張 琳，宗 寧，劉 奎，趙煥蘭，苗 敏

番茄WD40家族204調控植株形態(tài)建成的功能分析

張 琳，宗 寧，劉 奎，趙煥蘭，苗 敏*

(合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院，合肥 230601)

作物的株高是非常重要的農(nóng)藝性狀，影響農(nóng)作物的品質和產(chǎn)量。植物中WD40蛋白在細胞周期調控等方面具有重要作用。克隆了番茄204基因，利用植物基因工程技術，構建植物過表達載體pBI121-35S::204，通過農(nóng)桿菌介導法獲得過表達轉基因植株。生物信息學分析表明該蛋白含有典型的WD40蛋白基序。定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)在番茄各器官及果實發(fā)育不同時期該基因均有表達。觀察發(fā)現(xiàn)204過表達轉基因植株相對于野生型植株，表現(xiàn)出較長的莖稈長度，表明該基因是番茄植株高度的正向調控因子。酵母雙雜交文庫篩選發(fā)現(xiàn)轉錄因子SlSPL3與SlWDR204具有相互作用，SlWDR204與SlSPL3可能共同調控番茄植株的莖桿發(fā)育。該研究增加了對番茄WD40蛋白參與株高調控的認知。

番茄；204基因；株高；轉錄因子；3基因

植株的株高是非常重要的農(nóng)藝性狀，影響農(nóng)作物的品質和產(chǎn)量，株高相關基因功能的研究，對作物的育種和生產(chǎn)提供重要的指導意義。植物莖稈的生長發(fā)育可受多種因素的影響，主要包括植物激素、細胞周期、轉錄因子、蛋白質的修飾、細胞壁的合成、光合產(chǎn)物合成及轉運等相關基因的表達和調控[1-3]。番茄中1基因通過調控油菜素內酯的信號傳導通路，發(fā)揮其調控植物生長發(fā)育的功能，1基因沉默可導致植株幼苗下胚軸縮短，營養(yǎng)生長期植株矮化[4]。番茄3-15基因通過調節(jié)番茄體內生長素（IAA）的含量影響植株生長，過表達3-15基因，可導致植株矮化[5]。水稻10基因通過抑制節(jié)間的細胞分裂及伸長相關基因的表達，降低水稻的株高[6]。擬南芥轉錄因子ICE1與赤霉素（GA）合成基因34的啟動子相結合，抑制該基因的表達，在1-的突變植株中，該赤霉素合成基因的表達量上升，GA含量增加導致植株變高[7]。水稻的DDM1參與DNA的甲基化，該蛋白功能的缺失導致許多重復序列和轉座子DNA甲基化的程度下降，使水稻的株高變矮[8]。水稻的纖維素合成酶CSLF6是細胞壁合成途徑中的重要成員，該蛋白功能缺失導致水稻株高變矮[9]。植株中調控株高相關機制研究大多與激素合成及其信號轉導相關，而其他調控機制的研究較少。

WD40蛋白又被稱作為WD-repeat蛋白，此類蛋白的WD基序約含有40 ~ 60個氨基酸殘基，一般由4 ~ 10個高度保守的串聯(lián)重復的WD組成。其N 端有一個甘基酸組氨酸二肽（Gly-His，GH），C 端有一個色氨酸天冬氨酸二肽（Trp-Asp，WD）。WD40蛋白廣泛存在真核生物中，在細菌中也有報道[10-11]。WD40家族蛋白作為CUL4-DDB1泛素連接酶復合體的成員，參與底物的識別和結合，通過對底物的泛素化修飾而調節(jié)蛋白的穩(wěn)定性或細胞定位而參與調控植物的生長發(fā)育以及脅迫響應進程等生理活動[12]，包括細胞質的移動、細胞的分裂、細胞的程序性死亡、花的發(fā)育、結果、光的信號感受和傳導等[13-14]。在擬南芥和煙草中發(fā)現(xiàn)WD40蛋白參與植物株高的調節(jié)，擬南芥WD40蛋白Atlg65030通過調控細胞的有絲分裂而影響植物生長發(fā)育，該蛋白功能的缺失，導致擬南芥在營養(yǎng)生長期的長勢較弱小[15]；煙草的WD40蛋白NtTTG2可調控生長素受體因子（ARF）的表達，2可增加8、17和19的表達，正調控植物的株高[16]。而在番茄中，WD40蛋白對株高的調控尚鮮見報道，因此，作者對番茄WD40蛋白SlWDR204調控植株高度的功能進行探討。

番茄中含有100個WD40蛋白，調控多種生理活動機制[17]。 SlWDR204是WD40家族的成員之一，前期研究表明，SlWDR204通過參與切除修復受損的DNA而響應紫外線脅迫應答[18]以及正調控植物對干旱的耐受性[19]。SlWDR204作為WD40蛋白，在植物生理的研究中主要是集中在植物脅迫響應方面。本研究克隆了番茄的204基因，分析該基因在番茄各組織中的表達譜，以204基因的編碼序列為靶標，作者構建了204基因的過量表達載體pBI121-35S::204，并利用根瘤農(nóng)桿菌介導法將重組基因轉化到野生型番茄中，分析204過表達植株中該基因的表達水平的提高，以增加番茄植株的株高。

1 材料與方法

1.1 材料

番茄（Mill. cv. Ailsa Craig），來自美國康奈爾大學植物研究所（THOMPSON），由本實驗室繁育保存；pBI121-35S載體，農(nóng)桿菌（）EHA105菌株、酵母菌（）EGY48菌株，均為本實驗保存；酵母雙雜交載體pEG202和pJG4-5來自美國愛達荷大學Fangming Xiao教授的實驗室。反轉錄試劑盒、DNA聚合酶、T4連接酶、限制性內切酶以及質粒提取試劑盒等常用試劑信息見表1。

表1 常用試劑信息

1.2 方法

1.2.1 番茄204基因的表達譜測定 根據(jù)番茄204（Solyc09g031610. 2. 1）的基因組序列，設計該基因的定量引物為204RTF和204RTR，以番茄的3為內參基因（引物序列見表2），利用熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測204基因在番茄野生型（AC+）植株的根（Root）、莖（Stem）、葉（Leaf）、花（Flower）、成熟綠果（MG，Mature green）、破紅果實（BR，Break red）和成熟紅果（RR，Ripe red）各器官中的表達量。

1.2.2204的過表達 根據(jù)番茄204（Solyc09g031610. 2. 1）基因設計特異性引物204FI和204RI（引物序列見表2），擴增所得PCR產(chǎn)物，使用限制性內切酶I和I酶切PCR產(chǎn)物，并使用T4連接酶連接至載體pBI121，II為篩選標記基因，載體的結構圖如圖1所示。

1.2.3 番茄204-OE轉基因植株的構建 將構建好的載體轉化入農(nóng)桿菌EHA105中，通過農(nóng)桿菌介導法，構建番茄pBI121-35S::204轉基因愈傷組織[20]。愈傷組織在不同濃度卡那霉素MS培養(yǎng)基上篩選再分化成苗后，移栽至溫室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照18 h，黑暗6 h，溫度26 ℃。待幼苗恢復生長狀態(tài)后，取葉片提取植物DNA，采用PCR擴增標記基因II進行轉基因植株鑒定。鑒定引物為IIF和IIR，具體引物序列見表2。

表2 本研究使用引物信息

圖1 構建轉基因植物過表達載體原理圖

Figure 1 Schematic diagram of constructing transgenicoverexpression vector

1.2.4 qRT-PCR分析番茄204轉基因植株的表達 Trizol法提取204轉基因植株以及野生型植株幼嫩葉片的RNA，提取后的RNA用abm反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，進行定量PCR的鑒定。定量引物分別為204RTF以及204RTR，番茄3為內參基因（引物序列見表2）。選取目的基因204表達水平顯著性升高的過表達植株及表達水平顯著降低的下調表達植株進行表型分析。

1.2.5 酵母雙雜交篩選及驗證 根據(jù)番茄基因204（Solyc09g031610.2. 1）序列設計含酶切位點R I和I的特異性引物，通過限制內切酶和T4連接酶將目的基因的編碼序列構建至載體pEG202。將重組誘餌質粒pEG202-204轉化至酵母菌株EGY48中，將番茄文庫質粒轉化至帶有誘餌質粒的酵母克隆中，于營養(yǎng)缺陷型三缺培養(yǎng)基（-Ura，-His，-Trp）進行篩選培養(yǎng)。將克隆轉至營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基（-Ura，-His，-Trp，-Leu）和顯色培養(yǎng)基（-Ura，-His，-Trp，X-gal）中篩選相互作用的陽性克隆。提取陽性克隆質粒并進行測序鑒定[21]，所用引物序列見表2。

根據(jù)3（Squamosa promoter binding-like protein）基因（Solyc07g062980.2）設計含酶切位R I和I的特異性引物3FR I和3RI（引物序列見表2），將該基因構建至載體pJG4-5中，所得質粒pJG4-5-3，與原誘餌質粒pEG202-204共同轉化至酵母菌株EGY48中，驗證SlSPL3與SlWDR204之間的相互作用。

2 結果與分析

2.1 番茄SlWDR204蛋白結構域以及同源序列分析

番茄204基因的編碼區(qū)為1 764 bp，位于番茄第9號染色體上，所編碼的蛋白質長度587aa[17]。通過蛋白質結構域分析網(wǎng)站（www.sbg.bio.ic.ac.uk）分析SlWDR204的氨基酸序列的三維結構(圖2A)，DWD-box位于蛋白空間結構偏表層的位置，圖中黑色結構即為DWD-box結構域(圖2B)，預測該結構域主要與DNA損傷位點的組蛋白結合的功能有關，啟動DNA-UV損傷修復的調控；SlWDR204蛋白含有1個保守的DWD（DDB1 binding WD40）模塊和2個重復WD-40 repeat結構域，對番茄SlWDR204的氨基酸序列與其他物種的同源蛋白進行同源分析（圖2C），發(fā)現(xiàn)煙草NtDDB2（NW-015866056.1）、擬南芥AtDDB2（ANP-200684.2）及水稻OsDDB2（NC-029256.1）的氨基酸序列與SlWDR204的同源性較高，這些蛋白的氨基酸一致性均達到50%以上，說明SlWDR204是DDB2同源蛋白且在植物中相對保守。

2.2 番茄SlWDR204基因的表達模式分析

為進一步研究番茄204基因的分子生物學功能，分析該基因在番茄各組織中的表達模式，利用qRT-PCR測定番茄的不同器官中，如根、莖、葉、花以及不同時期果實中204基因的表達水平。研究發(fā)現(xiàn)，204基因在番茄各組織均有表達（圖3），說明該基因可在多個器官中行使功能，調控多種生長發(fā)育機制。該基因于根、莖、葉、花的表達水平相近，在成熟綠果、破紅果實以及成熟紅果中的表達水平逐漸上升，而在成熟紅果中的表達水平最高，顯著高于番茄的其他組織。

A. SlWDR204蛋白的三維結構圖；B. DWD-box在SlWDR204蛋白空間結構的位置，圖中黑色箭頭所指虛線框中的黑色結構為DWD-box結構域；C. SlWDR204蛋白與其他物種中同源蛋白的氨基酸序列比對圖（同源序列已用相同背景的顏色標出）。

Figure 2 Domain analysis of SlWDR204 protein and sequence alignment with other homologous proteins

圖 3 SlWDR204基因在番茄各組織中的表達模式

Figure 3 Expression pattern of204 gene in various tissues of

2.3 SlWDR204過表達和RNAi的轉基因植株鑒定

前期的研究已獲得番茄204基因的下調表達植株[19]。為進一步研究番茄204基因的功能，通過農(nóng)桿菌介導番茄轉化獲得204基因過量表達轉基因植株。qRT-PCR檢測轉基因植株中204基因的表達量。其中下調表達植株（RNAi）中有兩株基因水平顯著下調，表達量分別為野生型（AC+）表達量的0.3和0.4；過表達植株（OE）中有兩株基因水平顯著上調，表達量分別為野生型（AC+）表達量的6.2和4.3 (圖4)。

圖4 轉基因植株的SlWDR204基因表達量的qRT-PCR分析

Figure 4 qRT-PCR analysis of204 gene expression in204 transgenic plants

2.4 番茄SlWDR204基因的過表達影響植株的株高

對6周齡的轉基因植株的株高進行測量，發(fā)現(xiàn)204過表達株系的株高顯著高于野生型，204基因的表達量上調可增加植株的株高；而RNAi沉默株系的株高與野生型相比，沒有顯著的變化，具體見圖5A和圖5B。說明在番茄204基因正調控番茄植株的高度，但由于番茄中有100個WD40蛋白，存在功能冗余，導致204下調表達并未表現(xiàn)出植株的矮化。

A. 生長6周的番茄植株株高；B. 株高的測量數(shù)據(jù)。

Figure 5 Plant height of transgenic

圖6 SlSPL3和SlWDR204在酵母中具有相互作用

Figure 6 SlSPL3 interacts with SlWDR204 in yeast

2.5 SlWDR204與SlSPL3轉錄因子具有相互作用

利用酵母雙雜交系統(tǒng)，篩選番茄cDNA文庫中與SlWDR204具有相互作用的蛋白，得到番茄的SlSPL3轉錄因子與SlWDR204具有相互作用，且篩選出3個重復的克隆均為SlSPL3的部分片段。為驗證轉錄因子SlSPL3的全長蛋白與SlWDR204的相互作用，將pEG202-204和pJG4-5-3共轉化至酵母菌株EGY48中（圖6A），分別設置pEG202-204和pJG4-5（圖6B）、pEG202和pJG4-5-3（圖6C）為兩組負對照。在三缺顯色培養(yǎng)基Gal/Raff（-Ura，-His，-Trp，X-gal）上30 ℃培養(yǎng)24 h后觀察陽性藍色克隆。含有pEG202-204和pJG4-5-3的酵母克隆顯示藍色，而兩組負對照均未顯示藍色，說明SlSPL3轉錄因子全長蛋白與SlWDR204蛋白具有相互作用。

3 討論與結論

對番茄SlWDR204蛋白的氨基酸和蛋白結構域的分析結果表明，該蛋白含有2個保守的WD40-repeat基序，與多種植物種中參與紫外修復的WD40蛋白DDB2的同源性較高，暗示該蛋白參與紫外損傷修復進程，且極有可能是通過作為CUL4-DDB1泛素連接酶復合物中組分而發(fā)揮作用。204的組織表達模式顯示該基因在各組織中均有表達，表明該基因參與番茄多種生長發(fā)育過程；特別是在果實發(fā)育的破色期與成熟期表達量較高，暗示204極有可能調控番茄果實的成熟及相關生理特性。

前期研究發(fā)現(xiàn)204基因正調控植物的干旱脅迫，204基因的下調表達導致轉基因番茄植株對干旱的耐受性降低[19]。在番茄中過量表達204基因時，發(fā)現(xiàn)番茄的株高隨著204基因表達量的增加而增高，說明該基因正調控植株的莖桿發(fā)育。而204基因下調表達的轉基因植株的高度無明顯改變，可能與WD40家族的基因冗余有關。

WD40蛋白在生物體內一般作為底物蛋白識別因子而發(fā)揮作用。為深入探究204基因的功能，我們利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選番茄中與SlWDR204具有相互作用的蛋白，發(fā)現(xiàn)轉錄因子SlSPL3與SlWDR204具有相互作用。前期的研究表明SlWDR204定位于細胞核[19]，表明SlSPL3轉錄因子在細胞核中與SlWDR204蛋白發(fā)生相互作用。SPL轉錄因子是植物特有的一類轉錄因子，在調控植物的生殖生長發(fā)育及響應脅迫等生理活動中發(fā)揮重要作用[22]。有研究發(fā)現(xiàn)水稻3調控植株的高度，水稻株高相關基因的表達受轉錄因子3的靶向調節(jié)，過表達3基因激活株高相關基因的表達，從而導致水稻株高增加[23]。在番茄中SlWDR204極有可能通過CUL4-DDB1- SlWDR204復合體泛素化修飾底物蛋白SlSPL3，影響其活性或穩(wěn)定性從而實現(xiàn)對株高性狀的調節(jié)。下一步我們將通過3轉基因植株的構建、SlSPL3蛋白活性與穩(wěn)定性、SlSPL3靶向調節(jié)基因等深入研究，進一步解析SlWDR204與底物SlSPL3參與調控植株高度的分子生物學機制。

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The functional analysis ofWD40 family204 in regulating plant morphogenesis

ZHANG Lin, ZONG Ning, LIU Kui, ZHAO Huanlan, MIAO Min

(School of Food and Biological Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230601)

The plant height of crop is a very important agronomic trait, which affects the quality and yield of crops. The WD40 protein in plants plays an important role in cell cycle regulation. In this study, we cloned the204 gene, constructed the plant over-expression vector pBI121-35S::204 by plant genetic engineering technology, and obtained over-expressed transgenic plants through the-mediated method. The result showed that the protein contains a typical WD40 protein motif by bioinformatics analysis, and quantitative RT-PCR analysis indicated that the gene was expressed at various stages oforgans and fruit development. It was found that the stalk length of204 overexpressing transgenic plants was longer than wild-type plants, indicating a positive regulator of the plant height of. The transcription factors SlSPL3 interacted with SlWDR204 had been revealed by screening of the yeast two-hybrid library. SlWDR204 and SlSPL3 may jointly regulate the stem development ofplants. The recognition of theWD40 protein on the plant height regulator is enhancing.

;204 gene; plant height; transcription factor;3 gene

S641.2; Q945.78

A

1672-352X (2021)01-0040-06

10.13610/j.cnki.1672-352x.20210319.011

2021-3-23 10:21:25

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20210319.1543.022.html

2020-04-21

國家自然科學基金項目（31701059，31970345）資助。

張 琳，碩士研究生。E-mail：785537147@qq.com

苗 敏，博士，副教授。E-mail：minmiao@hfut.edu.cn