劉獻輝，張歆明，申翰欽，班艷芳，劉艷玲，張樂宜，宋長緒*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642；2.溫氏食品集團股份有限公司，廣東 新興 527400)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus，PCV)屬于圓環(huán)病毒科，目前為止已報道了3種基因型。豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)感染引起的疾病稱為豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(PCVAD)，主要包括斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning multisystemic weasting syndrome,PMWS)、豬皮炎與腎病綜合征(porcine dermatitis and nephropathy sysndrome,PDNS)與生殖系統(tǒng)疾病[1-2]，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。PCV2是一種單股無囊膜DNA病毒，基因組全長1 777 bp左右，主要包括兩個開放性閱讀框(ORFs)：編碼復(fù)制蛋白(Rep)的ORF1和編碼衣殼蛋白(CAP)的ORF2[3]。有研究表明，PCV2感染PK15細胞后能激活RIG-I/MDA5、cGAS/STING、NF-κB通路促進IFN-β的生成，IFN-β又能促進病毒的復(fù)制[4-5]。

先天免疫是機體防御病毒的第一道防線，模式識別受體(PRRs)是先天免疫系統(tǒng)中重要的免疫受體，它能夠識別病原微生物存在保守的病原結(jié)構(gòu)——病毒相關(guān)分子模式(PAMPs)，進而誘導(dǎo)天然免疫的應(yīng)答，激活信號級聯(lián)反應(yīng)，介導(dǎo)Ⅰ型干擾素(IFN)、細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生。PRRs包括Toll樣受體(TLRs)、視黃酸樣受體(RLRs)、NOD受體(NLRs)和細胞質(zhì)DNA受體[6]。先天免疫在防御病毒入侵過程中Ⅰ型IFN起著非常重要的作用，它能通過結(jié)合細胞表面的IFN受體，進而激活JAK-STAT信號通路，介導(dǎo)幾百種干擾素刺激基因(ISGs)轉(zhuǎn)錄表達，使細胞抵御病毒的感染[7]。

宿主蛋白G3BP1(GTPase-activating protein SH3domain-binding protein 1)是應(yīng)激顆粒(stress granules,SGs)重要組成分子，也是SGs的檢測標志。在細胞受到環(huán)境、病毒感染等壓力下,SGs形成蛋白-mRNA聚合物，導(dǎo)致翻譯停止[8]。SGs能通過隔絕人類免疫缺陷病毒(HIV)的RNA抑制其復(fù)制[9]。SGs還是RIG-I和MDA5的定居場所，G3BP1可促進識別病毒的RNA，促進干擾素的產(chǎn)生并抑制病毒的復(fù)制[10-11]。最近報道G3BP1通過調(diào)控SGs進而抑制豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的復(fù)制[12]，另外G3BP1可以調(diào)控IFN誘導(dǎo)的ISG表達，在干擾素信號通路中有著重要作用[13]，G3BP1還可以招募PKR促進先天性抗病毒應(yīng)答[14]。最近報道G3BP1可以促進cGAS識別DNA及催化cGAMP的產(chǎn)生，促進IFN-β的產(chǎn)生，表明G3BP1在宿主抵抗DNA病毒的感染過程中起著重要作用[15]。也有研究闡述了G3BP1可以通過正調(diào)控RIG-I介導(dǎo)的IFN-β表達，進而抑制RNA病毒的復(fù)制[16]。

盡管G3BP1在許多病毒感染過程中起著重要的調(diào)控作用，但未有報道其在PCV2感染過程中的功能。本文通過PCV2感染PK15細胞，研究豬的宿主蛋白G3BP1與PCV2感染過程的聯(lián)系，以更好地了解PCV2的免疫機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒和質(zhì)粒

PK15細胞、HEK293T細胞、真核表達質(zhì)粒pCMV-HA和PCV2毒株(PCV2d)均為實驗室保存。

1.2 抗體

兔源抗HA單抗、HRP標記山羊抗兔IgG均來自Sigma公司。

1.3 主要試劑

DMEM高糖細胞培養(yǎng)基、1%的鏈霉素和青霉素溶液、0.25%EDTA的胰酶購自Gibco公司；胎牛血清(FBS)購自Biological industries公司；高濃度質(zhì)粒提取試劑盒、病毒核酸提取試劑盒、組織細胞RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒購自美基公司，反轉(zhuǎn)錄試劑、Eastep qPCR Master Mix購自Promega公司。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000、RNAiMAX購自Invitrogen公司。干擾素刺激DNA(interferon stimulatory DNA，ISD)購自Invivogen公司。凝膠成像儀為天能公司產(chǎn)品。

1.4 真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建

G3BP1序列是從豬細胞中提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，經(jīng)PCR擴增得到的。參考NCBI上豬G3BP1(GenBank登錄號為XR_002339497.1)的序列，在G3BP1序列上分別引進EcoRⅠ和KpnⅠ兩個酶切位點，然后連接在pCMV-HA載體上，經(jīng)測序鑒定，獲得pCMV-HA-G3BP1真核表達載體。

1.5 G3BP1基因的過表達試驗

將PK15細胞接種到12孔板中，當細胞融合度達到60%左右時，將空載體與G3BP1載體按Lipofectamine 3000 Transfection Reagent 說明書每孔轉(zhuǎn)染1.2 μg，轉(zhuǎn)染 24 h后，分別以感染比(MOI)為0.1和1感染細胞。

1.6 G3BP1基因敲低試驗

根據(jù)豬G3BP1 mRNA序列設(shè)計了3條siRNA，如表1所示，由上海生工生物有限公司合成。按照合成說明書用二乙基焦碳酸酯(DEPC)水將siRNA稀釋至20 pmol/L，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩K15細胞接種于12孔板中，待細胞融合度達到50%左右時，按Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent說明書操作每孔轉(zhuǎn)染10 pmol，轉(zhuǎn)染24 h后提取細胞核酸用于定量分析敲低效果，或者用于接毒試驗。

表1 G3BP1 siRNA oligo序列

1.7 病毒接種試驗

對于G3BP1過表達或敲低的PK15細胞，分別以感染比(MOI)為0.1和1接毒，在37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h，然后用PBS清洗2遍，加入含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別在感染后12 h、24 h、48 h收毒，放-20 ℃冰箱。反復(fù)凍融3次后，提取病毒核酸，并用熒光定量PCR分析病毒的拷貝數(shù)。

1.8 病毒核酸的提取

采用試劑盒提病毒核酸。將12孔板里的病毒細胞液，反復(fù)凍融3次。病毒液混勻后，吸取200 μL病毒液加入20 μL蛋白酶K，然后加500 μL GRP溶液震蕩混勻,靜置10 min后，轉(zhuǎn)移到2 mL收集管的濾柱中，12 000g離心1 min，然后加500 μL RW1溶液后，離心1 min，再加入650 μL RW2溶液，離心1 min，最后12 000g離心2 min，甩干并通過濾柱后，把過濾柱放進干凈無菌的1.5 mL離心管中，加入DEPC水靜置2 min，離心收集病毒核酸。核酸放-20 ℃保存，方便用于后續(xù)試驗。

1.9 熒光定量PCR

熒光定量PCR引物如表2。定量引物通過Prime 3.0設(shè)計，PCV2定量引物參考文獻[17]。熒光定量PCR反應(yīng)體系如表3。

表2 熒光定量PCR引物

表3 熒光定量PCR反應(yīng)體系

反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性1 min ；94 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個循環(huán)。用絕對定量檢測PCV2病毒核酸并換算成拷貝數(shù)。用相對定量測定目的基因的相對表達水平，以β-actin基因表達為內(nèi)參，用2-ΔΔCT計算。

1.10 數(shù)據(jù)分析

用GraphPad Prism 5.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，使用Two-way ANOVA 對數(shù)據(jù)進行比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 真核表達載體pCMV-HA-G3BP1的構(gòu)建

PCR擴增豬G3BP1基因目的片段(1 700 bp)，利用T4連接酶方法將片段連接在pCMV-HA真核表達載體上。質(zhì)粒上有EcoRⅠ和kpnⅠ酶切位點，雙酶切鑒定和DNA測序后，確定為目的片段的正確克隆(圖1)。

M.DL5000 Marker；1.質(zhì)粒pCMV-HA G3BP1的酶切圖1 G3BP1真核表達載體的鑒定

2.2 真核表達載體pCMV-HA-G3BP1的表達驗證

將2 μg pCMV-HA空載質(zhì)粒和2 μg質(zhì)粒pCMV-HA-G3BP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到6孔板的293T細胞中，24 h后收取細胞，并用裂解液將細胞裂解。利用HA單抗進行Western blot檢測后，在60 kDa處可見特異性條帶(圖2)，與預(yù)期大小符合，表明G3BP1蛋白成功表達。

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測G3BP1的表達

2.3 過表達G3BP1促進PCV2的復(fù)制

PK15細胞轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和pCMV-HA-G3BP1，轉(zhuǎn)染 24 h后，用PCV2以MOI=0.1 和MOI=1 分別感染細胞。分別在感染12 h、24 h和48 h后，采用熒光定量PCR分析病毒的拷貝數(shù)，見圖3、圖4。

圖4 PCV2感染過表達G3BP1的PK15細胞Cap拷貝數(shù)(MOI=1)

過表達G3BP1試驗組與對照組相比，PCV2感染24 h后，病毒復(fù)制增強且差異顯著(P<0.05)，感染48 h后較感染24 h后病毒復(fù)制的差異更為顯著(P<0.01)。在MOI=0.1和MOI=1的感染細胞上，可觀察到一致的結(jié)果。

*P<0.05，***P<0.001。下同圖3 PCV2感染過表達G3BP1的PK15細胞Cap拷貝數(shù)(MOI=0.1)

2.4 siRNA的篩選和下調(diào)G3BPI表達對PCV2復(fù)制的影響

為研究敲低G3BP1對PCV2復(fù)制的影響，本研究設(shè)計了3條siRNA，分別作用于G3BP1 mRNA的不同靶點。PK15細胞轉(zhuǎn)染siRNA 24 h后，提取細胞RNA進行RT-PCR檢測，結(jié)果見圖5。檢測發(fā)現(xiàn)3條siRNA均能降低G3BP1 mRNA的表達，其中siRNA-187干擾效果最顯著。

當PK15細胞轉(zhuǎn)染對照siRNA和G3BP1-siRNA 24 h后，用PCV2 MOI=0.1和MOI=1分別感染細胞。敲低G3BP1試驗組與對照組相比，PCV2感染24 h 后病毒復(fù)制顯著減弱(P<0.05)，感染48 h后比感染24 h后病毒復(fù)制的基因拷貝數(shù)降低，差異極顯著(P<0.001)。用MOI=0.1和MOI=1可觀察到一致的結(jié)果，見圖6、圖7。

與NC-siRNA組比較，**P<0.01圖5 熒光定量 PCR 檢測siRNA 干擾G3BP1 mRNA表達水平

圖6 PCV2感染G3BP1敲低的PK15細胞Cap基因拷貝數(shù)(MOI=0.1)

圖7 PCV2感染G3BP1敲低的PK15細胞Cap基因拷貝數(shù)(MOI=1)

2.5 過表達G3BP1促進ISD誘導(dǎo)和PCV2感染中IFN-β的表達

細胞過表達G3BP1 24 h后，轉(zhuǎn)染2 μg/mL ISD刺激12 h，熒光定量PCR檢測IFN轉(zhuǎn)錄水平見圖8,可觀察到過表達G3BP1促進ISD誘導(dǎo)IFN-β的表達。用PCV2 MOI=1感染細胞，12 h可觀察到IFN-β轉(zhuǎn)錄水平增加，PCV2感染12 h，病毒復(fù)制沒有顯著差異，所以，選取感染12 h后的細胞，檢測其中的IFN-β轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，過表達G3BP1顯著促進了IFN-β的表達(圖9)。

圖8 ISD刺激12 h后的IFN-β mRNA的表達

圖9 PCV2感染12 h后的IFN-β的表達

2.6 G3BPI的敲低抑制ISD誘導(dǎo)和PCV2感染中IFN-β的表達

2 μg/μL ISD刺激敲低G3BP1后的細胞，用熒光定量PCR檢測IFN轉(zhuǎn)錄水平。與對照組相比，敲低G3BP1，能抑制ISD誘導(dǎo)的IFN-β mRNA的轉(zhuǎn)錄(圖10)；用PCV2 MOI=1感染細胞，感染12 h后檢測IFN-β轉(zhuǎn)錄水平(圖11)，敲低G3BP1組能抑制IFN-β mRNA的轉(zhuǎn)錄。

圖10 ISD刺激后的IFN-β mRNA的表達

圖11 PCV2感染12 h后的IFN-β mRNA的表達

3 討論

有研究報道，G3BP1能促進環(huán)鳥苷酸-胺苷酸合酶(cGAS)識別DNA及催化環(huán)二核苷酸(cGAMP)的產(chǎn)生，進而介導(dǎo)IFN-β的表達，U937細胞敲掉G3BP1后，用ISD和HT-DNA刺激，缺失G3BP1的細胞IFN-β水平降低，感染人皰疹病毒1型(HSV-1)24 h后，缺失組IFN-β的表達明顯降低，進而病毒的復(fù)制與正常細胞組相比明顯提高[18]。最近也有研究表明，G3BP1能結(jié)合病毒的雙鏈RNA和RIG-I促進IFN-β的表達，進而調(diào)控抗病毒免疫來抑制RNA病毒的復(fù)制，用Poly I:C處理，或用仙臺病毒(SeV)感染G3BP1敲低(或敲除)的HEK293T細胞，都能抑制IFN-β的產(chǎn)生，用SeV和水皰型口炎病毒(VSV)感染敲除G3BP1的HEK293T細胞，與正常細胞組相比病毒復(fù)制顯著增強[10,16]。雖然應(yīng)激顆粒主要是調(diào)控RNA病毒，但也有報道DNA病毒例如人乳頭瘤病毒(HSV)能影響應(yīng)激顆粒SG[19]。過去的研究表明，PCV2可以激活 cGAS/STING、RIG-I/MDA5與NF-κB信號通路，上調(diào)IFN-β的表達，IFN-β進而能促進PCV2的復(fù)制[4-5,20]，但是IFN-β促進PCV2的復(fù)制機制尚未研究清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)，G3BP1能正調(diào)控PCV2的復(fù)制，G3BP1能促進ISD刺激IFN-β的表達，也能促進PCV2感染初期的IFN-β 產(chǎn)生，所以G3BP1很可能是通過上調(diào)IFN-β，從而促進PCV2的復(fù)制。然而G3BP1是否調(diào)控RIG-I/MDA5通路，或者通過調(diào)控cGAS/STING通路增強宿主天然免疫，促進IFN-β的上調(diào)，進而增強PCV2的復(fù)制，這一問題有待探究，此外，PCV2感染是否能影響應(yīng)激顆粒SG的形成，進而調(diào)控病毒的復(fù)制，這一問題也有待研究。本文章的局限是未清晰的解釋G3BP1是否通過促進IFN-β 的表達促進PCV2的復(fù)制，需要進一步研究IFN-β 促進PCV2復(fù)制的機制。

綜上所述，在PK15細胞上，宿主蛋白G3BP1顯著促進PCV2的復(fù)制，很可能是通過上調(diào)IFN-β表達引起的。