肖 瑤，牛 玥，毛明慧，林 涵，汪佰麗，烏恩奇，趙煥虎，李樹(shù)春

中央民族大學(xué)1藥學(xué)院民族醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2校醫(yī)院，北京100081

流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示全世界糖尿病患者人數(shù)達(dá)到4.25億，糖尿病已成為全球的主要健康威脅。2型糖尿?。═2D）在糖尿病發(fā)病人數(shù)中高達(dá)90%［1］。T2D并發(fā)癥導(dǎo)致的失明、腎衰竭、下肢壞疽等后果，嚴(yán)重影響患者健康，T2D的治療和護(hù)理也給整個(gè)醫(yī)療體系帶來(lái)非常大的壓力。特別是T2D逐漸趨于年輕化［2］，預(yù)示這種疾病頻率和年齡的迅猛變化很難歸因于傳統(tǒng)遺傳學(xué)，環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因素可能占有很大比例。

大量研究表明，腸道菌群和T2D有非常重要的關(guān)聯(lián)。Sedighi等［3］研究了健康人群和T2D患者的菌群結(jié)構(gòu)，觀(guān)察到T2D患者的乳酸桿菌水平顯著增加，而雙歧桿菌水平顯著下降。Fassatoui等［4］研究發(fā)現(xiàn)，T2D患者腸道中柔嫩梭菌和艾克曼菌與未患病人群相比豐度較低。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者糞便中乳酸桿菌的豐度比正常組低，提示了乳酸桿菌與2型糖尿病的相關(guān)性［5］。Chen收集了100例患者的糞便樣本和血液樣本，通過(guò)16s 擴(kuò)增子分析發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者糞中乳酸菌、C.leptum 的含量與健康對(duì)照組相比有顯著性差異［6］。在一項(xiàng)277個(gè)非糖尿病丹麥人和75個(gè)T2D患者的研究中發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗個(gè)體的血清代謝組中支鏈氨基酸增加，相對(duì)應(yīng)的有支鏈氨基酸合成潛力的腸道菌群增加，而普氏菌和擬桿菌是推動(dòng)支鏈氨基酸生物合成和胰島素抵抗的主要物種，在小鼠中，普氏菌可引起胰島素抵抗，加重葡萄糖不耐受并增加支鏈氨基酸的外周循環(huán)［7］。

綜合當(dāng)前研究可知，所有研究都提供了T2D患者腸道生態(tài)失調(diào)的證據(jù)。但是由于各種混雜因素，如不同的研究人群，使用不同的測(cè)序技術(shù)和分析方法，使用各種飲食和藥物等，研究的結(jié)果差異很大，不能得到一致的結(jié)論。為了進(jìn)一步深入探究腸道菌群在正常組和T2D組中的差異，我們利用正常組和T2D組志愿者樣本的腸道菌群數(shù)據(jù)，在對(duì)腸道菌群生物信息分析基礎(chǔ)上，控制了相關(guān)研究變量對(duì)腸道菌群的影響，進(jìn)一步明確正常組和T2D組各自的核心菌群以及組間差異，以期最終確定可以作為診斷和治療靶標(biāo)的候選標(biāo)志菌群。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

從中央民族大學(xué)校醫(yī)院收集133例臨床糞便樣本（健康樣本78例，T2D病例樣本55例），樣本均來(lái)源于北京市海淀區(qū)中央民族大學(xué)社區(qū)。經(jīng)過(guò)中央民族大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)（ECMUC2019003CO）的許可，在知情同意的情況下，志愿者填寫(xiě)知情同意書(shū)后，按照人類(lèi)遺傳資源標(biāo)準(zhǔn)編碼統(tǒng)一編號(hào)，加入糞便保存液，采集量5 g左右。收集樣品時(shí)統(tǒng)計(jì)相應(yīng)指標(biāo)：如身高、體質(zhì)量，年齡、民族及其他與糖尿病相關(guān)的指標(biāo)。將篩選出的糞便樣本立即放在冰上進(jìn)行分裝并標(biāo)記。T2D診斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)(ADA)標(biāo)準(zhǔn)，空腹血糖大于7 mmol/L，餐后血糖或隨機(jī)血糖大于11.1 mmol/L，糖化血紅蛋白HbA1c≥6.5%，三者中滿(mǎn)足一項(xiàng)即診斷為T(mén)2D。健康入組標(biāo)準(zhǔn)：年齡40～90周歲，在過(guò)往病歷及本次體檢中沒(méi)有任何疾病記錄、腸道疾病篩查陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有1型糖尿病、特殊類(lèi)型糖尿病和妊娠糖尿病人群，有精神病史，患有腸道疾病，濫用藥物人群，有手術(shù)及其他應(yīng)急情況人群，近1個(gè)月服用抗生素及益生菌人群。

1.2 糞便菌群DNA提取

糞便菌群基因組DNA提取采用PowerSoil?DNA Isolation Kit，具體操作按其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將0.25 g糞便樣品加入PowerBead Tubes 中，輕輕渦旋混勻。加入60 μL Solution C1，上下顛倒數(shù)次混勻。將PowerBcad Tubes 3200 r/min渦旋震蕩10 min，室溫10 000 g離心30 s。將上清液移至一個(gè)干凈的2 mL 收集管中，加入250 μL Solution C2到上清液中，渦旋混勻5 s，4 ℃孵育5 min，室溫10 000 g離心1 min。轉(zhuǎn)移上清液至新的收集管中，加入250 μL Solution C3到上清液中，渦旋混勻5 s，4 ℃孵育5 min，室溫10 000 g離心1 min。轉(zhuǎn)移上清液至新的收集管中，加入1000 μL Solution C4到上清液中，渦旋混勻5 s。加入約675 μL上清液到Spin Filter中，室溫10 000 g離心1 min。棄去濾液，繼續(xù)加入約675 μL上清液，室溫10 000 g離心1 min。重復(fù)直至過(guò)濾完所有上清液。加入約500μL Solution C5 到Spin Filter中，室溫10 000 g離心30 s，棄去上清液，室溫10 000 g 離心1 min。小心轉(zhuǎn)移Spin Filter 到2 mL Collection Tube中，加入100 μL Solution C6到白色濾膜中心，室溫10 000 g離心30 s。棄去Spin Filter，收集管中的DNA用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 PCR擴(kuò)增及文庫(kù)構(gòu)建

PCR擴(kuò)增體系為：10×PCR buffer 10 μL，上游引物1.5 μL，下游引物1.5 μL，基因組DNA 40～60 ng，dNTPs 1 μL，Q5 High-Fidelity DNA 聚合酶0.2 μL，加無(wú)菌水至50 μL；PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃5 min；15個(gè)循環(huán)（95 ℃1 min，50 ℃1 min，72 ℃1 min）；72 ℃7 min。根據(jù)細(xì)菌V3+V4 區(qū)設(shè)計(jì)得到引物，上游引物為5'-ACTCCTAC GGGAGGCAGCA-3'，下游引物5'-GGACTACHVGG GTWTCTAAT-3'。接著是糞便樣品DNA目標(biāo)區(qū)域產(chǎn)物純化，Solexa PCR，磁珠純化和Nanodrop定量及混樣。

1.4 Illumina高通量測(cè)序

質(zhì)檢合格的文庫(kù)用HiSeq2500 PE250進(jìn)行測(cè)序，按照測(cè)序上機(jī)操作流程進(jìn)行。

1.5 生物信息分析及統(tǒng)計(jì)分析

雙 端Reads 拼 接 使 用FLASH［8］軟 件，使 用Trimmomatic［9］對(duì)拼接序列進(jìn)行過(guò)濾；FastQC［10］軟件對(duì)測(cè)序樣本產(chǎn)生的序列質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估；再使用UCHIME［11］去除嵌合體。利用軟件USEARCH［12］，將拼接好的Tags聚類(lèi)為OTU，通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)［13］。Calypso作熱圖［14］，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、Alpha多樣性分析、Beta多樣性分析都在QIIME上完成。分析得到133個(gè)樣品的Alpha多樣性指數(shù)后，根據(jù)樣品的分組信息進(jìn)行組間的Alpha多樣性指數(shù)差異分析，利用Anosim相似性分析進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)，用來(lái)檢驗(yàn)組間的差異是否顯著大于組內(nèi)差異，從而判斷分組是否有意義。對(duì)于方差不齊數(shù)據(jù)我們采用Adonis檢驗(yàn)組間Beta多樣性。Anosim相似性分析、Adonis分析通過(guò)R語(yǔ)言的vegan包來(lái)實(shí)現(xiàn)。

腸道菌群變化受到多種混雜因素的影響，如GLU，HDLC，HCY等，為了校正這些混雜因素，我們?cè)赗語(yǔ)言中采取傾向評(píng)分匹配方法（PSM）。傾向性評(píng)分匹配完成后，利用R語(yǔ)言的DEseq包對(duì)兩組進(jìn)行差異分析。

在DESeq分析的基礎(chǔ)上，采用Negative Binominal distribution（DESeq2）統(tǒng)計(jì)方法，初步篩選出屬水平上樣本組間豐度差異OTU，并通過(guò)ggplot2包繪制火山圖展示這些差異OTU的豐度、差異倍數(shù)、差異顯著性等信息。

在組間豐度比較中篩選出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的物種基礎(chǔ)上，使用線(xiàn)性判別分析（LDA）效應(yīng)大小法（LefSe）進(jìn)一步鑒定與T2D相關(guān)的菌群標(biāo)志物。利用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)檢測(cè)所有的特征物種，檢測(cè)不同組間的物種豐度差異，并獲得顯著差異物種；再利用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)檢查在顯著差異物種類(lèi)中的所有亞種比較是否都趨同于同一分類(lèi)級(jí)別；最后對(duì)生成的向量集建立一個(gè)線(xiàn)性判別分析模型，最終得到特定分類(lèi)水平下的差異物種列表及效應(yīng)大小，從而篩選出各組的生物標(biāo)志物。

1.6 PICRUSt功能預(yù)測(cè)分析

將OTU表與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得各OTU代謝通路信息。利用PICRUSt［15］軟件構(gòu)建古菌和細(xì)菌域全譜系的基因功能預(yù)測(cè)譜。利用STAMP［16］軟件在P＜0.05顯著性水平對(duì)PICRUSt預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，獲得具有顯著性差異的代謝通路信息，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)試人群特征

共篩選合格樣本133例，每管樣品300 mg。其中符合標(biāo)準(zhǔn)的T2D人群55例，健康人群78例（表1）。通過(guò)Pearson卡方檢驗(yàn)分析可以看出，正常組男女比例為27/51，T2D 組為28/27，組間差異都無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.06）；正常組年齡為69.08±10.14（44～86）歲，T2D組年齡為69.22±10.04（51～88）歲，組間差異都無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.69）；兩組在生化指標(biāo)LBP，HBP，BMI，ALT，CHO，CRE，HDLC，TG，BUN，UA上兩組差異都無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在GLU，LDLC，HCY指標(biāo)上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估和物種注釋

133 例樣品初始數(shù)據(jù)共包含25 375 243 條PEreads。雙端Reads 拼接、過(guò)濾后共產(chǎn)生19 911 450條Clean tags，平均每個(gè)樣品產(chǎn)生149 710 條Clean tags。在使用UCHIME過(guò)濾去除chimera后，得到17 371 759條reads用做后續(xù)分析，最少reads數(shù)60 073，最大reads數(shù)193 353（圖1A），有效率為87.2%。通過(guò)測(cè)序深度指數(shù)goods_coverage的稀釋曲線(xiàn)可以看出，所有樣品的goods_coverage在50 000條序列時(shí)均已接近極限值1，表明所有樣品在60 381條時(shí)有足夠的測(cè)序深度，即已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種（圖1B）。

將過(guò)濾得到的測(cè)序序列，通過(guò)聚類(lèi)分析，相似性水平高于97%的序列定義為一個(gè)OTU。取物種豐度較高的前20個(gè)OTU畫(huà)聚類(lèi)熱圖，從圖中可以看出T2D組（1組）和正常組（0組）在前20個(gè)OTU中的物種豐度分布情況（圖1C）。將OTU代表序列與微生物Greengenes v13_8參考數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)代表序列進(jìn)行物種分類(lèi)注釋?zhuān)Y選優(yōu)勢(shì)物種，畫(huà)出物種注釋分類(lèi)樹(shù)，從整個(gè)物種分類(lèi)系統(tǒng)上了解樣品中物種的進(jìn)化關(guān)系，通過(guò)分類(lèi)樹(shù)中的柱形圖可以看出T2D組（1組）和正常組（0組）優(yōu)勢(shì)物種的豐度差異（圖1D）。綜合來(lái)看，F(xiàn)imicutes 和Bacteroidetes是門(mén)分類(lèi)上的優(yōu)勢(shì)物種，它們分類(lèi)下的Bacteroidales、Clostridiales 綱 類(lèi) 是 優(yōu) 勢(shì) 物 種；Bacteroidaceae、Lachnospiraceae、Ruminococcaceae、Prevotellaceae、Veillonellaceae、Lactobacillaceae是科分類(lèi) 下 的 優(yōu) 勢(shì) 物 種 ；Bacteroides、Prevotella、Faecalibacterium等是屬分類(lèi)下的優(yōu)勢(shì)物種。

2.3 物種多樣性

從Alpha多樣性指數(shù)繪制盒形圖，得到兩組間的Alpha 多樣性指數(shù)沒(méi)有差異（P＞0.05，Wilcoxon Rank-Sum Test）（圖2A～D）。Anosim相似性分析結(jié)果圖中，橫坐標(biāo)表示所有樣品（Between）以及每個(gè)分組（abnormal/normal），縱坐標(biāo)表示基于unweighted_unifrac矩陣的秩。R介于（-1,1）之間，R大于0，說(shuō)明組間差異顯著；R小于0，說(shuō)明組內(nèi)差異大于組間差異，如圖3E所示，左圖R=0.044，右圖R=0.092，均大于0，說(shuō)明組間差異顯著，統(tǒng)計(jì)分析的可信度用P值表示，左右圖P值均小于0.05，表示統(tǒng)計(jì)具有顯著性（圖2E）。

從Hellinger距離矩陣結(jié)果來(lái)看，總體差異的2.17%可由是否患糖尿病解釋?zhuān)粀eighted-unifrac距離矩陣結(jié)果說(shuō)明如果考慮豐度差異，兩組菌群具有差異（P=0.001）；如果不考慮豐度差異，只考慮種類(lèi)即unweighted-unifrac，兩組菌群沒(méi)有差異（P=0.120）?？偨Y(jié)以上內(nèi)容可知Beta多樣性在考慮豐度情況下兩組間存在顯著差異。

2.4 正常組與T2D組的核心菌群構(gòu)成

在門(mén)分類(lèi)水平下，F(xiàn)imicutes和Bacteroidetes是兩組最主要的門(mén)類(lèi)，在兩組中兩者之和占比均高達(dá)80%以上。在T2D 組，菌群門(mén)類(lèi)主要為Fimicutes（47.6%），Bacteroidetes（39.0%），Proteobacteria（7.8%），Actinobacteria（4.8%）；在正常組，F(xiàn)imicutes（47.0%），Bacteroidetes（37.9%），Proteobacteria（9.9%），Actinobacteria（4.5%）（圖3A）。

在屬分類(lèi)水平下，我們選取了兩組中主要的屬水平菌做成分構(gòu)成圖，從圖中可以看出屬水平上主要的菌成分及其所占的比例。結(jié)果顯示，正常組的主要菌屬為Bacteroides（32%），Escherichia Shigella（9%），F(xiàn)aecalibacterium（8%），Prevotella（4%），Bifidobacterium（4%）（圖3B）。T2D 組的主要菌屬為Bacteroides（24%），Lactobacillus（13%），Prevotella（10%），Bifidobacterium（9%），Escherichia Shigella（6%）（圖3C）。

圖2 正常組和T2D組Alpha、Beta多樣性分析Fig.2 Alpha and beta diversity analysis of the healthy and T2D groups.A Chaol index of the healthy and T2D groups. B: Observed_species index of the healthy and T2D groups. C:Shannon index of the healthy and T2D groups. D: Simpson index of the healthy and T2D groups (0=healthy group, 1=T2D group). E: Anosim analysis graph (left graph shows the unweighted Unifrac distance,right graph shows the weighted Unifrac distance).

圖3 正常組與T2D組的核心菌群構(gòu)成Fig.3 The core flora composition of the healthy and T2D groups.A: Histogram of core flora at phylum level of the healthy and T2D groups.B:Analysis plot of components of the healthy group at the genus level.C:Analysis plot of components of T2D group at the genus level.

2.5 組間差異物種和Biomarker篩選

通過(guò)DESeq2方法，我們得到了正常組與T2D組之間的差異OTU。以P值（P value）為縱坐標(biāo)，以倍數(shù)變化指數(shù)（log2 FoldChange）為橫坐標(biāo)，繪制差異火山圖（圖4A）。圖中的每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)OTU，平行于Y軸的兩條線(xiàn)分別是FC=2 和FC=-2，在FC=-2 左側(cè)的點(diǎn)是T2D組中與正常組相比下調(diào)2倍以上的OTU，在FC=2右側(cè)的點(diǎn)是T2D 組中與正常組相比上調(diào)2 倍以上的OTU。同時(shí)，平行于X軸有一條虛線(xiàn)代表-log10（0.05），在虛線(xiàn)以上的點(diǎn)表示顯著性＜0.05的OTU。對(duì)于每個(gè)OTU，若P＜0.05，F(xiàn)C≥2，則表明該OTU 為組間差異OTU。以O(shè)TU的平均豐度（Abundance）為縱坐標(biāo)，倍數(shù)變化指數(shù)（log2 FoldChange）為橫坐標(biāo)繪制豐度火山圖（圖4B），直觀(guān)的體現(xiàn)差異OTU的豐度分布。

我們對(duì)各環(huán)境變量的差異OTU篩選后，得到矯正了的只與血糖相關(guān)的OTU，排除了其它因素的干擾，盡可能的降低偏倚，最后得到OTU102（Sutterella）、OTU295（Bacteroidia）、OTU298（Lactobacillaceae）、OTU232（Bifidobacteriaceae）等共37個(gè)與血糖有關(guān)聯(lián)的OTU（表2）。

在篩選出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的OTU 基礎(chǔ)上，使用LefSe 方法進(jìn)一步鑒定與T2D 相關(guān)的菌群標(biāo)志物。LDA值分布柱狀圖展示了LDA score大于設(shè)定值有差異的物種，即具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物標(biāo)志物。展現(xiàn)不同組中豐度有顯著差異的物種，柱狀圖的長(zhǎng)度代表顯著差異物種的影響大小（圖4C）。進(jìn)化分支圖由內(nèi)至外輻射的圓圈代表了由門(mén)至屬（或種）的分類(lèi)級(jí)別。在不同分類(lèi)級(jí)別上的每一個(gè)小圓圈代表該水平下的一個(gè)分類(lèi)，小圓圈直徑大小與相對(duì)豐度大小呈正比。無(wú)顯著差異的物種統(tǒng)一著色為黃色，差異物種Biomarker跟隨組進(jìn)行著色，綠色節(jié)點(diǎn)表示在綠色組別（T2D組）中起到重要作用的微生物類(lèi)群（圖4D）。通過(guò)LefSe分析得出兩組在2個(gè)門(mén)3個(gè)綱3個(gè)目4個(gè)科10個(gè)屬的相對(duì)豐度間有顯著差異。 正常組的候選生物標(biāo)志物包括：Clostridium_XVIII、 Roseburia、 Eggerthella、Lachnospiracea_incertae_sedis、 Clostridium_XlVa、Megamonas、 Comamonas、 Lachnospiraceae、Bacteroides、 Bacteroidaceae、 Bacteroidetes、Bacteroidia、Bacteroidales；T2D組的候選生物標(biāo)志物包括 ：Bifidobacterium、Bifidobacteriales、Bifidobacteriaceae、Actinobacteria、Bacilli、Lactobacillales、Lactobacillaceae、Lactobacillus。

圖4 組間差異OTU比較及生物標(biāo)志物的篩選Fig.4 Comparison of OTUs between groups and screening of the biomarkers.A:Differential volcano map(The xaxis coordinate is log2FoldChange, and the y-axis coordinate is padj). B: Differential volcano map（The x-axis coordinate is log2 Fold Change,and the y-axis coordinate is mean abundance.C:LDA distribution histogram(0=healthy group,1=T2D group).D:LDAcladogram(0=healthy group,1=T2D group)

2.6 PICRUSt功能預(yù)測(cè)分析

為了預(yù)測(cè)并比較正常組與T2D組腸道菌群功能，本研究采用PICRUS軟件基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行菌群功能預(yù)測(cè)，采用STAMP軟件在P＜0.05顯著性水平對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有36個(gè)代謝通路有顯著差異（圖5）。其中正常組顯著高于T2D組的代謝通路有7個(gè)，包括脂多糖生物合成蛋白質(zhì)代謝通路、蛋白質(zhì)折疊和相關(guān)處理代謝通路等。T2D組顯著高于正常組的代謝通路有29個(gè)，包括腎細(xì)胞癌代謝通路、苯乙烯降解代謝通路等（表3）。

3 討論

隨著對(duì)糖尿病發(fā)病機(jī)制研究的逐步深入，包括人體致病基因和信號(hào)通路等傳統(tǒng)研究路徑越發(fā)顯示出局限性，使得全世界研究者轉(zhuǎn)而關(guān)注其它可能與T2D發(fā)病相關(guān)的因素。腸道菌群在人體的生理和病理中發(fā)揮著人體基因組不可代替的作用。之前的研究已經(jīng)證實(shí)了腸道菌群與T2D的發(fā)病有密切的關(guān)系，但是由于研究人群，測(cè)序技術(shù)，分析方法的不同，每個(gè)研究都有自己不同的結(jié)論。因此我們使用16s rRNA高通量測(cè)序技術(shù)分析了T2D組和正常組兩組臨床病例樣本腸道菌群的組成和核心菌群情況，并通過(guò)對(duì)兩組樣本可能對(duì)腸道菌群影響因素的校正，排出干擾因素的分析，更好的探究腸道菌群與T2D的關(guān)系。

在本次研究中，我們分析了正常組和T2D組臨床病例的腸道菌群。分析的數(shù)據(jù)顯示，從總體來(lái)看，厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)是門(mén)分類(lèi)水平上的主 要 核 心 物 種，Bacteroides、Escherichia Shigella、Prevotella、Bifidobacterium、Lactobacillus 是屬分類(lèi)水平上的主要核心物種。為了更好地研究腸道菌群與T2D的關(guān)聯(lián)性，更精確地篩選出T2D的菌群標(biāo)志物，我們通過(guò)傾向評(píng)分匹配法（PSM）校正了相關(guān)混雜因素。PSM是一種用于處理研究數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。計(jì)算研究對(duì)象在多種背景因素（如年齡、性別等）下成為T(mén)2D患者的概率（即傾向評(píng)分），匹配概率相等或相近的個(gè)體,組成新的正常組和T2D組，此兩組可近似為隨機(jī)分組，組間相關(guān)因素可達(dá)到均衡。其優(yōu)勢(shì)是組間分配不均衡的多個(gè)變量被“傾向評(píng)分”一個(gè)綜合指標(biāo)所代替，消除組別之間的干擾因素，以便對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行更合理的比較。傾向性評(píng)分匹配完成后，利用R語(yǔ)言的DEseq包對(duì)兩組進(jìn)行差異分析，并通過(guò)LefSe方法進(jìn)一步鑒定出與T2D相關(guān)的菌群標(biāo)志物。最終篩選出的正常組的候選生物標(biāo)志物包括：Clostridium_XVIII、Roseburia、Eggerthella、Lachnospiracea_incertae_sedis、Clostridium_XlVa、 Megamonas、 Comamonas、 Lachnospiraceae、Bacteroides、Bacteroidaceae、Bacteroidetes、Bacteroidia、Bacteroidales；T2D組的候選生物標(biāo)志物包括 ：Bifidobacterium、Bifidobacteriales、Bifidobacteriaceae、Actinobacteria、Bacilli、Lactobacillales、Lactobacillaceae、Lactobacillus。這些結(jié)果表明，正常組與T2D 組腸道菌群結(jié)構(gòu)存在差異，部分微生物與T2D有密切的關(guān)系，它們可能是T2D的致病因素亦或

保護(hù)因素。

表2 各環(huán)境變量的差異OTU篩選Tab.2 Differential OTU screening for every environmental variable

圖5 腸道菌群PICRUSt功能預(yù)測(cè)Fig.5 Gut microbiota PICRUSt functional prediction(0=healthy group,1=T2D group).

此前有文獻(xiàn)報(bào)道Ruminococcaceae 和Lachnospiraceae 在高脂飲食喂養(yǎng)組老鼠中被大量發(fā)現(xiàn)［17］，在我們的T2D組中也發(fā)現(xiàn)這兩種菌群成分。有文獻(xiàn)報(bào)道厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)的比值不僅僅會(huì)影響了碳水化合物的代謝，同時(shí)改變了短鏈脂肪酸的產(chǎn)生，誘發(fā)胰島素抵抗［18-20］。我們?cè)诮Y(jié)果中也得到T2D組的厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)的比值低于正常組，這可能與T2D的發(fā)病有密切聯(lián)系。

本研究結(jié)果顯示T2D受試者腸道菌群中乳酸桿菌的比例增加，擬桿菌目與毛螺菌科的比例減少，這和Horie［21］的基于2 型糖尿病和非糖尿病小鼠腸道菌群的對(duì)比分析結(jié)果相同；Hartstra 等人發(fā)現(xiàn)T2D 患者的腸道微生物群中產(chǎn)生丁酸鹽的細(xì)菌，即Roseburia 和Faecalibacterium 減少［22］，我們的研究結(jié)果支持該結(jié)論。在一項(xiàng)關(guān)于中國(guó)維吾爾族和哈薩克族的T2D 腸道菌群研究中，正常組和T2D 組從科分類(lèi) 水 平 上，Ruminococcaceae、Lachnospiraceae 和Enterobacteriaceae是兩組的主要核心菌群［23］，我們的研究也得到相同的結(jié)果。比較有趣的是，與當(dāng)前研究結(jié)果不同，我們發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌在T2D組中豐度高于正常組，雙歧桿菌與T2D組有非常密切的關(guān)系，它也是我們通過(guò)統(tǒng)計(jì)篩選出來(lái)的能夠鑒別正常組與T2D組的具有顯著豐度差異的菌。一直以來(lái)，相關(guān)研究都證實(shí)雙歧桿菌是一種有益菌，并給它貼上“促進(jìn)腸道健康”或“保持腸道菌群的平衡”類(lèi)似的標(biāo)簽［24］。Koutnikova等［25］綜合相關(guān)文獻(xiàn)分析指出，Bifidobacterium的攝入對(duì)糖尿病有著輕微但持續(xù)的改善作用。但是在我們篩選比較得到的結(jié)果中，Bifidobacterium出現(xiàn)在T2D組中比正常組更多，同時(shí)，Bifidobacterium也是我們通過(guò)LefSe方法鑒定出的與T2D相關(guān)的潛在菌群標(biāo)志物之一。這與之前文獻(xiàn)報(bào)道的Bifidobacterium作為一種有益菌較多的出現(xiàn)在正常組而非病例組恰恰相反。在之前的文獻(xiàn)報(bào)道中，關(guān)于雙歧桿菌的地位也眾說(shuō)紛紜，有所爭(zhēng)議。Lin等［26］研究指出長(zhǎng)雙歧桿菌可以通過(guò)富集硒起到延緩糖尿病發(fā)作的作用。在一項(xiàng)隨機(jī)安慰劑對(duì)照試驗(yàn)中，研究者將60例患者隨機(jī)分成2組，分別服用益生菌補(bǔ)充劑或安慰劑6 周，益生菌補(bǔ)充劑由7 種活菌株Lactobacillus，和Streptococcus組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多菌株益生菌補(bǔ)充劑使患者血糖水平顯著降低［27］。Babadi 等［28］研究發(fā)現(xiàn)Bifidobacterium 對(duì)妊娠期糖尿病患者相關(guān)的基因表達(dá)具有有益調(diào)節(jié)作用。Kobyliak 等［29］研究發(fā)現(xiàn)Bifidobacterium可適度改善T2D患者的胰島素抵抗。在一項(xiàng)基于16S rRNA基因片段測(cè)序的T2D患者腸道微生物群特征研究中，T2D組的雙歧桿菌水平和高密度脂蛋白膽固醇水平呈正相關(guān)，間接說(shuō)明雙歧桿菌對(duì)2型糖尿病的治療起作用［30］。Bagarolli等［31］用雙歧桿菌喂養(yǎng)高脂肪飲食老鼠，發(fā)現(xiàn)其對(duì)于胰島素調(diào)節(jié)起著重要的作用。以上文章都支持雙歧桿菌作為有益菌比較少的出現(xiàn)在糖尿病組的病人和老鼠中，或者證實(shí)利用雙歧桿菌能夠緩解胰島素抵抗和糖尿病的癥狀。

表3 KEGG代謝途徑差異Tab.3 Differential metabolic pathways between diabetic and healthy groups

但是也并非所有的文獻(xiàn)都支持Bifidobacterium作為有益菌更多的出現(xiàn)在正常組而較少的出現(xiàn)在糖尿病組中這一說(shuō)法。在澳大利亞的一項(xiàng)研究中，研究者以妊娠期糖尿病高風(fēng)險(xiǎn)人群，即超重和肥胖的孕婦為研究對(duì)象，定期給予含有Bifidobacterium的益生菌補(bǔ)充劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)益生菌補(bǔ)充劑并未對(duì)妊娠期糖尿病起到預(yù)防作用［32］；在另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌在飲食和血糖水平之間任何轉(zhuǎn)換途徑中作用都不明顯［33］。另外一項(xiàng)研究采用定量宏基因組學(xué)對(duì)292位丹麥人進(jìn)行了腸道菌群的分析中，根據(jù)個(gè)體腸道微生物基因的數(shù)量，腸道微生物的豐富程度可將人群分為低微生物豐富度群體和高微生物豐富度群體，在低微生物豐富度群體中肥胖個(gè)體所占的比例要顯著高于高豐富度群體的。低微生物豐富度的個(gè)體往往攜帶更多的促炎癥的細(xì)菌，而高微生物豐富度的個(gè)體則包含更多的抗炎癥細(xì)菌如Bifidobacterium，低微生物豐富度的人群患上前期糖尿病、2型糖尿病、缺血性心血管疾病等肥胖相關(guān)的疾病的風(fēng)險(xiǎn)更高，這篇文章雖然間接說(shuō)明Bifidobacterium在正常人群中的豐度更高［34］，但是在另一篇綜述中，作者特別提到，低微生物豐富度群體不都是肥胖，或者表現(xiàn)出胰島素抗性，血清瘦蛋白增加，高血清胰島素，高甘油三脂和游離脂肪酸，低血清高密度脂蛋白膽固醇等現(xiàn)象并且還伴有其他的炎癥表征，高微生物豐富度群體也不都是健康人群，因此不能下定論某些菌就是疾病或正常的代表［35］。在Suez等［36］的研究中，提到了很多腸道菌群在正常以及異常的血糖反應(yīng)表現(xiàn)中不同的豐度水平，他們認(rèn)為在糖尿病小鼠體內(nèi)增加的雙歧桿菌可以對(duì)血糖控制有所改善，但是他們無(wú)法確定在人群實(shí)驗(yàn)中Bifidobacterium是否能像在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)得到相同的結(jié)果和作用。

我們認(rèn)為雙歧桿菌對(duì)于研究T2D的發(fā)病原因和發(fā)病進(jìn)程非常重要。由于研究當(dāng)中研究對(duì)象的選擇和分析方法的不同，關(guān)于雙歧桿菌的地位和作用眾說(shuō)紛紜，雙歧桿菌與T2D或著某種腸型的關(guān)聯(lián)是否是因果關(guān)系還是不得而知，雙歧桿菌究竟是致病因素還是保護(hù)因素也需要更多的微生物動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)才能證實(shí)。

此外，我們發(fā)現(xiàn)三羧酸循環(huán)、脂多糖生物合成等代謝途徑在糖尿病患者中上調(diào)。存在于這些途徑的因子包括參與將碳水化合物降解為短鏈脂肪酸（SCFA）的酶，例如己糖激酶，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和乙酰輔酶A合成酶等［37］。因此，這些發(fā)現(xiàn)可能意味著糖尿病患者腸道中SCFAs譜的病理生理改變，Inoue等［38］的研究也支持該觀(guān)點(diǎn)。其他一些代謝途徑，如苯乙烯降解，花生四烯酸代謝等，雖然目前并無(wú)研究可以明確指出其與糖尿病間的聯(lián)系，但仍能模糊地與2型糖尿病聯(lián)系起來(lái)，需要進(jìn)一步的研究來(lái)闡明這些途徑在2型糖尿病中的作用。

綜上所述，本研究通過(guò)DESeq2方法找出正常組與T2D組之間的差異OTU，進(jìn)而在屬水平上選擇有豐度差異的物種。不足之處在于，研究對(duì)象年齡有一定的偏倚，由于臨床所限，沒(méi)有納入年輕患者和相應(yīng)的對(duì)照人群。特別是該次研究為橫斷面研究，無(wú)法具體得出腸道菌群和糖尿病發(fā)病的因果關(guān)系，在接下來(lái)的研究中，課題組將建立相應(yīng)的研究隊(duì)列，力求闡明腸道菌群和糖尿病發(fā)病的因果關(guān)系。