李文云，羅 懌，王小柯，韓秀梅，鄭乾明，林 乾，蔡永強(qiáng)，李金強(qiáng)

（貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹科學(xué)研究所，貴陽 550006）

隨著果實(shí)的成熟，會(huì)產(chǎn)生大量的揮發(fā)性物質(zhì)，從而賦予果實(shí)獨(dú)特怡人的風(fēng)味。雖然成熟果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)占果實(shí)總重的比率不足1%，但這些揮發(fā)性物質(zhì)不僅是果實(shí)品質(zhì)的重要組成部分，還成為影響消費(fèi)者購買習(xí)慣的重要因素[1-2]。目前，已鑒定的植物揮發(fā)性物質(zhì)超過23 000 種，以柑橘為原材料提取的精油具有寧神、止咳、消炎和清除自由基等多種功效，在食品、藥品、化妝品等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用[3-4]。柑橘中揮發(fā)性物質(zhì)種類主要包括單萜、倍半萜、萜類衍生物、酮、醛、酸、酯等，其中大部分為萜類，約占總揮發(fā)性物質(zhì)含量的80%以上[5]。由于品種類型、成熟度、氣候條件和栽培措施的差異，不同柑橘品種揮發(fā)性物質(zhì)組成和含量存在較大的差異[6]。

‘利王柚’原產(chǎn)于貴州省銅仁市碧江區(qū)和平鎮(zhèn)利王村，是由地方品種‘利王白柚’芽變選種得到的，其果肉呈現(xiàn)誘人的粉紅色，口感酸甜，香味較‘利王白柚’濃郁[7-8]。本研究利用GC-MS 檢測(cè)了‘利王柚’‘利王白柚’和‘金錢橘’成熟果實(shí)黃皮層揮發(fā)性物質(zhì)組成，比較了揮發(fā)性物質(zhì)成分和含量特征，以期為貴州省地方特色種質(zhì)資源評(píng)價(jià)與利用及柑橘品質(zhì)改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為‘利王柚’‘利王白柚’和‘金錢橘’，采樣時(shí)選擇至少3 株生長(zhǎng)健壯、無病蟲害的植株，從樹冠外圍隨機(jī)采收15 個(gè)成熟果實(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室，用蒸餾水清洗果面，用手術(shù)刀小心分離果實(shí)最外層黃皮層，設(shè)置3 次重復(fù)，于液氮中速凍，隨后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存待測(cè)。

1.2 試驗(yàn)方法

參照Liu 等柑橘果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)提取方法[9]，稱取0.2 g 分離好的黃皮層，加液氮研磨至細(xì)粉末狀。加入500 μL 雙蒸水，充分混勻。再加入500 μL 含壬酸甲酯的MTBE 溶液，充分混勻。于4 ℃超聲提取30 min 后10 000 r/min 離心，吸取上清液，過濾膜至進(jìn)樣瓶中。利用 GC-MS 分離檢測(cè)揮發(fā)性物質(zhì)組分，進(jìn)樣體積設(shè)置為1 μL，儀器運(yùn)行參數(shù)參照Liu等方法[10]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

參照儀器自帶揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)據(jù)庫和物質(zhì)特征離子數(shù)據(jù)，對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性；參照已知濃度內(nèi)標(biāo)（壬酸甲酯）峰面積推算目標(biāo)物質(zhì)的濃度。利用 Microsoft Office Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和作圖。利用SPSS 進(jìn)行差異顯著性分析；對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行歸一化處理后，利用R 軟件OPLS-DA（正交偏最小二成判別分析）模型計(jì)算VIP 值（變量重要性投影）。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性物質(zhì)總離子流圖

‘利王柚’‘利王白柚’和‘金錢橘’3 份材料黃皮層揮發(fā)性物質(zhì)總離子流圖見圖1。根據(jù)揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)據(jù)庫、物質(zhì)特征離子碎片和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)濃度分別對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。從圖1 可以直觀地看出，3 份材料揮發(fā)性物質(zhì)出峰時(shí)間、峰高和峰面積存在較大差異。

圖1 ‘利王柚’‘利王白柚’和‘金錢橘’3 份材料揮發(fā)性物質(zhì)總離子流圖

2.2 揮發(fā)性物質(zhì)種類分析

檢測(cè)結(jié)果表明，共檢測(cè)到72 種揮發(fā)性物質(zhì)，主要包括單萜、倍半萜及其衍生物，以及醛、醇、酸、酯等（表1）。

表1 ‘利王柚’‘利王白柚’和‘金錢橘’3 份材料揮發(fā)性物質(zhì)含量

按揮發(fā)性物質(zhì)種類多少排序，依次為：倍半萜19 種、單萜12 種、單萜醇11 種、醛10 種、單萜醛4 種、單萜氧化物4 種、酯4 種、醇3 種、酸3種、單萜酮2 種。

續(xù)表1

3 份材料黃皮層揮發(fā)性物質(zhì)個(gè)數(shù)見表2，其中‘金錢橘’檢測(cè)到的揮發(fā)性物質(zhì)總數(shù)最多，共50個(gè)；其次是‘利王柚’，檢測(cè)到44 個(gè)；‘利王白柚’最少，僅檢測(cè)到42 個(gè)。

表2 ‘利王柚’‘利王白柚’和‘金錢橘’3 份材料檢測(cè)到的揮發(fā)性物質(zhì)個(gè)數(shù) 個(gè)

從3 份材料揮發(fā)性物質(zhì)占比來看（圖2），單萜類所占的比重最大，占62.33%～92.01%；單萜衍生物（單萜醛、單萜醇、單萜酮、單萜氧化物）占2.96%～28.80%；倍半萜占1.29%～5.50%；其他類揮發(fā)性物質(zhì)（醛、醇、酸、酯）僅占0.86%～4.76%。各類揮發(fā)性物質(zhì)按占比高低排序，‘利王柚’依次為單萜（62.33%）＞單萜衍生物（28.80%）＞倍半萜（5.50%）＞其他（3.36%），‘利王白柚’依次為單萜（85.89%）＞單萜衍生物（8.05%）＞其他（4.76%）＞倍半萜（1.29%），‘金錢橘’依次為單萜（92.01%）＞倍半萜（4.17%）＞單萜衍生物（2.96%）＞其他（0.86%）。

圖2 ‘利王柚’‘利王白柚’和‘金錢橘’3 份材料揮發(fā)性物質(zhì)占比情況

2.3 揮發(fā)性物質(zhì)含量比較分析

從檢測(cè)的揮發(fā)性物質(zhì)總含量來看（表1），‘金錢橘’最高，為4 098.87 μg/g，其次是‘利王柚’，為1 763.12 μg/g，‘利王白柚’最低，為852.42 μg/g，‘金錢橘’總含量分別是‘利王柚’和‘利王白柚’的2.32、4.81 倍。此外，單萜類、倍半萜類、單萜醇類和醛類4 類揮發(fā)性物質(zhì)總含量‘金錢橘’黃皮層中最高，其次是‘利王柚’和‘利王白柚’。3份材料含量最高的揮發(fā)性物質(zhì)均是單萜類，含量為734.73～3 771.80 μg/g，其中‘金錢橘’單萜總含量分別是‘利王柚’和‘利王白柚’的3.43、5.13 倍。倍半萜類是所檢測(cè)的物質(zhì)中種類最多的，倍半萜類總含量為11.04～171.11 μg/g，‘金錢橘’倍半萜總含量分別是‘利王白柚’和‘利王柚’的15.50、1.76 倍。從單萜衍生物來看，‘金錢橘’單萜醇總含量最高，為101.15 μg/g，分別是‘利王柚’和‘利王白柚’的1.36、5.81 倍。

單萜醛類、單萜酮類、單萜氧化物類、醇類、酸類和酯類6 類揮發(fā)性物質(zhì)總含量均在‘利王柚’中最高。這6 類揮發(fā)性物質(zhì)中，單萜酮類含量在‘利王柚’中最高。值得關(guān)注的是，柚類的特征香味物質(zhì)諾卡酮含量在‘利王柚’和‘利王白柚’中極顯著高于‘金錢橘’（P＜0.01），分別為406.38、39.19 μg/g，而‘金錢橘’中未檢測(cè)到該物質(zhì)。單萜醛類、單萜氧化物類、醇類、酸類和酯類5 類物質(zhì)雖然占總揮發(fā)性物質(zhì)的比率較低，但差異代謝物較多，其中‘金錢橘’未檢測(cè)到醇類。

2.4 差異化揮發(fā)性物質(zhì)

我們將3 份材料進(jìn)行兩兩比較篩選差異揮發(fā)性物質(zhì)，分組結(jié)果如下：‘利王柚’和‘利王白柚’、‘利王柚’和‘金錢橘’、‘利王白柚’和‘金錢橘’。樣品質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明（表3），利用OPLS-DA 模型建立的R2值和Q2值均較高，此模型用于分析差異化揮發(fā)性物質(zhì)的可信度較高。

表3 基于OPLS-DA 模型分組比較的R2和Q2值

從OPLS-DA 模型結(jié)果中，篩選VIP 值＞1 且差異顯著性P＜0.05 的揮發(fā)性物質(zhì)則為差異代謝物。3 份材料均可檢測(cè)到的揮發(fā)性物質(zhì)有α-蒎烯、β-蒎烯、崖柏烯、β-月桂烯、d-檸檬烯、吉瑪烯B、α-布藜烯、β-檸檬醛、α-檸檬醛、芳樟醇、α-萜品醇、順式-香葉醇、α-菖蒲烯醇、蓽澄茄醇、順式-芳樟醇氧化物、順式-檸檬烯氧化物、反式-檸檬烯氧化物、己醛、2-己烯醛等，共19 種。

兩兩差異化揮發(fā)性物質(zhì)比較分析結(jié)果表明（圖3，表4～表6），差異代謝物的個(gè)數(shù)與柑橘種類密切相關(guān)?！蹊帧汀醢阻帧町惔x物僅篩選到石竹烯、β-蒎烯、法呢醇等13 個(gè)差異代謝產(chǎn)物，其中上調(diào)12 個(gè)，下調(diào)1 個(gè)。而‘利王白柚’‘利王柚’與‘金錢橘’的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，篩選到的差異代謝物較多?！醢阻帧汀疱X橘’共篩選到α-水芹烯、二十二碳六烯酸、反式-2-十二醛等24 個(gè)差異代謝產(chǎn)物，其中上調(diào)7 個(gè)，下調(diào)17個(gè)；‘利王柚’和‘金錢橘’共篩選到諾卡酮、順式-香葉醇、反式-芳樟醇氧化物等27 個(gè)差異代謝產(chǎn)物，其中上調(diào)14 個(gè)，下調(diào)13 個(gè)。

圖3 3 份材料兩兩比較差異揮發(fā)性物質(zhì)個(gè)數(shù)

3 討論與結(jié)論

揮發(fā)性物質(zhì)是果實(shí)品質(zhì)的重要組成部分，除了參與植物防御和輔助傳粉外，提取的精油具有愉悅的香味，具有鎮(zhèn)定、安神等多種功效，在臨床、食品、美容等行業(yè)具有重要的應(yīng)用[11-12]。揮發(fā)性物質(zhì)由多種復(fù)雜的化合物質(zhì)組成，其代謝途徑涉及異戊二烯途徑、莽草酸途徑、脂肪酸裂解途徑等多個(gè)復(fù)雜的通路，涉及的物質(zhì)類型也較多[13]。本研究單萜類物質(zhì)在所有揮發(fā)性物質(zhì)中占比最大，這類物質(zhì)具有抗腫瘤、緩解糖尿病、抑菌等多種生物學(xué)活性[14-15]。3份材料中，‘金錢橘’所檢測(cè)到的揮發(fā)性物質(zhì)種類最多，含量最高；鐘煉軍等[4]對(duì)12 個(gè)柑橘揮發(fā)性物質(zhì)分析結(jié)果同樣表明，橘類種類最多，含量最高。

果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)因種類、品種、成熟度的不同而存在較大的差異，不同種類的柑橘都有其獨(dú)特的揮發(fā)性物質(zhì)構(gòu)成并賦予果實(shí)怡人的香氣[16]。蘆柑揮發(fā)性物質(zhì)以金合歡烯、正十一醛、紫蘇醛等為主，臍橙揮發(fā)性物質(zhì)以檜烯、月桂醛、3-蒈烯等為主[17]。

表4 ‘利王柚’和‘利王白柚’篩選的差異代謝物

表5 ‘利王白柚’和‘金錢橘’篩選的差異代謝物

表6 ‘利王柚’和‘金錢橘’篩選的差異代謝物

黃皮揮發(fā)性物質(zhì)以β-水芹烯、d-檸檬烯、石竹烯、α-水芹烯、α-金合歡烯等為主[18]。差異代謝物篩選結(jié)果表明，差異代謝物的個(gè)數(shù)與柑橘類型息息相關(guān)，種類差異越大差異代謝物的個(gè)數(shù)越多。因‘利王柚’是來源于‘利王白柚’的芽變，都屬于柚類，因此二者的揮發(fā)性物質(zhì)成分更為相近，僅篩選到13個(gè)差異物質(zhì)。而‘金錢橘’屬于寬皮柑橘類，‘利王白柚’和‘金錢橘’、‘利王柚’和‘金錢橘’分別篩選到24、27 個(gè)差異物質(zhì)，體現(xiàn)了不同種類柑橘積累揮發(fā)性物質(zhì)特征，從而賦予不同柑橘種類具有其獨(dú)特的香味。進(jìn)一步分析結(jié)果表明，‘利王柚’和‘利王白柚’親緣關(guān)系更近，同時(shí)也說明了利用揮發(fā)性物質(zhì)可以作為區(qū)分柑橘種類的方法之一。與Yu 等[19]研究結(jié)果一致，他們?cè)诶脫]發(fā)性物質(zhì)對(duì)橘、酸橙、血橙、溫州蜜柑、克里曼丁橘等進(jìn)行聚類分析時(shí)，能夠?qū)⒉煌N類的柑橘明顯區(qū)分開，并利用分子標(biāo)記驗(yàn)證了該結(jié)果，說明了基于揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)柑橘種類進(jìn)行分類的可靠性。