翟東鳳，王 鴿，李 蕾，賈小婷，鄭國沛，尹 江

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所//廣州惡性腫瘤治療轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點實驗室，廣東 廣州510095

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率均居首位的惡性腫瘤。根據(jù)組織學(xué)分類，肺癌分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌［1-2］。非小細(xì)胞肺癌中最常見的亞型為肺腺癌，約占肺癌總病例的40%［3］。與其他肺癌亞型相比，肺腺癌的發(fā)病率近年來明顯增加［4］。肺腺癌由小的氣道上皮，Ⅱ型肺泡細(xì)胞發(fā)展而來［2］。目前已鑒定了若干高頻遺傳變化（諸如EGFR、KRAS突變和ALK重排）與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，且針對這些靶點開發(fā)的藥物能夠有效抑制肺腺癌的進(jìn)程［5-7］。近年來，在肺腺癌中針對程序性死亡配體1（PD-L1）和細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）的免疫治療備受矚目［8-9］。但是，還有更多的患者既無上述遺傳突變，且對免疫檢查點治療不敏感。因此，探究肺腺癌發(fā)生和進(jìn)展過程中新的關(guān)鍵分子，有望為臨床肺腺癌提供潛在的診斷標(biāo)志物或有效的治療靶標(biāo)。

LIM域結(jié)合蛋白2（LDB2）屬于LIM域家族蛋白。LIM結(jié)構(gòu)域是一種特殊的雙鋅指基序，存在于多種蛋白質(zhì)中。LIM域介導(dǎo)功能復(fù)合物成員之間的特定接觸并調(diào)節(jié)某些組成蛋白的活性［10］。目前公認(rèn)的幾種重要的LIM蛋白均與細(xì)胞骨架有關(guān)，在粘附斑塊和肌動蛋白微絲組織中起作用［10］。LDB家族蛋白包括LDB1、LDB2和LDB3。LDB1 定位于細(xì)胞核，在細(xì)胞中組成型表達(dá)。LDB1在連接增強子和基因方面起著關(guān)鍵作用，它通過跨神經(jīng)發(fā)育、心臟發(fā)生、視網(wǎng)膜發(fā)生和造血等多種發(fā)展途徑形成具有細(xì)胞類型特異性的復(fù)合物［11］。LDB3特異性剪接會引起特發(fā)性擴張型心肌病［12］。許多研究表明，LDB2基因在視網(wǎng)膜發(fā)育和細(xì)胞周期中起調(diào)節(jié)作用［13］。LDB2通過與DLL4啟動子區(qū)域結(jié)合調(diào)節(jié)該基因啟動子活性，并且LDB2還介導(dǎo)VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中的DLL4表達(dá)，從而參與血管生成發(fā)芽和血管重塑等生理過程［14］。此外，LDB2還可驅(qū)動白細(xì)胞跨上皮遷移和動脈粥樣硬化［13］。研究認(rèn)為在乳腺癌中LDB2對ER受體活性有負(fù)調(diào)節(jié)作用，并破壞ERE依賴的轉(zhuǎn)錄［15］。在肝細(xì)胞癌中LDB2通過下調(diào)HEY1的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移［16］。但是LDB2在肺腺癌中的作用尚未被闡明。

在本研究中，我們從多個數(shù)據(jù)庫中預(yù)測LDB2在肺腺癌中低表達(dá)，且與患者不良預(yù)后負(fù)相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，本課題擬驗證LDB2在肺腺癌中的表達(dá)模式，明確其在肺腺癌中的表達(dá)意義，探索其在肺腺癌中發(fā)揮的作用及潛在的分子機制。

1 資料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

正常肺上皮細(xì)胞16HBE 和肺腺癌細(xì)胞（H1299、H1975、A549、H1650和PC9）均由本實驗室自主保存提供，上述細(xì)胞均在含有10%胎牛血清（Gibco）的1640 完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將細(xì)胞置于37 ℃，5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 標(biāo)本收集

收集2013年3月～2018年12月來本院就診的肺腺癌患者的癌組織80例和癌旁組織17例，置于RNA保存液中，在液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 轉(zhuǎn)染

Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購自Fermentas。將H1299細(xì)胞接種6孔板，次日進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。6孔板1孔的轉(zhuǎn)染量如下：（1）質(zhì)粒4 μg 和5 μL p3000 加入250 μL無血清培養(yǎng)基，（2）5 μL Lipofectamine 3000 加入250 μL無血清培養(yǎng)基，分別混勻，將（1）加入（2）混合液中，輕柔混勻后室溫靜置15 min，將上述混合液加入6孔板中，48 h后用于后續(xù)研究。

1.4 qRT-PCR

使用Omega RNA提取試劑盒來獲得目標(biāo)細(xì)胞及組織總RNAs，并將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNAs。SYBR法用于檢測各基因mRNA水平的表達(dá)量。各基因引物序列見表1。

1.5 Western blot檢測

使用含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液處理目標(biāo)細(xì)胞，BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品上樣量是30 μg，蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%BSA室溫封閉2 h，一抗孵育過夜，HRP偶聯(lián)二抗室溫孵育2 h，ECL底物檢測蛋白表達(dá)量。

1.6 細(xì)胞計數(shù)

將5×103細(xì)胞種于12孔板中，混勻后置于37 ℃，5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此后連續(xù)7 d用胰酶消化不同孔的細(xì)胞，混勻后吸出同等體積的細(xì)胞混合液，使用細(xì)胞計數(shù)儀計算細(xì)胞數(shù)目。

1.7 軟瓊脂克隆

在6孔板中均勻鋪入含有0.75%瓊脂糖的完全培養(yǎng)基的下層膠，室溫下冷卻后，將2×103細(xì)胞加入含有0.375%瓊脂糖的完全培養(yǎng)基中，混勻后鋪入凝固的下層膠上，室溫下冷卻后置于37 ℃，5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，顯微鏡下觀察克隆大小并拍照。

1.8 流式細(xì)胞檢測

將5×105細(xì)胞均勻鋪于六孔板中，使用含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，并置于37 ℃，5%培養(yǎng)箱中。24 h后將完全培養(yǎng)基置換成無血清的1640進(jìn)行饑餓處理24 h，隨后換成完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，按照說明書對處理后的細(xì)胞進(jìn)行固定及染色，最后使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。

1.9 MeRIP-qPCR實驗

購買Millipore 的Magna RIPTMRNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit，按照說明書開展實驗。RIP裂解液處理細(xì)胞后，使用anti-m6A抗體（RIPqPCR實驗中用到的是YTHDC2抗體）孵育細(xì)胞裂解液，磁珠與上述混合物孵育，蛋白酶K處理相關(guān)蛋白，純化RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，qRT-PCR檢測目標(biāo)RNA的含量。

1.10 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

購買TaKaRa的定點突變試劑盒MutanBest Kit，將LDB2轉(zhuǎn)錄本上“AGA（274 bp）CT”序列缺失，將野生型的序列（轉(zhuǎn)錄本1～400 bp）和缺失型的序列構(gòu)建到報告基因載體pGL4 Basic，分別命名為“LDB2-WT”和“LDB2-DEL”。分別將野生型報告基因/缺失型報告基因與pRLTK（海腎熒光素酶報告基因載體，作為內(nèi)參）、YTHDC2過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞。48 h后，1×passive lysis buffer裂解各組細(xì)胞30 min，將裂解液轉(zhuǎn)移至白板，依次加入螢火蟲熒光素酶底物和海腎熒光素酶底物（含有熒光猝滅劑），多功能酶標(biāo)儀檢測各孔化學(xué)發(fā)光值，計算各孔熒光素酶活性。

1.11 生物信息學(xué)預(yù)測網(wǎng)址

Prognoscan(http://dna00.bio.kyutech.ac.jp/PrognoScan/)

GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)

cBioPortal for Cancer Genomics (https://www.cbioportal.org/)

TCGA(http://www.tcga.org/)

SRAMP(http://www.cuilab.cn/sramp)

1.12 統(tǒng)計處理

所有實驗重復(fù)3次以上，數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩對基因表達(dá)的相關(guān)性通過SPSS 19.0軟件包進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗和卡方檢驗，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LDB2在肺腺癌中的表達(dá)模式

下載GEO、TCGA及CPTAC 3個數(shù)據(jù)庫的肺腺癌中下調(diào)的基因表達(dá)信息，取交集分析后發(fā)現(xiàn)肺腺癌中有25 個表達(dá)下調(diào)的基因（圖1A）。GEPIA 數(shù)據(jù)庫顯示LDB2在483例肺腺癌組織中的表達(dá)量遠(yuǎn)低于其在347例肺正常組織中的表達(dá)量（圖1B）。GSE10072 和GSE43767數(shù)據(jù)集均展示LDB2在肺腺癌組織中低表達(dá)；而在GSE32863數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)LDB2在58例肺腺癌中的表達(dá)量顯著低于其在配對癌旁組織中的表達(dá)量（圖1C）。CPTAC 數(shù)據(jù)庫證實LDB2 蛋白在111 例肺腺癌組織中的表達(dá)量低于其在111例正常組織中的表達(dá)量（圖1D）。我們通過免疫組化方法檢測LDB2在80例肺腺癌組織和17例正常組織的表達(dá)量，亦獲得相似的結(jié)果（圖1E）。最后，qRT-PCR方法顯示LDB2在肺腺癌細(xì)胞株A549、H1299、H1975、H1650和PC9中的表達(dá)量均顯著低于其在正常肺上皮細(xì)胞16HBE中的表達(dá)量（圖1F）。

2.2 LDB2在肺腺癌中低表達(dá)的臨床意義

在GEPIA數(shù)據(jù)庫中統(tǒng)計了273例LDB2高表達(dá)肺腺癌患者和144例LDB2低表達(dá)的肺腺癌患者的總生存率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LDB2高表達(dá)與肺腺癌患者較好的預(yù)后正相關(guān)（圖2A，P=0.049）。在線數(shù)據(jù)庫Prognoscan 預(yù)測到LDB2在多個數(shù)據(jù)集中與肺腺癌患者不良預(yù)后負(fù)相關(guān)。最后，將收集到的80 例肺腺癌組織分為51 例LDB2低表達(dá)的肺腺癌組織和29例高表達(dá)LDB2的肺腺癌組織，經(jīng)統(tǒng)計分析：隨著LDB2表達(dá)量越低，肺腺癌患者總的生存率越差，LDB2表達(dá)量與肺腺癌患者總的生存率表達(dá)負(fù)相關(guān)（P=0.0087，圖2C）。

2.3 LDB2抑制肺腺癌細(xì)胞增殖

H1299中過表達(dá)LDB2，通過qRT-PCR及Western blot驗證，H1299細(xì)胞株中過表達(dá)LDB2構(gòu)建成功（圖3A）。體外細(xì)胞計數(shù)實驗結(jié)果顯示：與對照組對比，過表達(dá)LDB2 可明顯抑制H1299 細(xì)胞的增殖能力（圖3B）。軟瓊脂克隆實驗發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，過表達(dá)LDB2組可顯著抑制H1299細(xì)胞的克隆形成能力（圖3C）。流式細(xì)胞術(shù)證實：與對照組相比，過表達(dá)LDB2后將誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞發(fā)生S期阻滯（圖3D）。

2.4 m6A修飾調(diào)控LDB2表達(dá)

我們首先通過在線數(shù)據(jù)庫SRAMP預(yù)測到LDB2轉(zhuǎn)錄本上存在多個m6A結(jié)合位點，其中274位點的m6A具有高度可靠性，后期重點驗證該位點（圖4A）。在H1299 細(xì)胞中開展MeRIP-qPCR 實驗，發(fā)現(xiàn)與IgG 相比，其m6A組的LDB2含量顯著升高（圖4B）。GEPIA數(shù)據(jù)庫顯示YTHDC2在肺腺癌中低表達(dá)，且與LDB2表達(dá)正相關(guān)（圖4C，r=0.22，P=1.2e-06）。在H1299細(xì)胞中過表達(dá)YTHDC2，qRT-PCR和WB檢測結(jié)果均證實過表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建成功（圖4D）。通過qRT-PCR 和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)H1299細(xì)胞中過表達(dá)YTHDC2可增加LDB2的表達(dá)（圖4E）。H1299過表達(dá)YTHDC2的細(xì)胞中開展RIP 實驗，定量結(jié)果顯示LDB2 在YTHDC2 組的含量是其在IgG 組含量的19.35 倍（圖4F）。雙熒光素酶報告基因試驗發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，YTHDC2可上調(diào)野生型報告基因活性13.04倍；而當(dāng)該位點m6A發(fā)生缺失后，YTHDC2對其活性調(diào)控也大幅度降低（圖4G）。

圖1 LDB2 在肺腺癌中的表達(dá)模式Fig.1 Expression pattern of LDB2 in LUAD.A:TCGA,GEO and CPTAC databases were searched for genes with low expressions in LUAD. B: Expression levels of LDB2 in LUAD and normal tissues were evaluated by GEPIA databank, **P＜0.01. C: GEO database analysis of LDB2 expression in LUAD and normal tissues, **P＜0.01. D: CPTAC databank analysis of the protein expression levels of LDB2 in LUAD and normal tissues, **P＜0.01. E: Immunohistochemical method was used to detect LDB2 expression in 80 LUAD tissues and 17 normal lung tissues,**P＜0.01.F:qRT-PCR for to estimating LDB2 expression in 16HBE and several LUAD cells,**P＜0.01.

圖3 LDB2 抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖能力Fig.3 LDB2 inhibits proliferation ability of LUAD cells.A:qRT-PCR and Western blot were performed to verify the expression level of LDB2 in H1299 cells. **P＜0.01 vs H1299-con. (B) Cell counting and (C) soft agar clone formation assays were used to analyze the cell proliferation ability.**P＜0.01 vs H1299-con.D:Cell cycle was detected by flow cytometry assay in H1299 cells.

3 討論

盡管在研究肺腺癌的相關(guān)發(fā)病機制及臨床治療上取得了新的進(jìn)展，但是肺腺癌仍然是最具侵襲性及快速致死性的腫瘤類型之一，總生存率不到5年［3］。因此探討肺腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制是目前亟待解決的重大課題。在本研究中，我們前期通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測、組織學(xué)及細(xì)胞學(xué)水平驗證，發(fā)現(xiàn)LDB2在肺腺癌中顯著低表達(dá)。并且LDB2的表達(dá)與肺腺癌患者良好的臨床預(yù)后呈正相關(guān)。細(xì)胞功能實驗發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)LDB2后可抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖能力。深入探究后發(fā)現(xiàn)m6A修飾調(diào)控LDB2在肺腺癌中低表達(dá)。

m6A修飾是真核mRNA最常見的內(nèi)部修飾，廣泛參與許多細(xì)胞過程，例如RNA轉(zhuǎn)錄、剪接、核轉(zhuǎn)運、降解和翻譯［17］。大量研究發(fā)現(xiàn)m6A 扮演了腫瘤啟動子或抑制子的角色，通過調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，而參與腫瘤細(xì)胞的啟動、增殖、分化、轉(zhuǎn)移和代謝重編程等生命過程［17］。m6A修飾主要發(fā)生在DRACH基序上（D對應(yīng)于A，G或U；R對應(yīng)于G或A；H對應(yīng)于A，C或U），通常在轉(zhuǎn)錄本的5'-UTR、3'-UTR 和終止密碼子附近［18］。m6A的效應(yīng)器包括編碼器、讀碼器和消碼器。編碼器（如METTL3、METTL14和WTAP等）通過S-腺苷甲硫氨酸（SAM）轉(zhuǎn)移酶將甲基添加到目標(biāo)RNA 上，形成m6A 甲基化位點［19］。FTO 和ALKBH5 是兩種主要的m6A銷碼器，它們以Fe(II)/α-酮戊二酸依賴性方式催化去除m6A修飾［20］。讀碼器（如YTHDF1-3、YTHDC1-2和HNRNPA2B1等）能夠?qū)ｉT識別并結(jié)合帶有m6A修飾的RNA，以控制其命運并調(diào)節(jié)下游功能［21］。

YTHDC2的YTH結(jié)構(gòu)域優(yōu)先通過保守的疏水口袋與含m6A的RNA結(jié)合，而錨蛋白重復(fù)序列介導(dǎo)與5'-3'外核糖核酸酶XRN1的RNA相互作用。YTHDC2與小核糖體亞基相互作用，接近mRNA進(jìn)入/退出位點，從而調(diào)控特定基因的表達(dá)［22］。目前關(guān)于YTHDC2對轉(zhuǎn)錄本的調(diào)控尚未有定論。有報道指出YTHDC2能夠結(jié)合到SLC7A11轉(zhuǎn)錄本上促進(jìn)其降解［23］。也有文章發(fā)現(xiàn)YTHDC2在耐輻射的鼻咽癌細(xì)胞中高表達(dá)。生物信息學(xué)和機制研究發(fā)現(xiàn)，YTHDC2能結(jié)合到胰島素樣生長因子1受體（IGF1R）mRNA上，促進(jìn)該轉(zhuǎn)錄本的翻譯起始，進(jìn)而激活I(lǐng)GF1R-AKT/S6信號通路，從而實現(xiàn)鼻咽癌放療抵抗［24］。YTHDC2在肺腺癌中低表達(dá)，且與肺腺癌的低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小和臨床分期等特征相關(guān)。YTHDC2能夠抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力［25］。與此不同的是，我們在研究中發(fā)現(xiàn)YTHDC2可以調(diào)控LDB2的mRNA豐度，也調(diào)控其蛋白豐度，我們優(yōu)先考慮YTHDC2 對LDB2 轉(zhuǎn)錄活性有影響。由于LDB2的轉(zhuǎn)錄起始位點位于該轉(zhuǎn)錄本161位，274位點與轉(zhuǎn)錄起始位點比較接近，仍可作為啟動子區(qū)域，因此構(gòu)建啟動子報告基因載體，雙熒光素酶報告基因證實YTHDC2可識別LDB2上的m6A位點，從而轉(zhuǎn)錄活化該轉(zhuǎn)錄本。與這些數(shù)據(jù)相吻合的是，GEPIA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)亦顯示YTHDC2與LDB2在肺腺癌中表達(dá)正相關(guān)。在后續(xù)研究中，我們將進(jìn)一步尋找LDB2轉(zhuǎn)錄本上m6A修飾的編碼器和銷碼器。

圖4 YTHDC2通過m6A修飾上調(diào)LDB2的表達(dá)Fig.4 M6A modifies the expression of LDB2.A: The distribution of m6A sites on LDB2 RNA was predicted via online software SRAMP;B:MeRIP-qPCR assay was carried out to examine m6A sites on LDB2,**P＜0.01;C:Expression pattern of YTHDC2 in LUAD.Pearson correlation analysis was performed to discover the expression relationship between LDB2 and YTHDC2 in LUAD; YTHDC2 overexpression plasmid was transfected in H1299 cells, qRT-PCR and Western blot assays were implemented to detect the expression of YTHDC2(D)and LDB2(E),**P＜0.01;F:We performed RIP-qPCR assays to evaluate whether YTHDC2 could bind to the transcript of LDB2,**P＜0.01;G:Dual-luciferase report assay in 293T cells with wildtype or deletion reporter plasmid,**P＜0.01.

因此，本研究闡述了LDB2在肺腺癌中表達(dá)量顯著下降，其表達(dá)受m6A修飾調(diào)控抑制，且LDB2可誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞發(fā)生S期阻滯，抑制其增殖能力。LDB2調(diào)控肺腺癌細(xì)胞周期的分子機制有待于進(jìn)一步研究。