潘 昊，劉 特，吳曉俊

1.重慶醫(yī)科大學藥學院，重慶 400016

2.上海市中醫(yī)老年醫(yī)學研究所，上海 200031

3.上海中醫(yī)藥大學中藥研究所，上海 201203

肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是以脊髓前角細胞、腦干運動神經(jīng)核以及錐體束受累為主要表現(xiàn)的運動神經(jīng)元病，其病情進展迅速、預(yù)后極差，通常在發(fā)病后2～5 年因多器官衰竭而死亡[1]，因此也是一種具有致命性的神經(jīng)退行性疾病。絕大多數(shù)的ALS為散發(fā)性，家族性ALS 約占5%。目前尚無確切有效的針對ALS 的治療藥物。

無論是散發(fā)性還是家族性ALS，因其表現(xiàn)為漸進性的肌肉痿軟無力甚至萎縮，因此中醫(yī)認為其屬于“痿癥”。大多數(shù)的中醫(yī)醫(yī)家認為本病以本虛為主或虛實夾雜，其中本虛以脾腎陽虛為主，夾雜胃、肝和肺虧虛。因此，目前中醫(yī)大多使用健脾益氣補腎法治療ALS，取得了一定的療效[2]。然而，已發(fā)表的ALS 中醫(yī)臨床研究大多為個案報道或病例數(shù)較少，并且研究設(shè)計欠規(guī)范，也缺少機制研究，因此較難獲得廣泛的認可，對ALS治療的指導(dǎo)意義有限，極大地阻礙了中醫(yī)藥診治ALS 研究的發(fā)展。此外，既往研究建立的ALS 模型系統(tǒng)及治療策略既有優(yōu)勢，也存在不足[3]。

潘衛(wèi)東團隊與朱旭瑩團隊基于中醫(yī)藥治療ALS的確切療效，使用模擬散發(fā)性ALS 進程的條件性敲除ADAR2 基因的小鼠（AR2 小鼠）以及能夠反映家族性ALS 發(fā)病機制的SOD1G93A動物模型，對中醫(yī)藥治療ALS 的機制進行了有益的探索[4-5]。本文對ALS 發(fā)病機制的最新進展進行綜述，并且結(jié)合中醫(yī)藥治療ALS 基礎(chǔ)研究的新進展，提出探索中醫(yī)藥治療ALS 療效機制的研究策略，以期為中醫(yī)藥治療神經(jīng)退行性疾病的研究提供更多的理論依據(jù)。

1 ALS 的發(fā)病機制

既往研究認為ALS 的主要發(fā)病機制是運動神經(jīng)元損傷。隨著基因、分子細胞學和轉(zhuǎn)基因動物相關(guān)研究的進展，目前認為神經(jīng)膠質(zhì)細胞炎癥在ALS 發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。運動神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細胞相互作用，共同參與ALS 的發(fā)病。

1.1 神經(jīng)元損傷相關(guān)發(fā)病機制

1.1.1 興奮性神經(jīng)元毒性機制

ALS 的發(fā)病機制至今未明，特別是對于散發(fā)性ALS 的發(fā)病機制仍未達成共識。目前，興奮性神經(jīng)元毒性和鈣離子超載被認為是ALS 神經(jīng)元損傷的最主要機制之一，其中以興奮性氨基酸的細胞毒性誘發(fā)鈣離子過度內(nèi)流的細胞毒性假說為代表（圖1）。

圖1 興奮性氨基酸的細胞毒性誘發(fā)鈣離子過度內(nèi)流。A：正常編輯的離子型谷氨酸受體GluA2；B：條件性敲除ADAR2基因的小鼠（AR2小鼠）的運動神經(jīng)元僅表達Q/R 部位未編輯的GluA2，出現(xiàn)異常Ca2 +滲透，從而導(dǎo)致神經(jīng)元進行性死亡。

通過條件性敲除ADAR2 基因構(gòu)建模擬ALS發(fā)病及疾病進展的AR2 小鼠模型，ADAR2 缺乏導(dǎo)致小鼠脊髓前角細胞發(fā)生神經(jīng)變性，缺乏ADAR2 的運動神經(jīng)元表達未經(jīng)Q/R 位點編輯的GluA2，其亞基裝配中未經(jīng)編輯的離子型谷氨酸受體GluA2 出現(xiàn)異常Ca2＋滲透，從而導(dǎo)致神經(jīng)元進行性死亡。此外，在AR2 小鼠中，異常的AMPA 受體導(dǎo)致Ca2＋內(nèi)流而過度激活Ca2＋依賴的鈣蛋白酶（calpain）；鈣蛋白酶將1 號常染色體TARDBP基因編碼的TDP-43 蛋白降解成具有聚集傾向的片段，這些片段是TDP-43 致病的基礎(chǔ)；激活的鈣蛋白酶還可以通過切割參與核質(zhì)轉(zhuǎn)運的分子（包括核孔蛋白）破壞細胞核-細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運以及基因表達。上述證據(jù)啟發(fā)研究者針對ADAR2 基因表達下調(diào)，探索ALS 的分子靶向治療策略[6-7]，并且通過使用ADAR2 基因敲除動物模型開展了一系列干預(yù)策略研究。例如，給予AR2小鼠口服吡侖帕奈或者進行以腺病毒相關(guān)病毒為載體的ADAR2 基因治療，均取得了一定的療效，但均為臨床前研究[8-9]。在開展中醫(yī)藥治療ALS療效機制的研究時，可參考上述研究方法。

1.1.2 線粒體功能障礙

線粒體對于細胞的存活和代謝具有關(guān)鍵作用，對神經(jīng)元而言尤為重要。在神經(jīng)元中，除了通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP 以外，線粒體在磷脂合成、鈣穩(wěn)態(tài)和細胞凋亡中也具有重要作用。盡管大腦的質(zhì)量只占人體質(zhì)量的2%，但消耗了人體所產(chǎn)生的20%的ATP（靜止休息狀態(tài)），因此神經(jīng)元有著很高的代謝需求。鑒于神經(jīng)元的高代謝活性和能量需求，線粒體維持能量的產(chǎn)生以及鈣穩(wěn)態(tài)對于神經(jīng)元功能的維持而言尤為重要。

許多與家族性或散發(fā)性ALS 發(fā)病機制相關(guān)的蛋白如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）1、TDP-43、肉瘤融合蛋白（fused in sarcoma，F(xiàn)US）和C9orf72 二肽重復(fù)蛋白，已被證實與線粒體之間存在相互作用[10-11]。有研究發(fā)現(xiàn)，ALS 患者神經(jīng)元的細胞呼吸速率下降以及ATP 生成減少，此外在散發(fā)性ALS 患者的脊髓中發(fā)現(xiàn)電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的活性降低[12-13]。SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠在出現(xiàn)ALS 運動癥狀之前，腦和脊髓中ATP 的合成已受損，線粒體呼吸速率亦下降，并且貫穿于整個病程中，同時伴有電子傳遞復(fù)合物鏈活性的下降[14]。

WIEDEMANN 等[15]發(fā)現(xiàn)，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）通過調(diào)控線粒體運動促進BDNF 介導(dǎo)的神經(jīng)遞質(zhì)釋放；BDNF 通過酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）激活下游PI3K、PLC-γ 和瞬時受體電位陽離子通道（transient receptor potential cation channel，TRPC）信號通路，促進細胞內(nèi)鈣的釋放以及細胞外鈣離子內(nèi)流，該作用在突觸部位尤為明顯；線粒體外膜上的鈣離子感受器Miro1 與鈣離子結(jié)合后，促使線粒體從微管上脫落下來，并在突觸前部位聚集，為BDNF 介導(dǎo)的神經(jīng)遞質(zhì)的釋放提供能量。中醫(yī)藥治療ALS 的療效機制中是否也涉及調(diào)控運動神經(jīng)元的線粒體功能及其動態(tài)變化，有待進一步探索。

1.1.3 軸漿轉(zhuǎn)運障礙

軸漿轉(zhuǎn)運障礙可能是導(dǎo)致ALS 患者神經(jīng)元損傷的另一個重要途徑。BDNF 選擇性地結(jié)合并激活TrkB，二者結(jié)合是逆軸漿轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵一環(huán)。研究發(fā)現(xiàn)，JNK 相互作用蛋白3（JNK interacting protein 3，JIP3）可以通過與TrkB 的近膜區(qū)直接結(jié)合，將TrkB 連接至馬達蛋白kinesin-1 的輕鏈上，介導(dǎo)TrkB 的順軸突轉(zhuǎn)運，并且調(diào)節(jié)BDNF 誘導(dǎo)的細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，Erk）的激活以及軸突中絲狀偽足的形成[16]。

磷酸化的神經(jīng)絲蛋白（neurofilament protein，NFP）在病理狀態(tài)下進入軸突后，NFP輕鏈（neurofilament-light，NF-L）和NFP 中鏈（neurofilament-middle，NF-M）最先開始磷酸化；隨后，NF-M 和NFP 重鏈（neurofilament-heavy，NF-H）的磷酸化作用逐漸增強，而NF-L 的磷酸化程度逐漸減弱。在NFP 的磷酸化過程中，蛋白激酶A 和蛋白激酶C 等分別作用于其亞基的不同特異性序列上，促進多種底物磷酸化。NFP 過度表達（異常磷酸化）可導(dǎo)致其降解障礙或發(fā)生異常聚集，嚴重影響NFP 向軸漿運輸，引發(fā)神經(jīng)元變性，從而導(dǎo)致ALS。

上述研究闡述了SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的脊髓前角運動神經(jīng)元核周出現(xiàn)NFP 的異常磷酸化以及發(fā)生聚集的原因。通過基因調(diào)控抑制SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠運動神經(jīng)元核周NFP 的異常磷酸化，減少其在核周的異常聚集，維持細胞骨架的完整性，以及改善軸漿運輸，從而延緩神經(jīng)元變性，這可能也是中醫(yī)藥治療ALS 療效機制的研究方向之一。

1.1.4 神經(jīng)營養(yǎng)因子缺陷

神經(jīng)營養(yǎng)因子是一類能夠促進神經(jīng)元存活和分化以及維持功能完整的蛋白質(zhì)，包括BDNF、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF）、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）、胰島素樣生長因子（insulin like-growth factor，IGF）和成纖維生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）等[17]。在這些神經(jīng)營養(yǎng)因子中，BDNF 最受關(guān)注。BDNF 是腦內(nèi)含量最豐富的神經(jīng)營養(yǎng)因子，增強BDNF 信號已成為延緩ALS 病情進展的干預(yù)策略之一。

神經(jīng)營養(yǎng)因子可通過旁分泌、內(nèi)分泌或自分泌方式釋放。旁分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子來自于鄰近細胞如膠質(zhì)細胞、施萬細胞或毛細血管內(nèi)皮細胞和肌纖維等[18]。內(nèi)分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子則來源于遠端細胞如室管膜細胞，通過血液或腦脊液進行傳遞[19]。自分泌則是指運動神經(jīng)元自我提供神經(jīng)營養(yǎng)因子的能力。

通過小分子藥物調(diào)節(jié)BDNF 受體TrkB 以增強BDNF 信號的傳遞，可以延長體外退化神經(jīng)元的存活能力[20]，并使ALS 模型小鼠的運動神經(jīng)元丟失減少、運動能力提高[21]。BDNF 也被證實能夠增強體外培養(yǎng)的運動神經(jīng)元的存活能力[22]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）處理的神經(jīng)細胞和老年性癡呆小鼠模型中，活性異常升高的糖原合成酶激 酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）磷酸化發(fā)動蛋白1（dynamin-1，Dyn1）的第774 位絲氨酸，導(dǎo)致TrkB 內(nèi)吞以及下游Akt 信號通路激活受損；使用多肽TAT-Dyn1-SpS 可以特異性阻止GSK3β 對Dyn1 磷酸化，挽救受損的TrkB 內(nèi)吞以及下游Akt 信號激活，從而改善小鼠的學習和記憶能力[23]。

對于ALS 而言，神經(jīng)肌肉接頭（neuromuscular junction，NMJ）間的信號傳遞可以提供新的干預(yù)靶點，這是因為ALS 中存在神經(jīng)突觸末梢與肌肉之間的連接障礙。事實上，適當?shù)暮侠磉\動在延緩ALS 病情進展、保護NMJ 以及維持運動功能以提高生活質(zhì)量等方面顯示出一定的療效。BDNF基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯和分泌受神經(jīng)活動調(diào)節(jié)，而運動訓練能夠增加嚙齒動物脊髓和骨骼肌中BDNF mRNA 和蛋白的表達。在ALS大鼠模型中，大腦和跖肌中BDNF/TrkB 信號通路嚴重受損，而恢復(fù)BDNF 信號是一個很好的ALS 治療選擇，能夠通過結(jié)合TrkB 促進損傷的運動神經(jīng)元存活[24]。對于恢復(fù)BDNF 信號通路的探索，可能也是中醫(yī)藥治療ALS 療效機制的研究方向之一。

1.2 神經(jīng)炎癥相關(guān)發(fā)病機制

神經(jīng)炎癥是ALS 的病理學表現(xiàn)之一。神經(jīng)炎癥是由活化的小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞以及浸潤的CD4+和CD8+T 淋巴細胞引起，與ALS 病程有關(guān)[25-26]。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)炎癥可能由退化的運動神經(jīng)元與周圍小膠質(zhì)細胞之間的相互作用所引起，而小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的突觸修剪可能導(dǎo)致ALS神經(jīng)突觸的進行性丟失[27]。

與廣泛表達SOD 突變體的轉(zhuǎn)基因小鼠相比，僅在神經(jīng)元中表達SOD 突變體可能無法誘發(fā)運動神經(jīng)元疾病，或者運動神經(jīng)元疾病的發(fā)病較晚、進展緩慢并且小鼠的生存時間較長[28-29]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，在運動神經(jīng)元以外的其他細胞中表達SOD 突變體的動物模型仍出現(xiàn)ALS 病理學改變，表明運動神經(jīng)元之外的其他細胞對ALS 的致病至關(guān)重要[30-31]。并且，從ALS 動物模型的小膠質(zhì)細胞中特異性去除SOD 突變體后，其病情進展明顯延緩，存活率增加[32-33]。給予尚未出現(xiàn)癥狀的SOD1G37R轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）后可導(dǎo)致ALS 癥狀提前出現(xiàn)[34]。由此可見，小膠質(zhì)細胞參與了ALS的病理生理過程。

激活的小膠質(zhì)細胞至少有2 種不同的表型，即M1 型（毒性）和M2 型（保護性），以響應(yīng)不同的微環(huán)境信號，進而分泌多種效應(yīng)分子[35]。M1 型小膠質(zhì)細胞釋放促炎癥介質(zhì)，包括白細胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6、腫瘤壞死因子、趨化因子、前列腺素E2和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶等[30-31]。由抗炎細胞因子IL-4、IL-10 或IL-13誘導(dǎo)的M2 型小膠質(zhì)細胞能夠抑制炎癥，通過吞噬作用清除細胞碎片，促進細胞外基質(zhì)重建，并且通過釋放營養(yǎng)因子支持神經(jīng)元的存活[35]。對SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的小膠質(zhì)細胞進行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)參與抗炎途徑的基因（包括IGF1、顆粒蛋白前體和髓系細胞觸發(fā)受體2 基因）與潛在的神經(jīng)毒性因子（包括基質(zhì)金屬蛋白酶12 和經(jīng)典促炎細胞因子）相關(guān)基因的表達均上調(diào)[36]，表明ALS 小鼠同時表達M1 型和M2 型小膠質(zhì)細胞。

將野生型星形膠質(zhì)前體細胞局部移植至SOD1 基因突變大鼠的頸脊髓，可以延緩大鼠的疾病進展，并且延長生存時間[33]。反之，將表達SOD1G93A突變體的星形膠質(zhì)前體細胞移植至野生型小鼠的脊髓，可導(dǎo)致局部運動神經(jīng)元變性，引發(fā)中度的運動功能障礙[34]。由此提示，星形膠質(zhì)細胞在ALS 的病理進程中亦發(fā)揮一定的作用。

星形膠質(zhì)細胞經(jīng)誘導(dǎo)可表現(xiàn)為神經(jīng)毒性A1型反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞或神經(jīng)保護性A2 型反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞[35]。神經(jīng)炎癥刺激物（如LPS）可誘導(dǎo)生成神經(jīng)毒性A1 型反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞，引發(fā)神經(jīng)毒性以及促進神經(jīng)退行性變；缺血可誘導(dǎo)生成神經(jīng)保護性A2 型反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞，后者通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子以促進神經(jīng)保護和神經(jīng)修復(fù)。正常的星形膠質(zhì)細胞可以通過分泌某些因子（研究最多的是神經(jīng)營養(yǎng)因子），遠距離保護ALS 患者的運動神經(jīng)元。

2 基于臨床前研究制定中醫(yī)藥治療ALS 療效機制的研究策略

基于中醫(yī)理論“脾主四肢肌肉”“腎者作強之官”，ALS 的基本病機為脾腎陽虛。使用AR2小鼠模型開展中醫(yī)藥治療ALS 的療效研究，發(fā)現(xiàn)健脾補腎方能夠明顯改善小鼠的四肢握力，以及延緩疾病進展，推測可能是通過調(diào)控ADAR2 基因的表達而發(fā)揮作用。在SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，健脾補腎方的療效也得到了進一步的驗證，顯示健脾補腎方能夠明顯延遲ALS 的發(fā)病時間、改善運動功能以及延長生存時間；推測其作用機制可能是通過抑制NFP 異常磷酸化以及減少其在核周的聚集，從而維持細胞骨架的完整、減輕軸索的萎縮、改善軸漿運輸以及延緩神經(jīng)變性，繼而達到保護神經(jīng)細胞的目的[36]。

目前有不少基于中醫(yī)理論“健脾補腎”辨證論治ALS，并且取得一定療效的中藥方劑。這些方劑是否通過保護神經(jīng)元細胞和（或）調(diào)節(jié)膠質(zhì)細胞活性等機制而發(fā)揮治療作用，有待進一步探討。

本課題組認為，中醫(yī)藥治療ALS 療效機制的研究策略是開展中藥方劑干預(yù)不同的ALS 轉(zhuǎn)基因動物模型的療效驗證研究，旨在探索中藥方劑對于神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的作用以及其保護神經(jīng)元和調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細胞的分子機制，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠以進一步驗證中藥方劑治療ALS 的機制（圖2）。通過開展上述研究，提出中藥方劑及其活性成分對于神經(jīng)細胞毒性可能的作用機制，例如通過調(diào)節(jié)谷氨酸受體亞基的活性來調(diào)控病理性TDP-43 片段的聚集，改善神經(jīng)元的線粒體功能及其軸漿轉(zhuǎn)運，促進神經(jīng)營養(yǎng)因子的合成和分泌，或者在神經(jīng)膠質(zhì)炎癥中抑制有害炎癥以及調(diào)節(jié)抗炎活性因子等。

圖2 中醫(yī)藥治療肌萎縮側(cè)索硬化療效機制的研究策略