閆慧清，敖選真，劉 露，周 琴，孫貴連，黃 絨

小立碗蘚基因敲除載體的構(gòu)建及功能研究

閆慧清，敖選真，劉 露，周 琴，孫貴連，黃 絨

(貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025)

(Lateral organ boundaries domain)是植物中特有的基因家族。前期研究發(fā)現(xiàn)灰霉菌處理小立碗蘚導(dǎo)致配子體中的上調(diào)表達(dá)，但的功能尚不明確。因此提取小立碗蘚DNA，PCR擴(kuò)增基因的上下游片段，依次插入PTN182載體，利用同源重組原理構(gòu)建敲除表達(dá)載體，酶切和測序驗(yàn)證插入序列的正確性。通過工作濃度為20%的PGE 6000介導(dǎo)小立碗蘚原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，篩選鑒定得到敲除后的突變體植株，觀察到敲除后小立碗蘚不形成莖葉體結(jié)構(gòu)且配子體成絲狀。結(jié)果為深入探究在小立碗蘚的形態(tài)建成調(diào)控病原菌侵染的抗性作用奠定基礎(chǔ)。

基因；載體構(gòu)建；小立碗蘚；配子體

基因家族是一類在植物中特有的基因家族，參與高等植物側(cè)生器官的發(fā)育，對側(cè)生器官邊界的建成有一定作用，影響地上、地下器官的形成與發(fā)育，其家族的普遍功能可能是參與側(cè)生器官近遠(yuǎn)軸極性的建立[1]。研究發(fā)現(xiàn)該基因家族還能參與植物體內(nèi)激素積累和植物花青素等，與植物非生物脅迫以及病原菌抗性相關(guān)[2-3]。Shuai等利用從擬南芥（）中發(fā)現(xiàn)一個植物特有的在側(cè)生器官近軸端基部中表達(dá)的新基因，在擬南芥基因數(shù)據(jù)庫找到的基因家族共有42個[4]。其編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物中都包含著一段約有100個氨基酸殘基且與基因相同的LOB保守結(jié)構(gòu)域。

LBD蛋白由氨基端的LOB結(jié)構(gòu)域和羧基端的可變C末端組成[5]。LOB結(jié)構(gòu)域包含一個典型的由4個保守半胱氨酸殘基組成的CX2CX6CX3C (C和X分別代表半胱氨酸和非保守的氨基酸殘基)基序和一個保守的甘氨酸殘基[6]。根據(jù)LOB結(jié)構(gòu)域中亮氨酸拉鏈類似基序的存在與否，將基因歸為兩類：第一類是含有完整亮氨酸拉鏈基序的蛋白結(jié)構(gòu)域 (class I)；第二類是缺失亮氨酸拉鏈基序的蛋白結(jié)構(gòu)域(class II)，如圖1所示。

圖 1 LBD的兩類不同結(jié)構(gòu)

Figure 1 Schematic representation of two types of LBDs

前人研究表明，在擬南芥[1]、小麥[7]和玉米[8]等幾類植物中，基因參與側(cè)生分生組織的發(fā)育，調(diào)控植物發(fā)育[9]。此外，參與開花植物的非生物脅迫和生物脅迫反應(yīng)。葡萄在鹽脅迫、冷害、水分脅迫和ABA處理下上調(diào)表達(dá)[10]。香蕉果實(shí)中，在茉莉酸甲酯和冷害處理下可誘導(dǎo)的表達(dá)[11]。利用轉(zhuǎn)錄組和代謝組測定不同成熟時(shí)期葡萄果實(shí)被灰霉菌侵染的數(shù)據(jù)中，大部分的參與灰霉菌侵染的早期反應(yīng)，尤其和都顯著性地上調(diào)表達(dá)[12]。在灰霉菌處理后，葡萄上調(diào)表達(dá)，且與編碼NBS-LRR和果膠酯酶的基因共表達(dá)，而后兩者分別參與病原體的識別和細(xì)胞壁的修飾[12]。在由黃單胞菌引起的柑橘潰瘍病中，發(fā)現(xiàn)CsLBD1能夠調(diào)控植物的抗性反應(yīng)。有研究表明，擬南芥被壞死型的灰霉菌侵染后，Class II AtLBD被誘導(dǎo)產(chǎn)生[13]。這些揭示了LBD在有花植物防衛(wèi)機(jī)制中的作用?；虻膯幼雍信c非生物脅迫和茉莉酸甲酯反應(yīng)相關(guān)的順式元件。在擬南芥中，被發(fā)現(xiàn)在尖孢鐮刀菌（）對擬南芥根部的感染過程中起著負(fù)調(diào)控因子的作用，尖孢鐮刀菌通過誘導(dǎo)的表達(dá)抑制茉莉酮酸酯信號通路（JA signal pathway）中抗性基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)其對根部的侵染[14]。小立碗蘚（）是葫蘆蘚目葫蘆蘚科小立碗蘚屬的蘚類植物，是高等植物的低等類群。小立碗蘚擁有相對高的同源重組率，為10-3～10-4，即易與外源基因片段發(fā)生同源重組[15]。在植物系統(tǒng)進(jìn)化樹上，位于藻類，蕨類和種子植物都在苔蘚植物之間。小立碗蘚的基因組中有31個[16]，其中(GeneBank: XM_024534713)所編碼的蛋白質(zhì)屬于class I的LBD蛋白，前期RNA-seq實(shí)驗(yàn)及qRT-PCR分析結(jié)果表明，小立碗碗蘚接種灰霉菌后，在侵染12 h后表達(dá)量顯著性增加[16]。本實(shí)驗(yàn)利用同源重組原理構(gòu)建敲除載體，獲得基因敲除突變株，為今后研究在小立碗蘚中的功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料小立碗蘚（用于提取DNA，擴(kuò)增目的片段）及PTN182載體（5 006 bp，用于構(gòu)建基因敲除載體）均由首都師范大學(xué)何奕騉教授提供；DH5α感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室制備。DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、PremixTM、氨芐青霉素（Amp）、T4-DNA連接酶、1.5 K DNA Marker以及Ⅰ、RⅤ、Ⅰ和Ⅰ限制性內(nèi)切酶等均購置于大連寶生物有限公司；Plasmid Mini Kit I試劑盒，購于OMEGA Biotek公司；卡那霉素購于美國Sigma公司；酵母提取物和胰蛋白胨購于英國OXOID公司；氯化鈉、氫氧化鈉、葡萄糖及瓊脂等試劑購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；引物合成委托武漢金開瑞生物工程有限公司完成；測序委托上海生工生物工程股份有限公司完成。

表1 PpLBD20上、下游片段擴(kuò)增的引物序列

注：下劃線部分為酶切位點(diǎn)的堿基序列。

1.2 載體的構(gòu)建

1.2.1目的基因上、下游同源臂的獲得 用的cDNA序列在NCBI上進(jìn)行Blast查找對應(yīng)的DNA序列（GenBank: XM_024534713），得到全長為5 400 bp的DNA序列，隨機(jī)選取大小約1 000 bp的DNA序列的上、下游片段。利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)上、下游同源臂擴(kuò)增出引物，結(jié)合PTN182載體的克隆位點(diǎn)選取酶切位點(diǎn)，計(jì)算GC含量（50%～55%）添加保護(hù)堿基。最終，以Ⅰ和RⅤ為上游臂酶切位點(diǎn)，以Ⅰ和Ⅰ為下游臂酶切位點(diǎn)。設(shè)計(jì)的引物序列如表1所示，擴(kuò)增得到上游PCR產(chǎn)物大小為948 bp（），下游PCR產(chǎn)物大小為892 bp（），送武漢金開瑞生物工程公司合成上述引物。

1.2.2敲除載體的構(gòu)建 取10 μL含PTN182質(zhì)粒的大腸桿菌菌液加入50 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中恒溫37℃、220 r·min-1振蕩培養(yǎng)12～16 h。取5 mL含有菌液的培養(yǎng)液于圓底離心管，根據(jù)Plasmid Mini Kit I試劑盒說明書步驟提取PTN182質(zhì)粒。用Ⅰ、RⅤ對和PTN182載體進(jìn)行同步雙酶切。在37℃恒溫水浴鍋中酶切25 min后，1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，將滿足上游臂片段和PTN182酶切片段大小的目的片段按照膠回收試劑盒說明書步驟進(jìn)行膠回收。獲得的目的片段與PTN182酶切片段在16℃恒溫下連接12～16 h。將10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，繼而將轉(zhuǎn)化菌液涂板到含卡那霉素的LB培養(yǎng)平板上，37℃恒溫倒置過夜培養(yǎng)。挑取長出的單菌落至含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)12～16 h。后續(xù)進(jìn)行菌液PCR（引物為上游臂引物）、菌液質(zhì)粒提取并酶切驗(yàn)證。將菌液送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序。用Ⅰ、Ⅰ雙酶切和-PTN182質(zhì)粒，0.7%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證酶切結(jié)果，對-pMD19-T酶切片段和-PTN182酶切片段（約5 000 bp）進(jìn)行膠回收，恒溫16℃連接目的片段與-PTN182酶切片段12～16 h，連接液轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化菌液涂板于含卡那霉素的LB培養(yǎng)平板上培養(yǎng)，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)。對擴(kuò)大培養(yǎng)的單菌落進(jìn)行菌液PCR、質(zhì)粒提取并酶切等驗(yàn)證后（酶切所用的酶為Ⅰ和Ⅰ），將菌液送至上海生工生物工程股份有限公司完成測序。

1.3 原生質(zhì)體的制備

取培養(yǎng)大約5 d適量的小立碗蘚原絲體，加入1%崩潰酶溶液中，避光反應(yīng)30 min。150/300目的細(xì)胞篩進(jìn)行過濾，收集過濾后的原生質(zhì)體溶液，1 000 r·min-1，4 min，15℃離心，棄上清。收集等體積的8% D-甘露醇溶液重懸原生質(zhì)體2次，用500 μL MMM溶液重懸。取20 μL原生質(zhì)體溶液，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算原生質(zhì)體濃度。

1.4 PEG介導(dǎo)外源基因PpLBD20轉(zhuǎn)化和鑒定

將敲除載體菌液擴(kuò)大培養(yǎng)，用Plasmid Mini Kit I試劑盒（OMEGA，D6943-02）提取質(zhì)粒后，加入等體積的工作濃度為20%的PEG 6000溶液45 ℃熱激5 min，20 ℃恢復(fù)15 min。用ABCG稀釋轉(zhuǎn)化本混合液。每次300 μL，都靜置4 min，共5次。室溫下避光恢復(fù)1 h。1 500 r·min-1，3 min離心，收集原生質(zhì)體。用8 mL PRM/T培養(yǎng)基溶解。鋪板，加到120 mm PRM/B培養(yǎng)基培養(yǎng)，在40 μmol·m-2·s-1持續(xù)光照下25 ℃培養(yǎng)。分別選用G418-30 μg·mL-1和G418-60 μg·mL-1的濃度進(jìn)行抗性篩選，每次抗性篩選后，在不含抗性的培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)2周進(jìn)行下一次篩選。分子水平上的篩選過程：設(shè)計(jì)3對引物（分別為P1、P2和P3）進(jìn)行鑒定，引物序列如表2所示。

表2 PpLB20敲除后分子鑒定的引物序列

1.5 基因表達(dá)

用Primer Premier 5設(shè)計(jì)內(nèi)參基因的引物。提取總RNA：稱取150 mg的小立碗蘚到研缽中，用液氮充分研磨2～3次至材料成白色粉狀，加至1.5 mL RNAiso Plus的離心管中，靜置5 min后，于4℃、12 000 r·min-1離心5 min；收集上清，加入200 μL氯仿靜置5 min，于4℃、12 000 r·min-1離心5 min；再收集上清，加500 μL的異丙醇，靜置15 min后，于4℃、12 000 r·min-1離心5 min；棄上清，加1 mL 75%的乙醇，于4℃、7 500 r·min-1離心5 min；去上清干燥，加20 μL DEPC水溶解沉淀即可。將獲得的RNA利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京莊盟生物，Cat#ZR102)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，用SYBR?PremixTMⅡ試劑盒擴(kuò)增，條件為：95℃，5 s；60℃，34 s，共40個循環(huán)。目的基因表達(dá)量以內(nèi)參基因作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相對定量，相對表達(dá)量的計(jì)算用公式2-△△Ct法[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增獲得PpLBD20目的基因的上、下游同源臂

利用同源重組原理將敲除載體的片段替換基因組中目的基因的片段。首先通過PCR擴(kuò)增分別得到的上游同源臂片段和下游同源臂片段，將其命名為和，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的序列片段長度分別為948 bp和892 bp。經(jīng)0.7%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物，結(jié)果（圖2）顯示，除空白對照外，其余3條擴(kuò)增得到的條帶均略低于1 000 bp，該結(jié)果符合擴(kuò)增得到上游和下游目的片段的長度。

注：泳道1為空白對照，泳道2是上游的擴(kuò)增片段，泳道3和4為下游擴(kuò)增片段。

Figure 2 The amplified PCR products separated by agarose gel electrophoresis

2.2 PpLBD20敲除載體的構(gòu)建

將酶切引物經(jīng)PCR擴(kuò)增連接到上游臂目的片段，同時(shí)用Ⅰ和R V酶切PTN182載體。膠回收擴(kuò)增得到含有酶切片段的目的基因和PTN182酶切片段并過夜連接，進(jìn)行菌液PCR（引物為上游臂引物）。結(jié)果（圖3A）顯示，PCR擴(kuò)增得到的片段接近1 000 bp左右，與上游臂片段大小相似的片段。經(jīng)Ⅰ和R V酶切（圖3B），分別檢測得到的片段大小約為5 000 bp和1 000 bp大小。該片段大小符合PTN182載體片段大小(5 005 bp)和上游臂片段的大小，后經(jīng)測序驗(yàn)證得到-PTN182載體；再將酶切引物酶切經(jīng)PCR擴(kuò)增連接到下游臂目的片段，同時(shí)用Ⅰ和Ⅰ酶切-PTN182質(zhì)粒；再經(jīng)連接酶連接轉(zhuǎn)化后進(jìn)行檢測，提取重組質(zhì)粒。結(jié)果如圖3C所示：泳道1、2和3均為構(gòu)建后的重組載體，泳道4為Ⅰ和Ⅰ酶切后的產(chǎn)物，顯示為兩條帶，片段顯示接近于1 000 bp和5 000 bp，該片段大小符合下游臂()和- PTN182的大小。后經(jīng)菌液PCR和測序結(jié)果表明-PTN182-載體連接成功，敲除載體構(gòu)建完成。

2.3 敲除突變體小立碗蘚的鑒定

通過同源重組的原理，利用PEG 6000介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將的敲除載體轉(zhuǎn)化到小立碗蘚原生質(zhì)體中，轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體生長2周后狀態(tài)良好。結(jié)果如圖4(A-a)所示，經(jīng)過2次不同濃度的G418抗性篩選，得到轉(zhuǎn)化株圖4(A-b)。設(shè)計(jì)3段引物（命名為P1、P2和P3）來驗(yàn)證敲除載體是否轉(zhuǎn)入到小立碗蘚原生質(zhì)體中，其分布如圖4(B)所示。3條引物分別為：P1為上游臂和下游臂外小立碗蘚基因組的序列；P2的正向引物為上游臂的序列，反向引物為Ⅱ的序列；P3的正向引物為ⅡI的序列，反向引物為下游臂臂的序列。經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到的結(jié)果（圖4(C)）顯示：泳道1、2和3屬于野生型，野生型經(jīng)P1引物擴(kuò)增得到的片段接近5 000 bp左右，與基因大小相符；經(jīng)P2和P3擴(kuò)增后沒有檢測到片段。泳道4、5和6屬于敲除后植株，觀察得到經(jīng)P1擴(kuò)增得到的區(qū)間略高于野生型；經(jīng)P2和P3擴(kuò)增后沒有檢測到約為4 000 bp的片段，表明Ⅱ已替換掉的部分序列。

(A) PpLBD20L-PTN182菌液PCR驗(yàn)證；(B) PpLBD20L-PTN182酶切驗(yàn)證; (C) PpLBD20 L-PTN182-PpLBD20R載體質(zhì)粒提取構(gòu)建酶切驗(yàn)證。

Figure 3 The construction ofknockout-PTN182-vector

2.4 野生型和Pplbd20型基因表達(dá)及配子體觀察

進(jìn)一步提取野生型和敲除后的配子體總RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量。小立碗蘚野生型的表達(dá)量是敲除型配子體的12.35倍，從而表明基因敲除載體轉(zhuǎn)化成功并降低了的基因表達(dá)量（圖5A）。通過觀察野生型和突變體配子體（圖5B），可見小立碗蘚野生型的莖、葉結(jié)構(gòu)清晰且比較透明，葉片對稱結(jié)構(gòu)呈黃綠色，中間葉脈顏色比兩側(cè)葉片顏色深，葉片邊緣比較平滑無突起，葉片的表皮細(xì)胞為長方形狀并緊密排列；敲除的突變體無擬莖、葉，呈現(xiàn)樹枝狀結(jié)構(gòu)，整體呈現(xiàn)黃綠色，各分枝的長度不同，沒有規(guī)律。因此可以得出，影響配子體的形成。

(A) 原生質(zhì)體(a)和抗性篩選獲得的突變株(b)；(B) 3條引物設(shè)計(jì)區(qū)域分布；(C) 野生型和敲除配子體鑒定(1、2和3為野生型，4、5和6為敲除植株)。

Figure 4 The screening and molecular identification of knockoutgametocyte

圖 5 PpLBD20的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量(A)和野生型(a)和Pplbd20敲除(b)配子體表型(B)

Figure 5 Determination of thetranscriptional level (A) and the observation of wild type(a) and(b) plants(B)

3 討論與結(jié)論

基因敲除指通過在已知基因核酸序列上特定的可譯框的特定位點(diǎn)進(jìn)行缺失突變，獲得基因功能缺失突變體來研究其造成的表型效應(yīng)[18]，可以通過插入突變或特定序列被替換。同源重組將外源DNA序列整合到宿主基因組的特定位點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)基因敲除。由于小立碗蘚同源重組率較高，替換型載體是小立碗蘚基因敲除載體最常用的載體類型，構(gòu)建載體時(shí)，同源臂大小在1 000 bp左右時(shí)轉(zhuǎn)化率最高。在多種載體類型中，PTN182是小立碗蘚中常用的敲除載體[19]，PTN182質(zhì)粒是環(huán)狀DNA分子，可以在細(xì)菌細(xì)胞中獨(dú)立存活，而且PTN182質(zhì)粒含有Ⅱ基因，在大腸桿菌中表現(xiàn)為抗卡那霉素[20]，以此為標(biāo)記特點(diǎn)，可以快速有效得篩選得到的敲除載體。該載體已用于敲除小立碗蘚的肉桂醇脫氫酶1、香豆酸-3-羥基化酶基因和胼胝質(zhì)合酶的敲除[20-22]。

小立碗蘚敲除載體成功構(gòu)建及轉(zhuǎn)入小立碗蘚植株為研究在小立碗蘚的生長發(fā)育功能及是否參與生物脅迫等基因功能建立基礎(chǔ)。通過觀察敲除小立碗蘚的配子體，發(fā)現(xiàn)莖葉體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，配子體形成絲狀，其不能夠影響側(cè)生細(xì)胞的分化，導(dǎo)致原生質(zhì)體的細(xì)胞只能沿著單一方向生長。已發(fā)現(xiàn)玉米調(diào)控胚生根和氣生根的發(fā)育，影響側(cè)生器官的發(fā)育[23-24]，推測在小立碗蘚的側(cè)生器官的分化和形態(tài)發(fā)育中起作用。前人研究發(fā)現(xiàn)LBD參與維管束植物的抗病性。因此可以利用病原菌處理敲除的小立碗蘚配子體，檢測相關(guān)防衛(wèi)基因的變化，或者構(gòu)建的超表達(dá)植株，通過病原菌侵染后計(jì)算菌絲侵染率進(jìn)一步驗(yàn)證在早期陸生植物種的抗病作用。本文通過構(gòu)建敲除載體并成功轉(zhuǎn)化小立碗蘚的原生質(zhì)體對研究基因功能以及研究小立碗蘚防御機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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Construction and protoplast transformation ofknockout vector

YAN Huiqing, AO Xuanzhen, LIU Lu, ZHOU Qin, SUN Guilian, HUANG Rong

(School of Life Sciences, Guizhou Normal University, Guiyang 550025)

Lateral organ boundaries domain () is a kind of the plant-specific gene family. Previously, we identified thatwas significantly induced inwithinfection, but the function of theis still not known. Here, we extracted the genomic DNA from, and amplified the upstream and downstream homologous fragments ofby PCR and respectively inserted into the PTN182 vector. The knockout vector was constructed using homologous recombination and was verified by enzyme digestion and sequencing. The constructed vector was transformed into protoplast by addition of polyethylene glycol 6000 with the concentration of 20%, and the transformants were selected and identified. We observed that the knockoutgametocyte did not show the leaf-like structure and formed the filamentous branches. The current finding will facilitate to further explore thein regulating.resistance to.

; vector construction;;gametocyte

Q782

A

1672-352X (2021)01-0015-06

10.13610/j.cnki.1672-352x.20210319.025

2021-3-23 12:12:13

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20210319.1548.050.html

2020-05-26

國家自然科學(xué)基金(32060587)，貴州師范大學(xué)2017年度學(xué)術(shù)新苗培養(yǎng)及創(chuàng)新探索專項(xiàng)項(xiàng)目(黔科合平臺人才[2017]5726號)和貴州師范大學(xué)2020年全國大學(xué)生生命科學(xué)競賽計(jì)劃項(xiàng)目(55092)共同資助。

閆慧清，博士，副教授。E-mail：cheerfulness@126.com