杜小琴, 梁正杰, 夏 炎, 張小琴, 張萬超, 韓金龍, 吳中寶*

多花黃精炮制品與生品不同提取物抗運動疲勞作用的比較

杜小琴1, 梁正杰1, 夏 炎1, 張小琴1, 張萬超1, 韓金龍2, 吳中寶1*

(1. 重慶市藥物種植研究所，特色生物資源研究與利用川渝共建重點實驗室，南川 408435；2. 山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品研究所，濟南 250100)

對多花黃精炮制品與生品中多糖類成分、皂苷類成分、黃酮類成分的抗運動疲勞作用進行比較研究。隨機將小鼠分為7組，即空白組、多花黃精炮制品組/生品多糖組、炮制品皂苷組/生品皂苷組及黃酮炮制品組/生品黃酮組，連續(xù)灌胃給藥30 d后，測定小鼠負重游泳時間、耐缺氧時間、乳酸（LA）含量、乳酸脫氫酶（LDH）活性、肝糖原含量和肌糖原含量。結(jié)果表明，多花黃精炮制品中多糖類成分為抗運動疲勞活性物質(zhì)。多花黃精生品中多糖類成分、皂苷類成分為抗運動疲勞活性物質(zhì)，其中多糖類成分在提高小鼠負重游泳時間、耐缺氧時間及肝糖原含量上極顯著地高于空白組（＜0.01）。多花黃精炮制品、生品不同提取物與空白組相比，在血清LA含量、LDH活性及肌糖原含量上不具有統(tǒng)計學差異。多糖類成分為多花黃精主要的抗運動疲勞活性物質(zhì)，生品中多糖類成分抗運動疲勞活性強于炮制品。

多花黃精；炮制品；生品；多糖；運動疲勞

黃精為百合科植物滇黃精Coll. et Hemsl.、黃精Red.或多花黃精Hua.的干燥根莖。多花黃精主產(chǎn)區(qū)為湖南、安徽等地[1]，重慶地區(qū)也有種植[2]。運動疲勞是指機體不能將它的功能保持在某一特定水平或不能維持某一預定的運動強度[3]，持續(xù)性或重度疲勞不僅會影響正常生活，還會導致內(nèi)分泌紊亂、免疫力下降，甚至出現(xiàn)器質(zhì)性疾病，威脅身體健康?！兜啦厣裣芍ゲ萁?jīng)》記載：“黃精，寬中益氣，肌肉充盛，骨體堅強，其力倍，多年不老”，即黃精具有強身健體功效?，F(xiàn)代藥理學研究表明，黃精中的多糖類成分可通過抗氧化性能清除自由基及減少機體由于疲勞引起的代謝產(chǎn)物堆積[4-5]，也可通過免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮抗運動疲勞功效[6-7]，且毒副作用小。關于黃精其他成分的報道較少，對于黃精炮制品與生品不同提取物抗運動疲勞作用的對比研究也較少。有關黃精炮制與功效的關系，古代醫(yī)家認為服用炮制黃精有保健功效，服用生品黃精有藥用功效[1]。本文通過小鼠負重游泳實驗、耐缺氧實驗及相應生化指標的測定，對多花黃精炮制品與生品中多糖類成分、皂苷類成分、黃酮類成分提取物的抗運動疲勞作用進行了對比研究，以期為多花黃精抗疲勞產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃精源于湖南省安化金字山中藥材專業(yè)合作社，經(jīng)中藥資源分類專家劉正宇鑒定為多花黃精（Hua.）；實驗動物為昆明種小鼠，清潔級，雌雄兼用，體重18～22 g，北京斯貝福實驗動物有限公司，合格證號為SCXK9（京）2016-0002；乳酸試劑盒和肝/肌糖原試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；Ⅱ型澄清劑 ZTC 1+1，武漢正天成生物科技有限公司；乙醇、氯仿、甲醇及正丁醇等均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 多花黃精的炮制 取黃精鮮品，去雜質(zhì)后清洗，置于容器內(nèi)，蒸煮、晾曬，重復6次，至內(nèi)外呈滋潤黑色，味甜無麻味時，切厚片，低溫干燥。

1.2.2 多花黃精炮制品與生品中多糖類成分、皂苷類成分、黃酮類成分的提取、純化

（1）多糖類成分的提取與純化。

提取：取300 g凈制后的0.5 cm×0.5 cm的塊狀黃精鮮品和100 g過65目篩的黃精炮制品，分別加入4倍重量的蒸餾水，回流提取2 h，收集濾液；加入2倍重量的蒸餾水回流提取1.5 h，重復1次；合并3次濾液，濃縮至300 mL。

澄清：澄清劑ZTC 1+1，分為 A液和B液。加入4%的B液，攪拌10 min后，再加入澄清劑2%A液，攪拌10 min，靜置24 h后抽濾，將濾液濃縮至200 mL。

醇沉：加入600 mL無水乙醇，攪拌均勻后靜置12 h，去上清液后，加入100 mL蒸餾水，攪拌均勻后加入400 mL無水乙醇，攪拌均勻后靜置12 h，去上清液后減壓干燥，得多花黃精炮制品/生品多糖類成分提取物。

含量測定：參照《中國藥典》（2015版）中黃精多糖的含量測量方法，多花黃精炮制品多糖類成分的含量為70.21%，生品多糖類成分的含量為73.34%。

（2）皂苷類成分的提取與純化。

提?。簠⒄諒堄⑺穂8]的方法，稍有改動。取過65目篩的多花黃精炮制品/生品進行超聲提取，其中乙醇濃度78%，料液比1:20 g·mL-1，超聲溫度58℃，超聲時間75 min，分別重復3次，合并濾液，減壓干燥。

純化：將制備得到的含有黃精皂苷的粗提物通過硅膠色譜柱，洗脫液為氯仿-甲醇-正丁醇-水（10: 5:1: 4），純化產(chǎn)物減壓干燥后，得多花黃精炮制品/生品皂苷類成分提取物。

含量測定：參照張英朔[8]的方法，經(jīng)測定多花黃精炮制品皂苷類成分的含量為61.03%，生品皂苷類成分的含量為60.65%。

（3）黃酮類成分的提取與純化。

提?。喝∵^65目篩的黃精炮制品/生品進行回流提取，其中乙醇濃度70%、提取溫度70℃、料液比為1:20 g·mL-1、提取時間為2.5 h、提取次數(shù)為2次，合并提取液，作為黃精炮制品/生品黃酮類成分粗提液。

純化：將該粗提液作為上樣液，吸附于預處理好的AB-8大孔吸附樹脂，其中樣液pH值為6.0，吸附溫度為25℃，吸附時間為8 h。待完全吸附后以去離子水洗脫，以95%乙醇解吸，收集解析液，減壓干燥，得多花黃精炮制品/生品黃酮類成分提取物。

含量測定：參照劉清華等[9]的方法。經(jīng)測定多花黃精炮制品黃酮類成分的含量為64.67%，生品黃酮類成分的含量為60.65%。

1.2.3 動物實驗 選用210只昆明種小鼠，清潔級，雌雄兼用，體重18～22 g，適應性飼養(yǎng)1周。隨機分為7組，每組30只，即空白組、黃精炮制品組/生品多糖組、黃精炮制品組/生品皂苷組、黃精炮制品組/生品黃酮組。各給藥組均按照1.85 g·kg-1（藥材/體重）給藥，對照組給同體積的生理鹽水，每天給藥1次，小鼠連續(xù)給藥30 d，測定各指標。

（1）負重游泳實驗。每組隨機取小鼠10只，雌雄各半，末次給藥30 min后，將小鼠放入水槽中進行游泳試驗，水深30 cm，水溫 25℃±1℃，每只小鼠尾部負重為體重的 5%，記錄每只小鼠游泳持續(xù)時間（自放入水中至頭部不能浮出水面10 s的時間）。

（2）耐缺氧實驗。每組隨機取小鼠10只，雌雄各半，末次給藥1 h 后，將小鼠同時分別放入250 mL 磨口瓶內(nèi)（每瓶1只），其中每個瓶中放入10 g鈉石灰，在瓶口處均勻涂上凡士林密封。從小鼠放入瓶中密封開始計時，記錄小鼠在磨口瓶中存活的時間。

（3）乳酸脫氫酶(LDH)活力，乳酸(LA)、肌糖原和肝糖原含量測定。取每組剩余小鼠，末次給藥30 min后，將小鼠置于水槽中進行游泳試驗，水深30 cm，水溫30℃±1℃，游泳90 min（不負重），游泳結(jié)束休息10 min后，將小鼠摘眼球取血，處死動物，立即取肌肉與肝臟。血液標本分離血清用于乳酸（LA）、乳酸脫氫酶(LDH)活力的測定；肌肉與肝臟置于0℃生理鹽水中，剔除結(jié)締組織，用濾紙吸干，研磨，勻漿，過濾，用于肌糖元、肝糖原含量檢測，具體方法按試劑盒說明書進行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用 SPSS 統(tǒng)計軟件進行處理，以（`x±s）表示。以＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 多花黃精炮制品與生品中多糖類成分的抗運動疲勞效果比較

由表1可知，多花黃精炮制品、生品中的多糖類成分連續(xù)給藥30 d后，小鼠的負重游泳時間分別為（14.42±1.77）和（14.87±2.02）min，顯著長于空白組的（12.26±1.84）min（＜0.05）。生品中多糖類成分給藥后的小鼠負重游泳時間比炮制品多3.1%，差異顯著（＜0.05）；比空白組多21.3%，差異性達到極顯著（＜0.01）。

多花黃精炮制品、生品中的多糖類成分連續(xù)給藥后，小鼠的耐缺氧時間分別為（32.27±2.86）和（32.91±2.81）min，顯著長于空白組的（30.05±2.46）min（＜0.05）。生品中多糖類成分給藥后的小鼠耐缺氧時間比炮制組多2.0%，差異顯著（＜0.05）；比空白組多9.5%，差異性達到極顯著（＜0.01）。

多花黃精炮制品、生品中的多糖類成分連續(xù)給藥后，小鼠的肝糖原含量分別為（14.49±1.65）和（14.88±1.57）mg·g-1，顯著長于空白組的（12.61±1.69）mg·g-1（＜0.05），生品中多糖類成分給藥后的小鼠肝糖原含量比炮制組多2.7%，差異顯著（＜0.05）；比空白組多18.0%，差異性達到極顯著（＜0.01）。

表1 多花黃精炮制品與生品中多糖類成分的抗運動疲勞效果比較

注：*和**分別為0.05及0.01水平上的顯著性差異。下同。

表2 多花黃精炮制品與生品中皂苷類成分的抗運動疲勞效果比較

多花黃精炮制品、生品中的多糖類成分連續(xù)給藥30 d后，與空白組相比，小鼠血清中的LA含量有一定降低、肌糖原含量及LDH活性有一定升高，但不具有統(tǒng)計學意義，兩組之間差異也不顯著（＞0.05）。

2.2 多花黃精炮制品與生品中皂苷類成分的抗運動疲勞效果比較

由表2可知，多花黃精生品中皂苷類成分給藥30 d后，小鼠的負重游泳時間為（13.89±1.41）min，比空白組的（12.26±1.84）min多13.3%，差異達到顯著（＜0.05）。炮制品中皂苷類成分給藥后，小鼠的負重游泳時間與空白組、生品組相比，差異不顯著（＞0.05）。

多花黃精炮制品、生品中的皂苷類成分連續(xù)給藥30 d后，與空白組相比，小鼠的耐缺氧時間、LDH活性、肝糖原含量有一定的升高，肌糖原含量有一定的降低，但不具有統(tǒng)計學意義，兩組之間差異也不顯著（＞0.05）。

表3 多花黃精炮制品與生品中黃酮類成分的抗運動疲勞效果比較

表 4 多花黃精炮制品中多糖類、皂苷類、黃酮類成分的抗運動疲勞效果比較

表5 多花黃精生品中多糖類、皂苷類、黃酮類成分的抗運動疲勞效果比較

2.3 多花黃精炮制品與生品中黃酮類成分的抗運動疲勞效果比較

由表3可知，多花黃精炮制品、生品中黃酮類成分連續(xù)給藥30 d后，與空白組相比，小鼠的負重游泳時間、耐缺氧時間、LDH活性、肝糖原含量、肌糖原含量均有一定的升高，肌糖原含量有一定的降低，但不具有統(tǒng)計學意義，兩組之間差異也不顯著。

2.4 多花黃精炮制品中多糖類、皂苷類、黃酮類成分的抗運動疲勞效果比較

由表4可知，多花黃精炮制品中多糖類成分連續(xù)給藥30 d后，小鼠的負重游泳時間、耐缺氧時間及肝糖原含量顯著高于皂苷類成分、黃酮類成分及空白組（＜0.05），但LA含量、LDH活性及肌糖原含量差異不顯著（＞0.05）。與空白組相比，皂苷類成分、黃酮類成分給藥后的小鼠負重游泳時間、耐缺氧時間、LA含量、LDH活性、肝糖原含量、肌糖原含量不具有統(tǒng)計學意義，兩組之間差異也不顯著（＞0.05）。

2.5 多花黃精生品中多糖類、皂苷類、黃酮類成分的抗運動疲勞效果比較

由表5可知，多花黃精生品中多糖類成分連續(xù)給藥30 d后，小鼠的負重游泳時間比黃酮組多6.7%，比空白組多21.3%，差異均達到極顯著（＜0.01）；小鼠的耐缺氧時間及肝糖原含量均極顯著地高于黃酮類成分、皂苷類成分及空白組（＜0.01），但LA含量、LDH活性及肌糖原含量差異不顯著（＞0.05）。皂苷類成分給藥后的小鼠負重游泳時間顯著高于空白組及黃酮組，差異顯著（＜0.05），但耐缺氧時間、LA含量、LDH活性、肝糖原含量、肌糖原含量不具有統(tǒng)計學意義。與空白組相比，黃酮類成分給藥后的小鼠負重游泳時間、耐缺氧時間、LA含量、LDH活性、肝糖原含量和肌糖原含量不具有統(tǒng)計學意義。

3 討論與結(jié)論

黃精化學成分多樣，主要有甾體皂苷類、黃酮類、苯丙素類、生物堿類、多糖等成分，其中多糖是黃精的主要化學成分之一，也是黃精藥材及飲片法定質(zhì)量控制成分。依據(jù)文獻報道，黃精中抗疲勞的主要有效成分是黃精多糖，總黃酮和總皂苷也有一定作用，其他成分未見有抗疲勞作用的相關報道。本實驗對多花黃精炮制品與生品中的多糖類成分、皂苷類成分、黃酮類成分進行了提取、純化，含量測定結(jié)果表明主成分純度均超過60%，多糖類成分中的其他成分為生物堿、維生素、微量元素、黏液質(zhì)（在黃精上未見有抗疲勞作用的相關報道）等，而皂苷類成分、黃酮類成分中的其他成分可互相包含，但含量較低，對整體提取物的抗疲勞作用趨勢及程度，影響較小。

（宋）唐慎微撰《證類本草》（1108年）記載：“黃精，補五勞七傷，助筋骨，止饑，耐寒暑，益脾胃，潤心肺。單服九蒸九曝，食之駐顏，入藥生用”。本實驗發(fā)現(xiàn)多花黃精炮制品中多糖類成分在提高小鼠負重游泳時間、耐缺氧時間及肝糖原含量上的效果低于生品，這可能與多花黃精炮制品多糖類成分的含量低于生品有關。另外，本實驗發(fā)現(xiàn)多花黃精生品中皂苷類成分在提高小鼠負重游泳時間上表現(xiàn)出抗運動疲勞活性，而炮制品與生品的黃酮類成分在本實驗條件下均未表現(xiàn)出抗運動疲勞活性，說明皂苷類成分也可能為多花黃精的抗運動疲勞活性物質(zhì)。

糖原是機體最重要的儲能物質(zhì)，肝糖原的主要作用是維持血糖的相對穩(wěn)定，隨著運動時間的延長，血糖水平開始下降，肝糖原分解作用增加。肌糖原不能直接分解成葡萄糖，須先分解產(chǎn)生乳酸，經(jīng)血液循環(huán)到肝臟，再在肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)楦翁窃蚝铣蔀槠咸烟?。本實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)30 d的連續(xù)給藥后，與空白組相比，多花黃精炮制品與生品中多糖類成分提取物均可顯著提高小鼠肝糖原含量（＜0.05），而對肌糖原含量的影響不具有統(tǒng)計學意義，說明小鼠負重游泳時間及抗缺氧時間的延長可能與肝糖原含量的提高有關，這與劉詩瓊等[10]認為黃精多糖可提高肝糖原和肌糖原含量的研究結(jié)果不同，原因有待進一步研究。

LDH是糖酵解過程中一種重要的酶，促進丙酮酸氧化還原生成 LA，用于評價機體疲勞損傷后程度。當劇烈運動程度超過有氧運動時，氧氣供應不足，糖類物質(zhì)無氧呼吸產(chǎn)生大量乳酸，不能在短時間內(nèi)進一步分解為水和二氧化碳，會引起血液及肌肉pH值的下降，從而產(chǎn)生疲勞[11-12]。本實驗發(fā)現(xiàn)多花黃精炮制品與生品的多糖類成分、皂苷類成分、黃酮類成分在經(jīng)30 d的連續(xù)給藥后，與空白組相比，小鼠血清中LA含量、LDH活性未發(fā)生明顯變化，這與陳靚雯等[13]認為古法炮制黃精多糖提取液可以降低游泳后小鼠血乳酸水平并加快其降解的研究結(jié)果不同，這可能與炮制方法的不同有關。

本實驗通過小鼠負重游泳實驗、耐缺氧實驗以及對相應生化指標的測定，對比研究了多花黃精炮制品與生品中多糖類成分、皂苷類成分和黃酮類成分提取物的抗運動疲勞作用。結(jié)果表明多花黃精炮制品中多糖類成分為主要抗運動疲勞活性物質(zhì)；生品中多糖類成分、皂苷類成分為主要抗運動疲勞活性物質(zhì)，生品中多糖類成分的抗運動疲勞活性強于炮制品。

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Comparative study on anti-exercise fatigue effects of different extracts from raw materials ofHua and its processed products

DU Xiaoqin1, LIANG Zhengjie1, XIA Yan1, ZHANG Xiaoqin1, ZHANG Wanchao1, HAN Jinlong2, WU Zhongbao1

(1. Bio-resource Research and Utilization Joint Key Laboratory of Sichuan and Chongqing, Chongqing Institute of Medical Planting Material, Nanchuan 408435; 2. Institute of Agro-Food Science and Technology, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100)

The anti-exercise fatigue effects of polysaccharides, saponins and flavonoids of raw materials ofHua and its processed products were compared. The mice were randomly divided into 7 groups, i.e. the control group, polysaccharide group, saponin group and flavonoid group from raw materials ofHua and its processed products, respectively. After 30 days of continuous gavage, the mice were tested for swimming time under load, hypoxia tolerance time, lactic acid (LA) content, lactate dehydrogenase (LDH) activity, liver glycogen content and muscle glycogen content. The results indicated that polysaccharides in the processed products ofHua were the active substances against exercise fatigue. Polysaccharides and saponins from raw materials ofHua were the active substances against exercise fatigue, among which, polysaccharides were significantly higher than those in the control group in improving swimming time, hypoxia tolerance time and liver glycogen content (< 0.01). Compared with the control group, there were no statistically significant differences in LA content, LDH activity and muscle glycogen content. In conclusion, polysaccharides ofHua are the main active substances against exercise fatigue, which have stronger activity in raw materials than its processed products.

Hua; processed products; raw materials; polysaccharides; exercise fatigue

S567.099

A

1672-352X (2021)01-0026-05

10.13610/j.cnki.1672-352x.20210319.015

2021-3-23 10:12:58

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20210319.1543.030.html

2020-05-09

重慶市科技局項目（19KF10-2012），重慶市科技局技術創(chuàng)新與應用發(fā)展項目（cstc2019jscx-lyjsA0043）和山東省重點研發(fā)計劃（魯渝科技協(xié)作）項目（2019LYXZ022）共同資助。

杜小琴，助理研究員。E-mail：duxiaoqin1814@sina.com

吳中寶，副主任中藥師。E-mail：wuzhognbao7788@sina.com