王 旭 毛湘冰 孫 銳 范祥奇 余 偉 豆屹松

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，動(dòng)物抗病營(yíng)養(yǎng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物抗病營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物抗病營(yíng)養(yǎng)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，成都611130)

作為畜牧生產(chǎn)大國(guó)，我國(guó)的飼料年總產(chǎn)量超2億t。由于受到光照、溫度、濕度、微生物等的影響，飼料往往會(huì)出現(xiàn)不同程度的氧化酸敗。而這些氧化酸敗飼糧會(huì)對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能、免疫能力和抗氧化能力造成很多不良影響。已有的大量研究表明，陳化飼料或飼糧中使用氧化油脂會(huì)降低動(dòng)物的生長(zhǎng)性能，并導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體的抗氧化能力受損，發(fā)生氧化應(yīng)激[1-4]。

果膠寡糖(pectic oligosaccharide,POS)是果膠經(jīng)過(guò)解聚作用后形成的一類(lèi)穩(wěn)定性好、耐熱性好及甜度低的糖類(lèi)化合物(主要成分是果膠二糖和果膠三糖)，但其并不能被人體和動(dòng)物的消化系統(tǒng)消化吸收，而是被腸道微生物利用進(jìn)而發(fā)揮作用[5]。近年來(lái)的研究表明，果膠寡糖具有諸多生理功能，如提高機(jī)體的抗氧化能力、改善腸道健康、調(diào)節(jié)脂類(lèi)代謝、提高機(jī)體免疫等[6-8]。針對(duì)其抗氧化能力的研究表明，果膠寡糖在體內(nèi)和體外均具有抗氧化作用。杜麗娟等[9]研究發(fā)現(xiàn)，山楂果膠寡糖對(duì)超氧自由基、羥自由基和二苯基苦基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基均表現(xiàn)出了很強(qiáng)的清除作用。本課題組前期試驗(yàn)也表明，飼糧添加蘋(píng)果果膠寡糖可顯著提高斷奶大鼠血清和斷奶仔豬腸道的抗氧化能力，并可緩解輪狀病毒攻毒誘導(dǎo)的仔豬腸道中抗氧化能力下降[7,10]。因此，本研究擬探討氧化飼糧中添加果膠寡糖是否可改善斷奶大鼠生長(zhǎng)性能、空腸和肝臟組織結(jié)構(gòu)及抗氧化能力，以期進(jìn)一步完善果膠寡糖提高機(jī)體抗逆性的可能機(jī)制，這將為果膠寡糖在畜禽生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

果膠寡糖：購(gòu)自河北某生物技術(shù)有限公司，由蘋(píng)果果膠通過(guò)酶解而來(lái)，有效成分(果膠二糖和果膠三糖)含量>30%，其他成分為輔料(玉米淀粉)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取18只健康的雄性3周齡斷奶Wistar大鼠(成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供)，按體重相近原則隨機(jī)分為3組，即對(duì)照組、氧化飼糧組和氧化飼糧補(bǔ)充果膠寡糖組，分別飼喂正常飼糧、氧化飼糧和添加200 mg/kg果膠寡糖的氧化飼糧，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只大鼠。試驗(yàn)期為21 d。試驗(yàn)在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所教學(xué)試驗(yàn)基地完成，試驗(yàn)大鼠采用單籠飼養(yǎng)，常規(guī)飼養(yǎng)管理，自然采光、通風(fēng)，自由采食、飲水。

試驗(yàn)基礎(chǔ)飼糧采用AIN-93G鼠純合飼糧標(biāo)準(zhǔn)，交由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。添加果膠寡糖的飼糧是以200 mg/kg果膠寡糖等量替代基礎(chǔ)飼糧中玉米淀粉配制而成。氧化飼糧和添加200 mg/kg果膠寡糖的氧化飼糧為2019年5月配制，常溫保存；正常飼糧為2020年5月配制。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 飼糧的氧化程度和黃曲霉毒素B1含量檢測(cè)

測(cè)定各組飼糧的酸價(jià)(acid value,AV)和過(guò)氧化物值(peroxide value,POV)，具體方法分別參考《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中酸價(jià)的測(cè)定》(GB 5009.229—2016)和《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過(guò)氧化值的測(cè)定》(GB 5009.227—2016)，用于表示飼糧的氧化程度；各組飼糧中黃曲霉毒素B1含量采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELIAS)方法進(jìn)行測(cè)定，試劑盒購(gòu)于百奧森(江蘇)食品安全科技有限公司。

1.3.2 果膠寡糖的體外抗氧化活性

果膠寡糖的總還原能力和對(duì)DPPH自由基清除率具體測(cè)定方法參考鐘偉萍[11]進(jìn)行。果膠寡糖對(duì)2,2′-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS+]自由基清除率采用上海碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定，具體測(cè)定方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。所有指標(biāo)均以維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照，并設(shè)空白對(duì)照。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items含量 Content營(yíng)養(yǎng)水平 Nutrient levels3)代謝能 Metabolizable energy/(MJ/kg)16.62粗蛋白質(zhì) Crude protein18.70纖維素 Fiber 5.00粗脂肪 Crude fat 7.00碳水化合物Carbohydrate 64.70

1.3.3 生長(zhǎng)性能

每日記錄采食量，于試驗(yàn)第1和22天對(duì)所有大鼠進(jìn)行空腹稱(chēng)重，用于計(jì)算體增重和采食量。

1.3.4 樣品采集

試驗(yàn)第22天稱(chēng)重后，對(duì)所有大鼠進(jìn)行乙醚麻醉，屠宰。迅速分離肝臟和空腸，于相同部位取組織塊于4%多聚甲醛中固定，并取組織塊分裝于凍存管中，液氮速凍后置于-80 ℃保存。

1.3.5 空腸和肝臟組織病理觀察

空腸和肝臟組織石蠟切片的制作參考Mao等[10]的方法進(jìn)行。對(duì)空腸和肝臟組織切片進(jìn)行照相，分析和記錄組織的病理變化。

1.3.6 空腸和肝臟抗氧化指標(biāo)

樣品前處理方法：取0.1 g左右(分析天平稱(chēng)量精確至0.001 g)空腸或肝臟組織樣品于2 mL的EP管中，按組織∶預(yù)冷生理鹽水=1∶9(質(zhì)量體積比)的比例加入預(yù)冷生理鹽水，在勻漿機(jī)中充分勻漿，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，吸取上清，用于抗氧化指標(biāo)的測(cè)定。

空腸和肝臟組織樣品中總蛋白與丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)以及總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定，具體測(cè)定方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有的數(shù)據(jù)采用Excel 2013進(jìn)行初步整理后，大鼠生長(zhǎng)性能和臟器抗氧化能力數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，處理間差異顯著時(shí)采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較；果膠寡糖與維生素C的體外抗氧化能力數(shù)據(jù)以每個(gè)劑量進(jìn)行t檢驗(yàn)。當(dāng)P<0.05時(shí)，表明差異顯著。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié) 果

2.1 飼糧的氧化程度和霉變情況

從表2中可以看出，與正常飼糧相比，經(jīng)過(guò)1年常溫存儲(chǔ)的氧化飼糧和添加200 mg/kg果膠寡糖的氧化飼糧的酸價(jià)和過(guò)氧化值均升高；而與氧化飼糧相比，添加200 mg/kg果膠寡糖的氧化飼糧的酸價(jià)和過(guò)氧化值均有不同程度的降低。關(guān)于飼糧的霉變情況，通過(guò)觀察，本試驗(yàn)開(kāi)始前各組飼糧(包括2個(gè)長(zhǎng)期存放的氧化飼糧)均未出現(xiàn)霉變；而各組飼糧中黃曲霉毒素B1含量的檢測(cè)結(jié)果顯示，其含量均低于1 μg/kg。這些可在一定程度上說(shuō)明本試驗(yàn)使用的3種飼糧并未發(fā)生霉變。

表2 3種飼糧中酸價(jià)和過(guò)氧化值

2.2 果膠寡糖的體外抗氧化活性

從圖1中可以看出，在體外研究中，維生素C表現(xiàn)出了極強(qiáng)的總還原能力、DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力，而果膠寡糖表現(xiàn)出的總還原能力和DPPH自由基清除能力并不明顯，僅表現(xiàn)出對(duì)ABTS+自由基具有一定的清除能力。

圖1 果膠寡糖的體外抗氧化活性

2.3 氧化飼糧中添加果膠寡糖對(duì)斷奶大鼠生長(zhǎng)性能的影響

從表3中可以看出，與對(duì)照組大鼠相比，氧化飼糧組大鼠的體增重和采食量顯著降低(P<0.05)；而添加果膠寡糖可以顯著緩解氧化飼糧引起的大鼠體增重和采食量下降(P<0.05)。

表3 氧化飼糧中添加果膠寡糖對(duì)斷奶大鼠生長(zhǎng)性能的影響

2.4 氧化飼糧中添加果膠寡糖對(duì)斷奶大鼠空腸與肝臟組織形態(tài)的影響

從圖2和圖3可以看出，對(duì)照組大鼠空腸和肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；氧化飼糧組大鼠空腸黏膜淺層可見(jiàn)黏膜上皮壞死，部分黏膜上皮脫落，腸腺內(nèi)可見(jiàn)病理性核分裂，黏膜下層可見(jiàn)輕度淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肝血竇淤血，中央靜脈輕度淤血；氧化飼糧補(bǔ)充果膠寡糖組大鼠空腸黏膜輕度壞死，肝臟中央靜脈輕度淤血。由此可見(jiàn)，氧化飼糧的飼喂會(huì)導(dǎo)致空腸和肝臟嚴(yán)重的病理變化，而果膠寡糖的添加可在一定程度上緩解空腸和肝臟病變的發(fā)生。

A:對(duì)照組；B:氧化飼糧組；C:氧化飼糧補(bǔ)充果膠寡糖組。表3同。

圖3 大鼠肝臟組織形態(tài)

2.5 氧化飼糧中添加果膠寡糖對(duì)斷奶大鼠肝臟和空腸抗氧化指標(biāo)的影響

從表4中可以看出，與對(duì)照組大鼠相比，氧化飼糧組大鼠空腸和肝臟中T-SOD、GSH-Px活性和T-AOC顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)；果膠寡糖的添加顯著緩解了氧化飼糧導(dǎo)致大鼠空腸和肝臟中T-AOC和T-SOD活性的下降及MDA含量的上升(P<0.05)，但對(duì)GSH-Px活性無(wú)顯著影響(P>0.05)。

3 討 論

飼料氧化酸敗會(huì)產(chǎn)生酮、醛等有異味的化合物，造成飼料哈變，降低飼料適口性，影響采食量，嚴(yán)重的會(huì)造成動(dòng)物中毒，甚至死亡。大量研究發(fā)現(xiàn)，氧化飼糧不僅會(huì)降低動(dòng)物的生長(zhǎng)性能，同時(shí)還會(huì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體抗氧化性能、生物膜完整性以及機(jī)體免疫功能產(chǎn)生不良影響[12-15]。袁施彬等[2]研究發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬飼糧中添加氧化魚(yú)油顯著降低了肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)和GSH-Px活性，升高了MDA含量，且降低了斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能和養(yǎng)分利用率。本試驗(yàn)中，對(duì)斷奶大鼠飼喂長(zhǎng)期常溫存放的飼糧，且飼糧中酸價(jià)和過(guò)氧化值大幅提高(且已超過(guò)了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn))，用以模擬實(shí)際生產(chǎn)中氧化飼糧對(duì)動(dòng)物機(jī)體的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，飼喂斷奶大鼠氧化飼糧顯著降低了其采食量和體增重，導(dǎo)致了空腸和肝臟組織的病變，并顯著影響了大鼠空腸和肝臟的抗氧化能力，誘導(dǎo)了氧化應(yīng)激。這些結(jié)果與前人的相關(guān)研究結(jié)果[2,12-15]一致，因此，本試驗(yàn)成功構(gòu)建了飼喂氧化飼糧損傷大鼠生長(zhǎng)和健康的模型。

表4 氧化飼糧中添加果膠寡糖對(duì)斷奶大鼠肝臟和空腸抗氧化指標(biāo)的影響

近年來(lái)的大量研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加果膠寡糖可提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加蘋(píng)果果膠寡糖可提高斷奶大鼠和斷奶仔豬(甚至是輪狀病毒攻毒仔豬)的生長(zhǎng)性能[7,10]。而本試驗(yàn)結(jié)果也表明，添加200 mg/kg的果膠寡糖能顯著緩解氧化飼糧誘導(dǎo)斷奶大鼠采食量和體增重的下降。機(jī)體生長(zhǎng)的變化與其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和利用有關(guān)，而腸道和肝臟是機(jī)體攝入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和代謝的主要器官，因此，本試驗(yàn)對(duì)大鼠的空腸和肝臟組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察。相關(guān)的結(jié)果表明，盡管飼喂添加200 mg/kg果膠寡糖的氧化飼糧的大鼠的空腸和肝臟組織仍存在一定病變，但與飼喂氧化飼糧的大鼠的空腸和肝臟組織相比，病變程度得到明顯緩解。

氧化還原狀態(tài)是機(jī)體(包括器官、組織和細(xì)胞)健康的重要基礎(chǔ)[16]。果膠寡糖具有提高機(jī)體抗氧化能力的作用。Li等[6]研究發(fā)現(xiàn)，高脂飼糧中山楂果膠寡糖的添加能顯著降低小鼠血清中MDA含量，提高血清中T-SOD活性。本課題組前期的研究表明，飼糧添加蘋(píng)果果膠寡糖可以提高大鼠血清抗氧化能力[7]，并緩解輪狀病毒攻毒誘導(dǎo)的仔豬腸道中抗氧化能力下降[10]。而本試驗(yàn)得到了類(lèi)似的結(jié)果，即果膠寡糖的添加顯著緩解了氧化飼糧對(duì)斷奶大鼠空腸和肝臟抗氧化能力(包括T-AOC、T-SOD活性和MDA含量)的負(fù)面影響。那么，可以推測(cè)，果膠寡糖改善氧化飼糧誘導(dǎo)空腸和肝臟組織損傷與其改善機(jī)體的抗氧化能力有關(guān)。

除了刺激機(jī)體提高抗氧化能力外，果膠寡糖本身也具有抗氧化活性。杜麗娟等[9]研究發(fā)現(xiàn)，山楂果膠寡糖對(duì)超氧自由基、羥自由基和DPPH自由基均表現(xiàn)出了很強(qiáng)的清除能力。丁鵬等[17]對(duì)黑莓果膠寡糖的研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)DPPH自由基和ABTS+自由基有很強(qiáng)的清除能力。本試驗(yàn)使用的果膠寡糖來(lái)源于蘋(píng)果，對(duì)其總還原能力及DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力的檢測(cè)結(jié)果表明，來(lái)源于蘋(píng)果的POS的總還原能力僅為相同劑量維生素C的5.88%～9.27%，對(duì)DPPH自由基的清除能力僅為相同劑量維生素C的3.13%～11.46%，對(duì)ABTS+自由基的清除能力為相同劑量維生素C的66.67%～81.72%。這些結(jié)果表明，本試驗(yàn)所用果膠寡糖(來(lái)源于蘋(píng)果)表現(xiàn)出了一定的抗氧化活性，但僅對(duì)ABTS+自由基表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力，其總還原能力和對(duì)DPPH自由基的清除能力較弱。與前人的研究結(jié)果存在差異的原因可能在于果膠寡糖的來(lái)源不同。根據(jù)果膠寡糖表現(xiàn)出的一定抗氧化活性，可以在一定程度上解釋添加果膠寡糖的氧化飼糧過(guò)氧化值和酸價(jià)低于氧化飼糧。鑒于前人的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，果膠寡糖還具有調(diào)節(jié)脂類(lèi)代謝、免疫等營(yíng)養(yǎng)生理功能，而這些功能是否在緩解氧化飼糧誘導(dǎo)機(jī)體損傷中發(fā)揮了作用，還有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

盡管未完全緩解氧化飼糧對(duì)大鼠的影響，但添加果膠寡糖在一定程度上改善了斷奶大鼠的生長(zhǎng)性能，而這可能源于果膠寡糖通過(guò)提高機(jī)體抗氧化能力改善氧化飼糧對(duì)大鼠肝臟和空腸組織結(jié)構(gòu)的破壞。