賈曉昀，王士杰，趙紅霞，朱繼杰，李妙，王國印

（河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所/ 河北省作物遺傳育種實驗室，石家莊050035）

株型是棉花的重要性狀，不同株型材料在產(chǎn)量、品質(zhì)、抗逆性等方面存在顯著差異，理想株型是高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的保證[1-5]。 近年來，全程機(jī)械化成為棉花生產(chǎn)的重要發(fā)展方向，機(jī)采棉成為育種的主攻目標(biāo)， 而機(jī)械采摘對株型的要求較為嚴(yán)格，因此挖掘株型相關(guān)分子遺傳機(jī)制成為基礎(chǔ)研究的重點[3,6]。 此外，株高越矮、株型越緊湊的材料早熟性越好，改良棉花早熟性，適當(dāng)無膜晚播，有利于減少地膜使用量，保護(hù)耕地質(zhì)量和環(huán)境[1,7-8]。

棉花株型性狀主要包括株高 （Plant height，PH）、第一果枝節(jié)位（Nodeofthefirstfruitingbranch，NFFB）及其高度（Height of NFFB，HNFFB）、果枝長度 （Fruiting branch length，F(xiàn)BL）、 果節(jié)長度（Branch node length，BNL） 及 果 枝 角 度（Fruit branch angle，F(xiàn)BA）等性狀；生育期主要包括出苗期（Budding time，BT）、現(xiàn) 蕾 期（Squaring time，ST）、開花期（Flowering time，F(xiàn)T）、花鈴期（Flowering to boll-opening period，F(xiàn)BP） 和全生育期（Whole growth period，WGP）[7,9-11]。 目前，關(guān)于棉花株型及生育期性狀的分子遺傳機(jī)制研究主要通過QTL（Quantitative trait loci，數(shù)量性狀位點）定位和GWAS （Genome-wide association analysis，全基因組關(guān)聯(lián)分析）挖掘相關(guān)染色體位點。 范術(shù)麗等[12]首先開展棉花株型及生育期性狀QTL定位研究，得到12 個相關(guān)QTL。Li 等[13]構(gòu)建2 個F2群體定位到54 個生育期相關(guān)的QTL。 Li 等[14]針對10 個株型性狀開展QTL 定位， 在F2和F2:3群體定位到73 個位點。 Jia 等[11]以重組自交系為材料， 定位到247 個株型及生育期相關(guān)QTL 位點，并在D3 染色體上發(fā)現(xiàn)一段關(guān)鍵區(qū)域。Su 等[7]以355 份陸地棉為試驗材料，開展株型相關(guān)性狀GWAS，關(guān)聯(lián)到22 個SNP。 Ma 等[15]構(gòu)建海陸種間回交群體，定位到10 個株高相關(guān)QTL，并驗證了1 個GhPIN3 基因。然而，棉花株型及生育期性狀均為復(fù)雜的數(shù)量性狀，目前得到的基因信息較少，難以為品種選育提供有效參考。

本研究立足生產(chǎn)需求， 以冀豐914 和冀豐817 為親本構(gòu)建F2群體，分析棉花株型及生育期性狀的相關(guān)性。 采用GBS（Genotyping-by-sequencing， 基于測序的基因分型） 技術(shù)開發(fā)群體SNP（Single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態(tài)性） 標(biāo)記， 構(gòu)建了1 張包含11 488 個SNP 標(biāo)記、總圖距為4 202.12 cM（centiMorgan，厘摩）的高密度遺傳圖譜（數(shù)據(jù)未發(fā)表），定位與株型、生育期相關(guān)的QTL，為深入分析棉花株型及生育期性狀的分子遺傳機(jī)制奠定研究基礎(chǔ)，為機(jī)采棉分子標(biāo)記輔助育種提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以自育國審品種冀豐914（國審棉2015003）為母本， 以優(yōu)質(zhì)自交系冀豐817 （原系名： 優(yōu)系817）為父本。 冀豐914 株型高大、豐產(chǎn)性好，冀豐817 株高較低、纖維品質(zhì)優(yōu)良。 于2018 年在河北石家莊組配雜交組合，收獲F1種子，同年冬天在海南加代自交，收獲F2種子。于2019 年在河北石家莊播種F2群體413 個單株， 行長7 m， 行距0.76 m，株距0.2 m，共15 行，管理同當(dāng)?shù)卮筇铩?/p>

現(xiàn)蕾后調(diào)查NFFB，9 月初調(diào)查PH、HNFFB、FNLFFB （First node length of the fourth fruiting branch， 第四果枝第一果節(jié)長度）、FNLSFB(First node length of the seventh fruiting branch， 第七果枝第一果節(jié)長度)；全生育期內(nèi)及時調(diào)查開花期和吐絮期，統(tǒng)計FT、FBP 和WGP。

1.2 分析方法

通過Excel 2016 對數(shù)據(jù)的基本統(tǒng)計量進(jìn)行分析，通過SPSS21.0 分析性狀之間的簡單相關(guān)性。

通過QTL IciMapping 4.0 分析加性及上位性QTL[16]。 加性QTL 的分析參數(shù)為：Step＝1 cM，PIN＝0.001。 上位性QTL 的分析參數(shù)為：Step＝5 cM，PIN＝0.000 1。LOD 值通過1 000 次迭代計算確定。 本研究中，母本基因型為BB，父本基因型為AA；加性效應(yīng)為負(fù)，表示對應(yīng)QTL 的增效基因來源于母本冀豐914；加性效應(yīng)為正，表示對應(yīng)QTL 的增效基因來源于父本冀豐817。

1.3 基因注釋及表達(dá)量分析

根據(jù)Wang 等[17]公布的參考基因組信息對重要QTL 位點進(jìn)行基因注釋，并通過KOBAS 3.0軟件[18]進(jìn)行KEGG 通路和GO 富集分析，根據(jù)Hu 等[19]公布的轉(zhuǎn)錄組信息進(jìn)行注釋基因表達(dá)量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 群體表型的基本統(tǒng)計

表1 為群體性狀基本統(tǒng)計量。 除花鈴期外，冀豐914 的其他性狀值顯著大于冀豐817，F(xiàn)1的性狀表型值居于親本之間，F(xiàn)2群體性狀呈現(xiàn)雙向超親分布；峰度和偏度的絕對值小于1，近似正態(tài)分布，適合進(jìn)行QTL 分析。 由標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)可 以 看 出， 試 驗 群 體 的PH、NFFB、HNFFB、FNLFFB 和FNLSFB 等5 個株型性狀的變異幅度顯著大于FT、FBP 和WGP 等3 個生育期性狀，說明試驗群體的株型性狀變異豐富，含有豐富的株型相關(guān)QTL/基因。

表1 親本及群體性狀的基本統(tǒng)計量Table 1 Statistics of the parents and population traits

2.2 性狀之間的簡單相關(guān)性分析

表2 為性狀之間簡單相關(guān)性分析。 可以看出，除FT 與FBP 負(fù)相關(guān)外，其他性狀間均為正相關(guān)。PH 與NFFB、HNFFB、FNLFFB、FNLSFB 的相關(guān)性達(dá)到極顯著水平， 與WGP 的相關(guān)性達(dá)到顯著水平。 NFFB 與HNFFB、FNLFFB、FT、WGP的相關(guān)性達(dá)到極顯著水平，與FBP 的相關(guān)性達(dá)到顯著水平。HNFFB 與FNLFFB、FT 的相關(guān)性達(dá)到極顯著水平， 與WGP 的相關(guān)性達(dá)到顯著水平。FNLFFB 與FNLSFB、FT、WGP 的相關(guān)性達(dá)到極顯著水平；FNLSFB 與WGP 的相關(guān)性達(dá)到極顯著水平，與FBP 的相關(guān)性達(dá)到顯著水平。WGP 與FT、FBP 的相關(guān)性達(dá)到極顯著水平。 可知，PH 與其他4 個株型性狀均為極顯著正相關(guān)，NFFB 與生育期性狀均為顯著/極顯著正相關(guān)。

2.3 株型性狀的主成分分析

表3 為株型性狀主成分分析結(jié)果，前兩個主成分因子累計貢獻(xiàn)率為61.53%。因子1 的特征值為2.03，貢獻(xiàn)率為40.53%，特征向量值較大的是HNFFB（0.74）和PH（0.73），主要是垂直高度相關(guān)性狀。因子2 的特征值為1.05，貢獻(xiàn)率為21.00%，特征向量值較大的是FNLSFB（0.77），為水平長度相關(guān)性狀。 因此，PH、HNFFB 和FNLSFB 是鑒定棉花株型垂直和水平方向特征的典型性狀。

表2 各性狀之間的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis among the seven traits

表3 五個株型性狀主成分分析Table 3 Principal component analysis of the five plant architecture traits

2.4 QTL 定位結(jié)果及分析

本研究共得到36 個加性QTL（Additive QTL，aQTL）位點，包括31 個株型相關(guān)aQTL 和5 個生育期相關(guān)aQTL，其中26 個位點的增效基因來源于母本冀豐914，10 個位點的增效基因來源于父本冀豐817 （表4 和圖1）。 定位到14 個PH 相關(guān)aQTL， 分布于11 條 染色體。 其 中，qPH-D12-1 的貢獻(xiàn)率最大， 為9.64%，LOD 值達(dá)到11.97，增效基因來源于母本冀豐914；qPHD2-1 和qPH-D5-1 的貢獻(xiàn)率分別為8.53%和8.62%，LOD 值分別為10.85 和10.86， 增效基因均來源于母本冀豐914。 定位到6 個NFFB 相關(guān)aQTL， 分布于5 條染色體。 其中，qNFFB-A11-1的貢獻(xiàn)率最大，為8.63%，增效基因來源于母本冀豐914。 定位到3 個HNFFB 相關(guān)aQTL，分布于A12、D3 和D8 染色體， 貢獻(xiàn)率分別為6.18%、5.61%和6.75%。 定位到5 個FNLFFB 相關(guān)aQTL， 分布于A2、A6、D8 和D11 染色體，A6 染色體分布有2 個位點， 即qFNLFFB-A6-1 和qFNLFFB-A6-2， 這兩個位點的貢獻(xiàn)率分別為10.36%和10.38%， 其中qFNLFFB-A6-1 的增效基因來源于父本冀豐817，qFNLFFB-A6-2 的增效基因來源于母本冀豐914。 定位到3 個FNLSFB 相關(guān)aQTL，分布于A9、D8 和D10 染色體，其中qFNLSFB-D8-1 的位置與qFNLFFBD8-1 相近，位于135～139 cM 區(qū)段，增效基因均來源于父本冀豐817。 分別定位到2、1、2 個FT、WGP、FBP 相關(guān)aQTL，分布于5 條染色體，貢獻(xiàn)率為6.29%～8.11%。

表4 株型及生育期相關(guān)性狀加性QTL 信息Table 4 Additive effect QTL information of the plant architecture and growth period related traits

圖1 定位的加性QTL 在染色體上的分布Fig. 1 Additive QTL distribution on chromosomes

發(fā)現(xiàn)3 個染色體片段處同時分布有2 個aQTL 位點， 分別為A11 染色體1.5～4.5 cM 處qNFFB-A11-1 和qWGP-A11-1 重疊、D3 染色體157.5～166 cM 處qHNFFB-D3-1 和qPH-D3-1 重疊、D8 染色體138.5～139.5 cM 處qNFFB-D8-1和qFNLSFB-D8-1 重 疊。 其 中，D8 染 色 體 的134.5～135.5 cM 有1 個qFNLFFB-D8-1。 因此，D8 染色體135～139 cM 區(qū)段內(nèi)可能存在與株型相關(guān)的關(guān)鍵基因。

此外， 定位到263 個上位性QTL（Epistatic QTL，eQTL）位點，涉及全部的26 條染色體（附表1）。 其中31 個與PH 相關(guān)、28 個與NFFB 相關(guān)、19 個與HNFFB 相關(guān)、62 個與FNLFFB 相關(guān)、21個 與FNLSFB 相 關(guān)、44 個 與FT 相 關(guān)、21 個 與WGP 相關(guān)和37 個與FBP 相關(guān)，單個eQTL 的貢獻(xiàn)率為1.17%～6.19%。 其中，96 個eQTL 分布于41 個染色體位點， 每個位點至少有2 個eQTL；21 個eQTL 與19 個aQTL 位置重疊，但是僅有4個位點影響相同性狀，說明在互作條件下同一個遺傳位點表現(xiàn)出復(fù)雜遺傳效應(yīng)。

2.5 基因注釋及候選基因篩選

基于Wang 等[17]公布的陸地棉參考基因組注釋信息，針對貢獻(xiàn)率大于8.00%的加性QTL 所在區(qū)間及D8 染色體的135～139 cM 區(qū)段進(jìn)行基因注釋，共注釋到115 個基因。 通過KEGG 通路比對發(fā)現(xiàn)，注釋基因比對到37 個KEGG 通路（附圖1）；GO 富集結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注釋基因主要富集到纖維素酶活性等生物活性、纖維素及植物初生細(xì)胞壁生物合成等生物過程、細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器細(xì)胞組分等40 個GO 條目（附圖2）。 根據(jù)Hu 等[19]公布的轉(zhuǎn)錄組信息，對注釋得到的115 個基因進(jìn)行表達(dá)量分析，篩選到在根、莖、葉、花或萼片5個組織表達(dá)量較高的基因共21 個， 其中GH_D02G1779 和GH_D08G0595 在葉片中表達(dá)量最高，GH_D08G0525 在莖中表達(dá)量最高，GH_D08G0638 在根和花中表達(dá)量最高（圖2）。

圖2 根、莖、葉、花、萼片中表達(dá)量較高的注釋基因Fig. 2 Highly expressed genes in root, stem, leaf, flower and sepal

3 討論

株型是植物特征特性的外在表現(xiàn)，是進(jìn)行植物鑒定、分類的重要依據(jù)。 株型的形成是遺傳因素與環(huán)境條件共同作用的結(jié)果，受到內(nèi)源激素與外源刺激的協(xié)同調(diào)控[20]。 株型也是農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)形成的基礎(chǔ)， 三者之間存在顯著的相互影響，理想株型是實現(xiàn)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的重要保障[3,21-23]。近年來，機(jī)械化的發(fā)展特別是機(jī)械采摘對棉花株型提出更嚴(yán)格的要求[7,24]，合理的株型有利于提高機(jī)械采摘質(zhì)量，減少原棉的雜質(zhì)污染。 因此，開展株型育種、培育適于機(jī)采的棉花新品種對發(fā)展植棉產(chǎn)業(yè)、提高經(jīng)濟(jì)效益有重要影響。 加強棉花株型性狀的分子基礎(chǔ)研究， 挖掘株型相關(guān)遺傳位點，有利于提高分子標(biāo)記輔助育種效率、加快機(jī)采棉育種速度。

本研究以國審品種冀豐914 為母本、自交系冀豐817 為父本構(gòu)建F2分離群體，分析5 個株型性狀和3 個生育期性狀表型和遺傳基礎(chǔ)。 經(jīng)簡單相關(guān)性分析和主成分分析發(fā)現(xiàn)，本文研究的大部分性狀間存在正相關(guān)關(guān)系，株高與其他株型性狀均為極顯著正相關(guān)，第一果枝節(jié)位與生育期性狀均為顯著或極顯著正相關(guān)，可作為鑒定棉花早熟性的株型性狀，株高、第一果枝節(jié)位高度和第七果枝第一果節(jié)長度是鑒定株型垂直和水平特征的典型性狀，與他人研究結(jié)果相似[11,25-27]。 本研究調(diào)查的第四和第七果枝第一果節(jié)長度在其他研究中報道較少。據(jù)紀(jì)從亮等[28]研究，第一果節(jié)長度與產(chǎn)量呈正相關(guān)，并且對棉株內(nèi)圍構(gòu)造有顯著影響。 因此，本研究結(jié)合試驗材料特征，分別測量棉株下部和中部一個果枝的第一果節(jié)長度，不僅有助于了解棉花株型特征，而且為下一步研究株型與產(chǎn)量之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明，第七果枝第一果節(jié)長度可用于鑒定棉花株型的水平特征。

本實驗室前期基于Wang 等[17]公布的參考基因組，構(gòu)建了1 張包含11 488 個SNP 標(biāo)記、總圖距為4 202.12 cM 的高密度遺傳圖譜 （數(shù)據(jù)未發(fā)表）。 基于此圖譜，本研究定位到36 個株型及生育期相關(guān)的aQTL 位點， 冀豐914 為其中26 個位點提供增效基因， 冀豐817 為其中10 個位點提供增效基因，說明冀豐914 對株型及生育期的可遺傳控制更強，可作為機(jī)采棉品種選育的基礎(chǔ)材料。 比對前人的研究結(jié)果[7,11,14]，本研究定位的17 個aQTL 與已報道的aQTL 位置重疊或相近，例如本研究得到的qPH-D3-1 與Su 等[7]、Jia 等[11]在D3 染色體上得到的區(qū)段相近， 另外19 個QTL 未見報道。 由于株型相關(guān)的QTL 定位、GWAS 分析等相關(guān)研究較少，因此本研究得到的新位點較多。 此外，冀豐914 與冀豐817 首次作為試驗材料開展株型及生育期的基礎(chǔ)研究，與其他的研究材料存在一定遺傳差異。 本研究發(fā)現(xiàn)了3 個aQTL 重疊區(qū)段，其中在D8 染色體上的區(qū)段內(nèi)分布有3 個aQTL 位點，可能存在與株型相關(guān)的關(guān)鍵候選基因。 At 基因組和Dt 基因組分別分布有17 個和19 個aQTL， 說明2 個亞組中控制株型的遺傳位點數(shù)量基本相同。同時，檢測到263個eQTL，顯著多于aQTL 位點數(shù)，說明全基因組范圍內(nèi)的互作效應(yīng)對株型及生育期有重要影響；共在19 個aQTL 位點檢測到了eQTL， 而僅有4個位點影響相同的性狀，說明在互作條件下，同1個aQTL 位點表現(xiàn)出更多的遺傳效應(yīng)；At 基因組的eQTL 顯著多于Dt 基因組，可能是由于At 基因組的長度更長，因而檢測到的上位性互作位點更多[29]。 QTL 之間的重疊及互作關(guān)系，可能是造成表型性狀之間復(fù)雜相互關(guān)系的重要遺傳因素。本研究發(fā)現(xiàn)的3 個QTL 重疊區(qū)段內(nèi)， 包含了PH、NFFB、HNFFB、FNLSFB、FNLFFB 及WGP 等多個性狀相關(guān)的QTL 位點， 由此也可以解釋株型性狀及生育期性狀之間的顯著相關(guān)性。 如PH與HNFFB 極顯著正相關(guān)，QTL 定位發(fā)現(xiàn)qPH-D3-1 與qHNFFB-D3-1 重疊，且增效基因均來自于母本冀豐914。 同時，根據(jù)參考基因組信息[17,19]，本研究注釋到21 個在陸地棉TM-1 和海島棉海7124 的根、莖、葉、花、萼片等組織中表達(dá)量較高的基因，其中GH_D02G1779、GH_D08G0595、GH_D08G0525、GH_D08G0638 在不同組織中的表達(dá)量最高。 GH_D02G1779 位于株高相關(guān)QTL qPH-D2-1 區(qū)間；GH_D08G0595、GH_D08G0525、GH_D08G0638 均位于D8 染色體的135～139 cM區(qū)段內(nèi)，該區(qū)段是第一果枝節(jié)位、第四果枝第一果節(jié)長度和第七果枝第一果節(jié)長度相關(guān)QTL 的重疊區(qū)域。 因此，這4 個基因均位于本研究定位到的重要區(qū)段內(nèi)，可能參與棉花株型的調(diào)控。海7124 株高 較 高，TM-1 株 高 一 般，GH_D08G0525 在 海7124 莖中的表達(dá)量顯著高于TM-1， 推測該基因可能參與棉花株高的調(diào)控。

4 結(jié)論

株高、第一果枝節(jié)位高度和第七果枝第一果節(jié)長度是鑒定棉花株型垂直和水平特征的典型性狀，第一果枝節(jié)位可作為鑒定棉花早熟性的株型性狀。 定位到36 個株型及生育期相關(guān)QTL 位點， 單個QTL 對表型變異的貢獻(xiàn)率為1.70%～10.38%，發(fā)現(xiàn)3 個QTL 重疊的染色體區(qū)段，并在qPH-D2-1 和Chr. D8 的135～139 cM 區(qū)段 內(nèi)發(fā)現(xiàn)4 個表達(dá)量較高的基因，為進(jìn)一步分析棉花株型的分子遺傳機(jī)制及候選基因篩選奠定了基礎(chǔ)。

附圖、附表：

附圖、附表詳細(xì)內(nèi)容參見http://journal.cricaas.com.cn/

附圖1 KEGG 通路分析結(jié)果

Fig.S1 Results of the KEGG pathway mapping

附圖2 GO 富集結(jié)果

Fig.S2 Results of the GO enrichment analysis

附表1 上位性QTL 檢測結(jié)果

Table S1 Results of the epistatic QTL