。

利用藥物靶標(biāo)相似性算法在靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)、疾病基因組數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘與某個(gè)疾病相關(guān)的靶標(biāo)，再在分子對(duì)接軟件進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測(cè),是研究藥物作用機(jī)制的手段之一［18］。分子對(duì)接顯示，穗花杉雙黃酮主要通過(guò)疏水、范德化力進(jìn)入PPAR-α/γ靶點(diǎn)蛋白活性位點(diǎn)非共價(jià)結(jié)合，并可以形成氫鍵，穗花杉雙黃酮與PPAR-γ結(jié)合能力更強(qiáng)，從而更好的抑制或者激活該蛋白。既往研究顯示中藥活性單體與PPARs靶向結(jié)合主要執(zhí)行脂質(zhì)和炎性反應(yīng)調(diào)控作用。例如，丹參酮ⅡA、小檗堿和橙皮素1等靶向作用PPAR-γ調(diào)控經(jīng)過(guò)一系列蛋白，促進(jìn)膽固醇流出，減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的沉積［19-21］。黃芪、當(dāng)歸、黨參等活性成分通過(guò)作用PPAR-β可降低促炎因子MCP-1、TNF-α的水平，升高抗炎因子IL-10的水平，進(jìn)而調(diào)控炎性反應(yīng)［22］。而未見(jiàn)PPARs在調(diào)控巨噬細(xì)胞極化上發(fā)揮作用。有研究顯示，PPARγ通過(guò)與其他轉(zhuǎn)錄因子與Arg1、Fizz1和Ym1基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)Arg1和Fizz1基因表達(dá)并調(diào)控巨噬細(xì)胞M2極化水平，敲除PPARγ 的巨噬細(xì)胞，Arg1的表達(dá)顯著下調(diào)［23-25］。PPARγ1可通過(guò)去SUMO化促進(jìn)下游Arg1 基因的表達(dá)從而參與調(diào)控巨噬細(xì)胞M2 型極化［26］。PPARγ還可通過(guò)與LPL基因啟動(dòng)子區(qū)域的PPARγ反應(yīng)元件相互作用，從而增強(qiáng)LPL的表達(dá)［27］，同時(shí)抑制炎性因子如TNF-α的表達(dá)，通過(guò)調(diào)控NF-κB、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子等表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞因子和炎性因子IL-6、IL-1β的表達(dá)及分泌從而發(fā)揮重要的抗炎作用［28］。這說(shuō)明PPARγ可驅(qū)動(dòng)巨噬細(xì)胞向抗炎狀態(tài)轉(zhuǎn)變。本研究結(jié)果顯示，M1型極化誘導(dǎo)的細(xì)胞中，穗花杉雙黃酮同步處理24 h后，PPAR-α/γ、Arg-1、Fizz1蛋白表達(dá)上調(diào)，穗花杉雙黃酮可能通過(guò)激活PPAR-α/γ抑制THP-1源性M0型細(xì)胞向M1型極化。

綜上所述，中藥單體穗花杉雙黃酮能激活PPAR-α/γ抑制巨噬細(xì)胞向M1型分化的作用，并可能逆轉(zhuǎn)M1型巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化，發(fā)揮抗炎作用。有關(guān)穗花杉雙黃酮促使M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞的具體轉(zhuǎn)化機(jī)制還需進(jìn)一步研究。